阿維菌素生物合成基因結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展

李淑煥 薄永恒

阿維菌素生物合成基因結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展

李淑煥 薄永恒*

（山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院 山東 濟(jì)南 250100）（山東省獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)所 山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東 濟(jì)南）

寄生蟲(chóng)病是動(dòng)物常見(jiàn)的疾病，對(duì)畜牧養(yǎng)殖造成比較大危害。每年，寄生蟲(chóng)感染動(dòng)物從而造成的社會(huì)損失超過(guò)30多億美元。從Fleming發(fā)現(xiàn)青霉素到現(xiàn)在，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)39000多種不同作用的抗生素。殺傷各種寄生蟲(chóng)的抗生素卻不是很多，其中大多數(shù)是作用于真菌和細(xì)菌的。可以殺死寄生蟲(chóng)的抗生素也就只有十幾種，因?yàn)榧纳x(chóng)和宿主之間對(duì)抗生素敏感性一般差別小，在實(shí)際應(yīng)用方面效果比較差。一般一種抗生素只能殺死一種或幾種寄生蟲(chóng)，他們的抗蟲(chóng)譜也比較窄。

阿維菌素是由阿維鏈霉菌分泌出的一種次級(jí)代謝產(chǎn)物，是迄今為止發(fā)現(xiàn)最有效的生物殺死寄生蟲(chóng)的藥物，是農(nóng)業(yè)部推薦的一種的高效低毒的獸用藥品，具有良好的應(yīng)用價(jià)值和廣闊的市場(chǎng)前景。目前，阿維鏈霉菌育種技術(shù)主要有自然選育、誘變育種、基因重組、代謝控制育種、基因工程育種等方法。本文主要從阿維菌素生物合成關(guān)鍵調(diào)控基因的研究進(jìn)行探討，為后期基因工程育種打造理論基礎(chǔ)。

1 阿維菌素生物合成基因結(jié)構(gòu)組成

（1）已知許多抗生素生物合成基因都是成簇排列的，阿維鏈霉菌也是如此。阿維鏈霉菌生物合成基因簇大約有90kb，這一部分是阿維鏈霉菌生物合成的關(guān)鍵點(diǎn)，其間82kb的連續(xù)區(qū)域被測(cè)通，從而獲得的區(qū)域的結(jié)構(gòu)如圖2所示。與已知的I型多功能聚酮合酶(PKS)的模塊(module)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，紅霉素[1-2]、苦霉素[3]、利福霉素[4]多功能PKS的編碼模塊結(jié)構(gòu)都比阿維鏈霉菌的要簡(jiǎn)單。這個(gè)區(qū)域有18個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)。在轉(zhuǎn)錄方向上，編碼利福霉素PKS的10個(gè)模塊和編碼紅霉素PKS模塊方向一致，而aveA1-aveA2和ave3-ave4兩部分組成了阿維鏈霉菌PKS的12個(gè)編碼模塊，但是有6個(gè)模塊與另外6個(gè)模塊的轉(zhuǎn)錄方向是相反的。其實(shí)西羅莫司的PKS的編碼模塊結(jié)構(gòu)也和它一樣的復(fù)雜，包含了按兩個(gè)方向轉(zhuǎn)錄的10個(gè)模塊和4個(gè)模塊[5]。（2）4個(gè)的閱讀框(open readi ng frame，ORF)是阿維菌素生物合成基因簇中最大特點(diǎn)，即aveA1、aveA2、aveA3和aveA4，他們連接后分成兩組且相反方向轉(zhuǎn)錄，即aveA1-aveA2和aveA3-aveA4。結(jié)構(gòu)中有4個(gè)多功能多肽AVES1(414kDa)、AVES2(666kDa)、AVES3(575 kDa)和AVES4(510kDa)，都是由PKS的基因編碼而來(lái)[6]。（3）現(xiàn)在報(bào)道的最復(fù)雜的多功能酶系統(tǒng)就是這個(gè)有55個(gè)催化區(qū)存在于這4個(gè)多功能多肽中。具體的情況是這樣，aveA 1和aveA 4各只編碼一個(gè)結(jié)構(gòu)域。首先是有把起始?；鶊F(tuán)加入PKS的作用的發(fā)現(xiàn)，就是AVES1的N-末端LD域被鑒定出來(lái)。其次，可以釋放PKS上合成的聚酮的結(jié)構(gòu)域被鑒定出來(lái)，就是AVES4的C-末端TE域，作用是，從而形成糖苷配基。在AVES中，每個(gè)模塊中都含有以下結(jié)構(gòu)域的組成之一：KS、AT和ACP；KS、AT、KR和ACP；KS、AT、DH、KR和ACP；所有的模塊都含有ACP、AT和KS結(jié)構(gòu)域。

