靈芝孢子粉破壁技術(shù)、質(zhì)量分析與深加工相關(guān)研究進(jìn)展＊

馬藝沔，丁自勉＊＊，陳向東，蘭 進(jìn)，劉 陽，吳 茜

（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所 北京 100193；2.安徽省衡濟(jì)堂健康科技股份有限公司 合肥 230000）

靈芝，主要是指多孔菌科靈芝屬的赤芝Ganoderma lucidum (Leyss. ex Fr.) Karst.或紫芝Ganoderma sinense Zhao,Xu et Zhang 的干燥子實(shí)體，為《中華人民共和國藥典》所收錄。靈芝性味甘、平，歸心、肺、肝、腎經(jīng)，具有補(bǔ)氣安神、止咳平喘等功效[1]。野生赤芝或紫芝多腐生于櫟及其他闊葉樹的根部或枯干上，自然界十分稀少，無法滿足人們食藥需求。為了充分利用靈芝這一資源，中國從20世紀(jì)50年代開始進(jìn)行靈芝栽培研究并獲得成功。隨著靈芝栽培技術(shù)的不斷推廣，靈芝相關(guān)產(chǎn)品的研究不斷深入，并開發(fā)出了很多產(chǎn)品。靈芝孢子粉為靈芝人工栽培技術(shù)推廣過程中開發(fā)的一種靈芝深加工產(chǎn)品，主要來源于人工栽培赤芝在生長成熟后期，從菌褶中彈射出來的赤芝孢子。研究表明，靈芝孢子粉主要含有多糖類、三萜類、甾醇類和生物堿類等活性成分，具有抗癌、保肝、降血脂、降血糖、抗缺氧、抗炎、清除自由基以及免疫調(diào)節(jié)等多種藥理學(xué)作用，臨床可以用于肺癌、腸癌、心腦血管疾病等的輔助治療[2-5]。靈芝孢子細(xì)胞壁極為堅(jiān)固，由幾丁質(zhì)、纖維素和木質(zhì)素等物質(zhì)組成，直接服用很難被胃酸消化。但是，靈芝孢子外孢壁有很多小孔，這些小孔降低了孢壁強(qiáng)度，使得靈芝孢子的破壁成為可能。經(jīng)過破壁以后的靈芝孢子粉，有效成分吸收利用率顯著提高，免疫活性顯著增強(qiáng)[6,7]。在實(shí)際應(yīng)用中，將靈芝孢子粉破壁后食用，或破壁提取靈芝孢子粉有效成分食用是主流服用方式[8]。近年來，隨著技術(shù)不斷發(fā)展，靈芝孢子粉的破壁與質(zhì)量檢測技術(shù)不斷進(jìn)步，有效成分提取方法也不斷完善。本文主要綜述近10多年來，靈芝孢子粉的破壁技術(shù)、質(zhì)量分析方法，以及靈芝孢子粉提取方法，以期相關(guān)研究者充分了解該領(lǐng)域重要進(jìn)展，為進(jìn)一步研究、開發(fā)和利用靈芝孢子粉提供參考依據(jù)。

1 靈芝孢子粉的破壁方法

根據(jù)有關(guān)研究，本文將靈芝孢子粉破壁的方法主要概括為47種，即生物化學(xué)法、物理法、機(jī)械法和綜合法。

1.1 生物化學(xué)法

1.1.1 萌動(dòng)激活法

即通過誘導(dǎo)靈芝孢子萌發(fā)進(jìn)行孢子破壁的方法。研究表明，新鮮的靈芝孢子，在28℃，pH值為5，供氧和黑暗條件下培養(yǎng)48 h，萌發(fā)率可達(dá)70%。0.1 mg·mL-1濃度范圍的MgSO4，CaCl2和FeC13均能促進(jìn)孢子萌發(fā)，適宜條件下靈芝孢子萌發(fā)率可達(dá)70%[9]。萌動(dòng)激活法借助的靈芝孢子自身的生長力，能量消耗小。并且，萌動(dòng)激活的全破壁靈芝抱子具有顯著的抗癌活性，并呈明顯的量效關(guān)系[10]。因此，萌發(fā)激活法是一種具有發(fā)展前景的方法。需要注意的是，新鮮飽滿的靈芝孢子粉萌發(fā)效果較好，干癟老化的靈芝孢子粉不易萌發(fā)。

