新型分子檢測(cè)技術(shù)在基層實(shí)驗(yàn)室診斷肺結(jié)核的效能分析

彭英 蘇欣 江琦 陳昌明 卞然 鐘聲 高謙 李發(fā)濱

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的嚴(yán)重危害人類健康的慢性傳染性疾病。我國(guó)是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家，根據(jù)《2017年全球結(jié)核病報(bào)告》[1]統(tǒng)計(jì)，2016年我國(guó)結(jié)核病年發(fā)病患者約90萬(wàn)例，位居全球第3位。結(jié)核分枝桿菌實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)是結(jié)核病診斷、治療方案制定和治療效果評(píng)估的重要依據(jù)。涂片鏡檢、固體培養(yǎng)和傳統(tǒng)藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)仍然是目前常用的細(xì)菌學(xué)診斷工具。涂片鏡檢方法的敏感度低，固體培養(yǎng)具有較高的敏感度，但是至少需要3～8周的時(shí)間，耗時(shí)較長(zhǎng)，均難以實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)核病患者的早期診斷和治療[2]。因此，亟需一種更快速和更可靠的實(shí)驗(yàn)室診斷方法用以輔助臨床診斷，以便早期診斷結(jié)核病。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，近年來(lái)涌現(xiàn)出很多方法用于結(jié)核分枝桿菌的快速鑒定，如GeneXpert MTB/RIF(簡(jiǎn)稱“GeneXpert”)技術(shù)，因操作方便、報(bào)告快速(2 h)、敏感度和特異度較高，被世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦應(yīng)用于肺結(jié)核及肺外結(jié)核的實(shí)驗(yàn)室診斷[3]；但由于其使用成本較高，在國(guó)內(nèi)推廣受到限制。結(jié)核分枝桿菌-交叉引物核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(cross-priming amplification，CPA)是一種新型恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，除操作簡(jiǎn)單、報(bào)告快速(2 h)外，價(jià)格也合理，比較適宜基層實(shí)驗(yàn)室推廣[4]。為比較與評(píng)價(jià)上述2種分子檢測(cè)技術(shù)在基層實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的效能，本研究以改良羅氏固體培養(yǎng)基培養(yǎng)法(簡(jiǎn)稱“固體培養(yǎng)法”)為標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)GeneXpert、CPA檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的敏感度和特異度，探討其應(yīng)用價(jià)值。

資料和方法

一、患者來(lái)源及分組

連續(xù)收集黑龍江省五常市結(jié)核病防治所2014年4月至2017年7月初診肺結(jié)核可疑患者作為研究對(duì)象，采集其痰標(biāo)本分別進(jìn)行固體培養(yǎng)法與快速分子檢測(cè)(GeneXpert或CPA)。其中，2014年4月至2017年7月共797例患者(A組)只進(jìn)行GeneXpert檢測(cè)；2016年1月至2017年7月共517例(B組)患者只進(jìn)行CPA檢測(cè)；兩組患者的痰標(biāo)本均進(jìn)行了固體培養(yǎng)法檢測(cè)。

二、研究方法

1. 痰標(biāo)本培養(yǎng)：按照分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊(cè)中的標(biāo)準(zhǔn)化操作程序[5]執(zhí)行。堿處理簡(jiǎn)單法操作，加入4%氫氧化鈉溶液進(jìn)行前處理，然后接種于酸性改良羅氏培養(yǎng)基，在37 ℃ 條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

2. GeneXpert檢測(cè)：GeneXpert檢測(cè)儀及試劑盒由美國(guó)Cepheid公司生產(chǎn)。具體操作按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行：取1 ml前處理標(biāo)本，加入2倍于標(biāo)本體積的痰標(biāo)本處理液，渦旋振蕩器處理15～30 s，靜置15 min；吸取2 ml處理后標(biāo)本緩慢加入反應(yīng)盒，然后將反應(yīng)盒放入儀器進(jìn)行自動(dòng)化檢測(cè)；反應(yīng)結(jié)束后，在檢測(cè)系統(tǒng)中讀取測(cè)試結(jié)果。

3. CPA檢測(cè)：使用由杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的核酸提取試劑盒(注射器法)和結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)試劑盒(恒溫?cái)U(kuò)增-試紙條法)進(jìn)行檢測(cè)。按產(chǎn)品使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，用注射器提取菌株DNA加入裝有玻璃化試劑的反應(yīng)管中，依次加入復(fù)溶緩沖液、石蠟油與雙蒸水，混勻后63 ℃水浴1 h，進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增；將擴(kuò)增完成的反應(yīng)管放入核酸檢測(cè)裝置，15 min內(nèi)判定結(jié)果。檢測(cè)區(qū)(T)與質(zhì)控區(qū)(C)均顯現(xiàn)紅色條帶則檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，僅C區(qū)出現(xiàn)紅色條帶為陰性。C區(qū)和T區(qū)均無(wú)紅色條帶出現(xiàn)，則檢測(cè)無(wú)效，需重復(fù)檢測(cè)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)錄入Excel 2003軟件，采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算與分析。以固體培養(yǎng)法為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算GeneXpert、CPA檢測(cè)結(jié)果的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、一致率與Kappa值，Kappa≥0.75認(rèn)為兩者一致性較好。組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、患者痰標(biāo)本納入與陽(yáng)性檢出率