2 阿維菌素生物合成關(guān)鍵基因

2.1 聚酮合成酶基因aveA I型PKS是合成糖苷配基也就是聚酮體合成酶的過(guò)程的特點(diǎn)，aveA是可以突變糖苷的，形成突變株，突變株是不產(chǎn)生抗生物，但可以使6，8a閉聯(lián)-6，8a脫氧-5-氧阿維菌素糖苷配基轉(zhuǎn)化成天然的阿維菌素。

2.2 糖基化酶基因aveB 實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明aveB突變株只能產(chǎn)阿維菌素配基，因此此突變會(huì)影響糖基化階段。推測(cè)糖苷配基糖基化轉(zhuǎn)移酶能把胸苷二磷酸齊墩果糖催化為齊墩果糖，然后把這個(gè)催化產(chǎn)物結(jié)合到阿維菌素糖苷配基上。

2.3 C22 - C23 脫水酶基因aveC aveC的位置是在4.9kb 片段BamHI上，和aveA2相鄰，轉(zhuǎn)錄方向和aveA2一致。文獻(xiàn)報(bào)道aveC的突變株只產(chǎn)生“2”型阿維菌素，因此aveC有可能是對(duì)于1組分來(lái)說(shuō)是正調(diào)控基因。研究證明阿維菌素“1”型組分與“2”型組分的不同之處僅在C22和C23鍵不一樣，組分“1”是雙鍵，而組分“2” 單鍵，且在C23位多一個(gè)羥基。而且“2”組分的前體也不是“1”組分，因?yàn)槊撍窃谔俏襞浠纬芍鞍l(fā)生，且C22-23脫水生成“1”組分。

2.4 C5-0-甲基轉(zhuǎn)移酶aveD 文獻(xiàn)報(bào)道突變aveD基因只產(chǎn)生阿維菌素B組分，是因?yàn)槿狈α税⒕S菌素C5-O-甲基轉(zhuǎn)移酶活性，是有效組分的負(fù)控基因。該基因能催化“B”組分反應(yīng)成為“A”組分。該基因可把來(lái)源于S-腺昔甲硫氨酸的甲基轉(zhuǎn)移到“B”組分C5羥基上而成為“A”組分和S-腺苷-L-高半胱氨酸。AveD的分子量為64kDa。由此可見(jiàn)“2”組分比“1”組分先反應(yīng)，Bla實(shí)際上沒(méi)有活性，沒(méi)必要測(cè)試。aveD位置是在3.4kb的片段BamHI上，在阿維菌素合成基因簇的左邊。文獻(xiàn)顯示C5-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的活性越大，阿維菌素的產(chǎn)量越多。通過(guò)Ikeda等研究人員測(cè)定了突變的高產(chǎn)菌株的效價(jià)，隨著阿維菌素產(chǎn)量的增加，這種酶的平均比活與最大比活性都在增加[7]。

2.5 正調(diào)節(jié)基因aveR 研究顯示aveR是能編碼的特異性正調(diào)控因子，其位置在aveF的下游。對(duì)其進(jìn)行序列分析，aveR的產(chǎn)物有一個(gè)螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋的結(jié)構(gòu)，這與其他正調(diào)控因子相似，也許有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。如果把a(bǔ)veR突變，阿維鏈霉菌就喪失了產(chǎn)抗的能力，當(dāng)然也不會(huì)形成阿維菌素糖昔配基。相反，把這個(gè)基因超強(qiáng)表達(dá)一下，這個(gè)突變菌的產(chǎn)抗能力就會(huì)顯著提高?，F(xiàn)在文獻(xiàn)中沒(méi)有對(duì)aveR的調(diào)控機(jī)制的描述，還有待研究[8]。