1.1.2 酶解破壁法

即在一定條件下，利用纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶等浸泡靈芝孢子粉，來達(dá)到破壁的目的。夏志蘭等的研究表明，選用3%的溶壁酶Ⅲ，結(jié)合超聲波處理南韓靈芝、臺芝和中華黑芝的孢子粉，孢子粉破壁率可達(dá)90%以上[11]。酶法破壁具有作用條件溫和，可控制孢壁破壞程度等優(yōu)點(diǎn)。但是此方法耗時(shí)較長，酶價(jià)格較高，且酶加入后不易清除。目前單獨(dú)應(yīng)用較少，多與其它方法結(jié)合運(yùn)用。近年來，楊杭等利用幾丁質(zhì)篩選培養(yǎng)基，對四川采集的土壤樣品進(jìn)行篩選，篩選出了具有較高纖維素酶和幾丁質(zhì)酶活性的高效靈芝孢子壁降解菌，可供靈芝孢子破壁使用[12]。

1.1.3 化學(xué)試劑法

通過加入酸、堿等化學(xué)試劑浸泡，破壞靈芝孢子壁結(jié)構(gòu)的方法。多用于靈芝孢子粉破壁前處理或孢子粉有效成分提取等方面。

1.2 物理法

物理法是指使用低溫、冷凍（脆化）、超聲波、微波、超臨界二氧化碳等物理作用破壞靈芝孢子細(xì)胞壁的方法。超聲波是一種頻率高于人耳可聽范圍的聲波，可使靈芝孢子粉溶液變成密集的小氣泡，小氣泡炸裂產(chǎn)生的機(jī)械力可以使靈芝孢壁開裂達(dá)到破壁效果。單獨(dú)使用超聲波破壁，破壁效率較低，容易產(chǎn)生局部高熱而使靈芝孢子中的熱敏性成分如靈芝多肽變性失活。微波是以輻射形式加熱的電磁波，有選擇加熱性、穿透性和低熱慣性等特點(diǎn)。應(yīng)用微波方法進(jìn)行靈芝孢子破壁，能夠直接作用于靈芝孢子內(nèi)的極性物質(zhì)，尤其是水分子，水吸熱蒸發(fā)后的壓力能夠破壞孢子壁。微波破壁具有占地小、成本低、易操作和無污染等優(yōu)點(diǎn)，但是同超聲波破壁相似，同樣容易導(dǎo)致靈芝孢子中的熱敏性物質(zhì)加熱后失活[13]。根據(jù)熱脹冷縮的原理，還可以對靈芝孢子通過凍融法進(jìn)行破壁。如周順華等通過將靈芝孢子過冷液氮淬冷的方法進(jìn)行靈芝孢子破壁，發(fā)現(xiàn)靈芝孢子破壁率隨液氮淬冷次數(shù)增加而增加，并呈先快后慢趨勢[14]。Fu等通過超臨界二氧化碳使靈芝孢子粉破壁并提取靈芝多糖，具有低溫、無毒和分離效率高的優(yōu)點(diǎn)，并由于低溫惰性環(huán)境處理減少了靈芝活性成分的分解[15]。

1.3 機(jī)械法

本文中機(jī)械法指利用各種機(jī)械，通過碾壓、擠壓、噴射粉碎、氣流粉碎、撞擊等作用破壞靈芝孢子壁的方法。機(jī)械法由于操作簡便，破壁率高，可以用于工業(yè)化生產(chǎn)，是目前主要工業(yè)應(yīng)用的靈芝孢子粉破壁加工方法。