A組797例患者的痰標(biāo)本進(jìn)行GeneXpert檢測(cè)，排除5例“檢測(cè)無(wú)效”及5例培養(yǎng)污染，最終納入787例。其中，男519例(65.9%)，中位年齡53歲；復(fù)治患者占3.2%(25/787)。在787例患者痰標(biāo)本中，培養(yǎng)陽(yáng)性229例 (29.1%)，GeneXpert陽(yáng)性300例(38.1%)。

B組517例患者的痰標(biāo)本采用CPA檢測(cè)，排除6例“檢測(cè)無(wú)效”與10例培養(yǎng)污染，最終納入501例。其中，男342例(68.3%)，中位年齡54歲；復(fù)治患者占5.0%(25/501)。在501例患者痰標(biāo)本中，培養(yǎng)陽(yáng)性129例(25.7%)，CPA陽(yáng)性125例(25.0%)。

二、GeneXpert與固體培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果的比較

以固體培養(yǎng)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，GeneXpert的敏感度為99.1%(227/229)，特異度為86.9%(485/558)，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為75.7%(227/300)，陰性預(yù)測(cè)值為99.6%(485/487)；一致率為90.5%(712/787)，Kappa值=0.788，說(shuō)明兩者一致性較好(表1)。

三、CPA與固體培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果的比較

以固體培養(yǎng)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，CPA的敏感度為81.4%(105/129)，特異度為94.6%(352/372)，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為84.0%(105/125)，陰性預(yù)測(cè)值為93.6%(352/376)；一致率為91.2%(457/501)，Kappa值=0.768，兩者一致性較好(表2)。

四、兩種分子檢測(cè)技術(shù)的診斷效能比較

以固體培養(yǎng)為標(biāo)準(zhǔn)，CPA檢測(cè)的敏感度(81.4%)低于GeneXpert (99.1%，227/229)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=38.519,P=0.000)；CPA檢測(cè)的特異度(94.6%)高于GeneXpert (86.9%，485/558)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.727,P=0.001)。CPA、GeneXpert檢測(cè)結(jié)果與固體培養(yǎng)的一致率分別為91.2%、90.5%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.204,P=0.652)。

討 論

為驗(yàn)證兩種分子生物學(xué)快速檢測(cè)技術(shù)在縣級(jí)實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用效果，本研究先后對(duì)兩組不同時(shí)間段內(nèi)的初診疑似肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本分別進(jìn)行GeneXpert與CPA檢測(cè)，同時(shí)進(jìn)行固體培養(yǎng)檢測(cè)以評(píng)價(jià)兩種分子檢測(cè)技術(shù)的準(zhǔn)確性。

1. GeneXpert檢測(cè)技術(shù)的診斷效能分析： 本研究中，GeneXpert檢測(cè)的敏感度為99.1%，特異度為86.9%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為75.7%，陰性預(yù)測(cè)值為99.6%；與固體培養(yǎng)結(jié)果的一致率為90.5%，Kappa值=0.788，說(shuō)明兩者一致性較好。2010年多個(gè)國(guó)家對(duì)GeneXpert的驗(yàn)證評(píng)估結(jié)果顯示，該方法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的敏感度與特異度分別為96.0%與98.6%[6]。本研究中，GeneXpert檢測(cè)的特異度略低，僅86.9%；但這與國(guó)內(nèi)其他研究的檢測(cè)結(jié)果一致，如北京市昌平區(qū)應(yīng)用該方法檢測(cè)初診可疑患者的特異度為89.6%[7]。上述差異可能是由于國(guó)外研究以檢測(cè)敏感度更高的液體培養(yǎng)作為金標(biāo)準(zhǔn)，而國(guó)內(nèi)普遍應(yīng)用固體培養(yǎng)，出現(xiàn)菌量較低時(shí)培養(yǎng)陰性的情況；Zhao等[8]報(bào)道液體培養(yǎng)較固體培養(yǎng)可多檢出7.5%的陽(yáng)性患者。因而，可認(rèn)為GeneXpert更接近液體培養(yǎng)的結(jié)果，較固體培養(yǎng)可檢測(cè)出更多的病原學(xué)陽(yáng)性患者。