2.6 關(guān)鍵基因orfX Hwang Yong Soon等[9]在orfX的研究中發(fā)現(xiàn)了包含orfX基因的8.0kbDNA片段有提高變鉛青鏈霉菌中放線紫紅素作用。研究人員做了亞克隆實(shí)驗(yàn)，定位了一個(gè)最小片段，它能提高產(chǎn)抗的關(guān)鍵性的，再通過(guò)序列分析，發(fā)現(xiàn)了最小的片段包含兩個(gè)基因，orf41和orfX。通過(guò)多拷貝質(zhì)粒pIJ702與包含orf41和orfX的片段構(gòu)建游離表達(dá)的載體，并導(dǎo)入阿維鏈霉菌進(jìn)行表達(dá)，陽(yáng)性菌株產(chǎn)抗將得到顯著提高。為了觀察這個(gè)小基因的作用，用插入失活的載體，打斷菌株的基因，發(fā)現(xiàn)菌株的產(chǎn)抗能力降低。但是中斷株再次插入這2個(gè)基因片段，產(chǎn)抗能力也就恢復(fù)了。通過(guò)這2個(gè)結(jié)果顯示，在orfX的單獨(dú)影響下或由orf41和orfX共同影響下可以提高阿維菌素產(chǎn)量。

2.7 負(fù)調(diào)節(jié)基因aveR1、aveR2 Stutzman等人克隆了aveR1、aveR2兩個(gè)基因，前一個(gè)基因可以控制聚酮合成酶基因的表達(dá)，后一個(gè)可以控制阿維菌素合成酶基因的表達(dá)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)顯示：他們2個(gè)中的一個(gè)失活或兩個(gè)同時(shí)失活，都可以使阿維菌素產(chǎn)量大大提升。研究人員構(gòu)建了的替換載體，并進(jìn)行重組后，得到了缺失了aveR1、aveR2的突變株，測(cè)定效價(jià)后發(fā)現(xiàn)，突變株的產(chǎn)抗能力比原菌株提升了3.1~3.4倍[10]。

2.8 afsR2基因 afsR2基因放線紫紅素的表達(dá)有重要關(guān)系，首先是在S.lividans中發(fā)現(xiàn)。在天藍(lán)色鏈霉菌和灰色鏈霉菌中，AfKs/AfRs是一個(gè)雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)。自我磷酸化可以在細(xì)胞內(nèi)膜發(fā)生在絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。AfsR是一種可以和核酸結(jié)合的蛋白，在其啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合內(nèi)，啟動(dòng)afsS轉(zhuǎn)錄必須需要AfsR的ATPase的參與，因此它是一個(gè)非常特別的的轉(zhuǎn)錄因子[11]。 AfsR的ATPase活性和DNA結(jié)合活性是由絲氨酶、蘇氨酸殘基磷酸化來(lái)調(diào)節(jié)控制的。Lee等[11]通過(guò)sourthern雜交實(shí)驗(yàn)，在S.avermitilis克隆到afsR2的同源基因，并將afRs2基因以多拷貝的形式引入到S.avermitilis野生菌株，研究發(fā)現(xiàn)引入后avermectin的產(chǎn)量提高了2.3倍。

2.9 nsdA基因 nsdA基因全局負(fù)調(diào)控基因，最早是在天藍(lán)色鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)的。對(duì)天藍(lán)色鏈霉菌的抗生素的合成和產(chǎn)孢形態(tài)分化均有負(fù)調(diào)控作用[12]。有文獻(xiàn)報(bào)道SC7A1是文庫(kù)質(zhì)粒，陶美鳳等在沒(méi)有質(zhì)粒的天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)菌種中加入SC7A1后，菌落褶皺增加，產(chǎn)抗與孢子均產(chǎn)生的緩慢，推斷表型改變的原因是這個(gè)質(zhì)粒含有負(fù)調(diào)控基因。對(duì)SC7A1進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)它大約有40個(gè)基因，大小為46kb，通過(guò)亞克隆實(shí)驗(yàn)把前面的基因定位于oRF26，命名為ndsA(nagative regulator of streptoomyces differention)。nsdA基因中斷菌的許多產(chǎn)抗菌的產(chǎn)抗能力都增加，孢子量也是原始菌的兩倍?；騍AV2652是阿維鏈霉菌的中的一段，nsAd與之同源性達(dá)到86%，王茜等置換了阿維鏈霉菌中的基因SAV2652后，產(chǎn)抗能力提升了3.9倍。

2.10 I基因[13]因?yàn)榛駻trA和SAV4110(aveI)具有高度的同源性，所以有研究者考察了阿維鏈霉菌的aveI與天藍(lán)色鏈霉菌中的AtrA是否一樣具有促進(jìn)阿維菌素生物合成的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，aveI和AtrA作用一樣在生物合成中起了重要作用[14]。通過(guò)對(duì)阿維鏈霉菌野生菌的aveI基因敲除，產(chǎn)抗能力增加了16倍，說(shuō)明aveI在其生物合成過(guò)程中是一個(gè)負(fù)調(diào)控因子。

3 小結(jié)

目前，Merck公司對(duì)阿維菌素及其產(chǎn)生菌也進(jìn)行了大量的研究，對(duì)有關(guān)阿維菌素生物合成的基因已測(cè)序完成，并已克隆出全部相關(guān)基因簇，還對(duì)阿維菌素生產(chǎn)菌株的改造做了大量工作，獲得了只產(chǎn)某特定組分的菌株。例如，阿維菌素B1a 和B2a選擇性產(chǎn)出基因工程菌、阿維菌素B2a選擇性產(chǎn)出基因工程菌、阿維菌素B1單組份缺陷突變菌株；另外，通過(guò)改良菌種，使得阿維菌素產(chǎn)生菌種不產(chǎn)生一種有毒的物質(zhì)即寡霉素，從而減輕產(chǎn)品的毒性和提高產(chǎn)品的質(zhì)量。隨著對(duì)其基因簇的深入研究，利用阿維菌素基因工程育種手段，將大大提高阿維菌素的產(chǎn)量與質(zhì)量。

[1] Cortes J, Haydock SF, Robert GA, et al. An unusually large multifunctional polypeptide in the erythromycinproducing polyketide synthase of Saccharo polysporaery thraea.[J]. Nature, 1990, 348: 176

[2] Donadio S, Staver MJ, McAlpine JB, et al. Modular organization of genes required for complex polyketide biosynthesis. [J]. Science, 1991, 252: 675

[3] Xue Y, Zhao L, Liu H, et al. A gene cluster for macrolide antibiotic biosynthesis inStreptomyces venezuelae: architecture of metabolic diversity[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95: 12111

[4] August PR, Tang L, Yoon YJ, et al. Biosynthesis of the ansamycin antibiotic rifamycin: deductions from the molecular analysis of the biotynthetic gene cluster of Amycolatopsis mediterraneiS699. [J]. Chem Biol, 1998,5: 69.

[5] Molnár I, Aparicio JF, Haydock SF, et al. Organization of the biosynthetic gene cluster for rapamycin in Streptomyces hygroscopicus: analysis of gene flanking the polyketide synthase. [J].Gene, 1996, 169:1

[6] Ikeda H,Nonomiya T,Usami M,et al.Organization of the biosynthetic gene cluster for the polyketide anthelmintic macrolide avermectin in Streptomycetes avermitilis. Proc. Natl. Acad.Sci.USA,1999,96(17):9509-9514

[7] Ikeda H, Wang R-L,Ohta T,et al.Gene,1998,206:175~180

[8] Ikeda H, Takada Y, Pang C H,et al. Transposon mutagenesis by Tn4560 and applications with avermectin-producing Streptomyces avermitilis[J]. J Bacteriol, 1993, 175(7): 2077-2082.

[9] Hwang Y S，Kim E S，Biro S and Choi C Y.Cloning and analysis of a DNA fraglnent stulating avermectin Produetion in various StrePtomyees avennitilis strains.APPlied and Environmental Mierobiology，2003，69:1263-1269

[10] STUTZMAN-ENGWALL, etal. Streptomyces avermitilisre gulatory genes for increased avermectin production[P]. UnitedStates Patent6, 197, 5910619, 2001.

[11] Lee J Y，Hwang Y S，Kim S S，Kim E S，Choi C Y(2000)Effect of a global regulatory gene，asfR2，from Streptomyces lividans on avermectin Produetion in Streptomyces avermitilis.J Biosci Bioeng89: 602-605

[12] 應(yīng)新. 天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)中nsdA的發(fā)現(xiàn)和生物學(xué)功能探討[D].華中農(nóng)業(yè)大學(xué): 武漢, 2002.

[13] lei chen et al. Characterization of a negative regulator AveI for avermectin biosynthesisin Streptomyces avermitilis NRRL8165[J]. Appl Microbiol Biotechnol(2008)80: 277–286.

[14] Uguru GC,Stephens KE,Stead JA,Towle JE,Baumberg S, McDowall KJ.Transcriptional activation of the pathway-specific regulator of the actinorhodin biosynthetic genes in Streptomyces coelicolor. Mol Micro-biol2005, 58: 131-150.

2019–03–27）

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