2.CPA檢測(cè)技術(shù)的診斷效能分析：本研究中，CPA檢測(cè)技術(shù)的敏感度為81.4%，特異度為94.6%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為84.0%，陰性預(yù)測(cè)值為93.6%。與固體培養(yǎng)結(jié)果比較，此方法的一致率為91.2%，Kappa值=0.768，說(shuō)明兩者一致性較好。國(guó)內(nèi)Ou等[9]在4個(gè)區(qū)(縣)實(shí)驗(yàn)室對(duì)CPA的評(píng)估顯示，其敏感度為78.1%～89.5%，特異度為95.8%～100.0%，與本研究結(jié)果一致。

表1 A組患者以固體培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)判斷GeneXpert檢測(cè)技術(shù)的診斷效能

注敏感度=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；一致率=(真陽(yáng)性例數(shù)+真陰性例數(shù))/總檢測(cè)例數(shù)×100%；Kappa=(Po-Pc)/(1-Pc)

表2 B組患者以固體培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)判斷CPA檢測(cè)技術(shù)的診斷效能

注計(jì)算公式同表1

3.兩種分子檢測(cè)技術(shù)的診斷效能比較：本研究中，CPA檢測(cè)的敏感度較GeneXpert低，而特異度高；但是兩種分子檢測(cè)方法與固體培養(yǎng)法的檢測(cè)結(jié)果一致率進(jìn)行比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(91.2% vs 90.5%，P=0.652)。河南朱巖昆等[10]、四川邱勇等[11]對(duì)患者標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行GeneXpert與CPA檢測(cè)，結(jié)果表明，CPA與GeneXpert檢測(cè)結(jié)果一致性較高，一致率均達(dá)97%以上。

4.兩種分子檢測(cè)技術(shù)的局限性與優(yōu)劣勢(shì)分析：在結(jié)核分枝桿菌的快速檢測(cè)方法中，GeneXpert在基層的應(yīng)用與推廣受到諸多限制，因而成本較低且一致性高的CPA檢測(cè)無(wú)疑是一種良好的替代實(shí)驗(yàn)。Trébucq等[12]報(bào)道，GeneXpert技術(shù)的設(shè)備價(jià)格較高，是妨礙其臨床應(yīng)用的關(guān)鍵因素。GeneXpert試驗(yàn)的局限性在于每批次檢測(cè)時(shí)受儀器模塊的限制，檢測(cè)通量常常不能滿足臨床要求；另外，檢測(cè)費(fèi)用高也是限制其推廣的重要原因[13]；同時(shí)，GeneXpert試驗(yàn)要求操作環(huán)境保持一定的溫度與濕度，并且需要持續(xù)不斷的電源供應(yīng)，在某些情況下還需要采用空調(diào)來(lái)調(diào)節(jié)操作和存儲(chǔ)溫度，如此也阻礙了GeneXpert檢測(cè)技術(shù)的臨床應(yīng)用[14-15]。而CPA檢測(cè)技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)室的要求低，試劑可以在常溫下運(yùn)輸，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、快速且安全，技術(shù)員經(jīng)過(guò)1～2 d的培訓(xùn)就能夠獨(dú)立、熟練地開(kāi)展工作；且大多數(shù)操作者認(rèn)為，CPA檢測(cè)技術(shù)與傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)檢測(cè)(涂片和培養(yǎng))相比較，其操作更加容易、便捷，生物安全性更好，室內(nèi)質(zhì)控的可靠性和可操作性更強(qiáng)[16]。

CPA相對(duì)GeneXpert的劣勢(shì)在于其缺少對(duì)結(jié)核分枝桿菌的耐藥性檢測(cè)。然而，全國(guó)結(jié)核病耐藥基線調(diào)查報(bào)告表明，涂陽(yáng)肺結(jié)核患者的臨床結(jié)核分枝桿菌分離株對(duì)利福平的耐藥率為9.63%[17]；WHO建議應(yīng)將GeneXpert檢測(cè)應(yīng)用于耐藥率>20%的高危人群，如持續(xù)涂陽(yáng)患者、耐多藥患者密切接觸者等，如此診斷患者是否對(duì)利福平耐藥將更有意義；而在對(duì)利福平耐藥患病率較低的人群中，耐藥性檢測(cè)可使用傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)或其他分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，以增加成本效益[18]。

綜上所述，本研究認(rèn)為CPA快速診斷方法操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、成本低，無(wú)需檢測(cè)儀器，能夠快速檢測(cè)出痰標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌，在肺結(jié)核臨床診斷中有較高的敏感度和特異度，并且與固體培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果的一致性較好，有助于早期、快速發(fā)現(xiàn)結(jié)核病患者，相對(duì)于GeneXpert檢測(cè)，更適于基層實(shí)驗(yàn)室對(duì)肺結(jié)核患者進(jìn)行早期診斷。