靈芝孢子極為微小，顯微鏡下觀察，靈芝孢子單個(gè)細(xì)胞呈卵形，黃褐色或棕褐色，長度僅為10 uM 左右。而且，靈芝孢子壁又極為堅(jiān)韌。因此，常規(guī)粉碎技術(shù)不能夠使靈芝孢子粉破壁，通常要用超微粉碎機(jī)械進(jìn)行破壁。超微粉碎技術(shù)是20 世紀(jì)70 年代發(fā)展產(chǎn)生的一種物料加工技術(shù)，能夠?qū)⑽锪戏鬯槌?0 μM 以下的粒度。目前利用機(jī)械進(jìn)行超微粉碎的技術(shù)又分為干法和濕法。干法粉碎主要有球磨式粉碎、沖擊式粉碎、振動(dòng)式粉碎和氣流式粉碎等；濕法粉碎主要利用液體高壓粉碎機(jī)對物料進(jìn)行粉碎。對于熱敏性物料，可使用低溫超微粉碎，將物料冷卻至脆性狀態(tài)，再進(jìn)行粉碎，可有效避免熱敏性物質(zhì)分解[16]。超微粉碎的干法粉碎技術(shù)和濕法粉碎技術(shù)都可以應(yīng)用于靈芝孢子粉破壁。張新新等利用高能納米沖擊磨對靈芝孢子粉進(jìn)行粉碎，在球料比3∶1（質(zhì)量比），球磨時(shí)間6 h的情況下，靈芝孢子破壁率能達(dá)到90%以上，靈芝孢子油得率在30%以上[17]。杜樂樂等使用振動(dòng)式超微粉碎機(jī)對靈芝孢子粉進(jìn)行破壁，破壁率達(dá)到90%以上，靈芝孢子粉破壁后免疫活性增強(qiáng)[7]。由于應(yīng)用超微粉碎機(jī)械用時(shí)短，效率高，操作簡便，目前超微振動(dòng)粉碎法是工業(yè)上靈芝孢子粉破壁主流方法。氣流粉碎機(jī)又稱氣流磨，能夠使物料在高速氣流作用下被粉碎。氣流粉碎機(jī)以壓縮空氣為動(dòng)力,壓縮氣體在噴嘴處的絕熱膨脹會(huì)使系統(tǒng)溫度降低，可用于粉碎低熔點(diǎn)和熱敏性材料及生物活性制品。近年來，氣流粉碎機(jī)較廣泛用于中藥材超細(xì)粉制備，是粉碎中藥材的重要方法之一。崔寧等曾報(bào)道應(yīng)用自行研制開發(fā)的超高壓超臨界撞擊流破壁系統(tǒng)，采用超臨界二氧化碳作為工作流體對靈芝孢子粉進(jìn)行破壁，取得良好的破壁效果[18]。但是，由于靈芝孢子粉很輕，常規(guī)的氣流沖撞很難有著力點(diǎn)，常規(guī)的氣流粉碎法應(yīng)用于靈芝孢子粉破壁效果不是很理想，氣流法多用于后續(xù)的靈芝孢子粉分級，或與其它方法聯(lián)合應(yīng)用。2015年，肖鑫等報(bào)道先將靈芝孢子粉使用纖維素酶進(jìn)行預(yù)處理，再進(jìn)行高壓氣流粉碎，粉碎率可達(dá)到99%以上[19]。2017 年，葉坤等報(bào)道先將靈芝孢子粉進(jìn)行真空低溫微波預(yù)處理，使靈芝孢子壁脆化，然后對靈芝孢子進(jìn)行氣流粉碎，經(jīng)過30 min的氣流粉碎后，其破壁率可以超過99%[20]。劉春延等將濕法超微粉碎技術(shù)應(yīng)用于靈芝孢子粉破壁，以水為破壁溶劑，使用超聲波進(jìn)行預(yù)處理，使用高壓均質(zhì)機(jī)（高壓流體納米勻質(zhì)機(jī)）進(jìn)行靈芝孢子破壁，破壁率可以達(dá)到90%以上，破壁靈芝孢子粉具有較好的抗腫瘤活性[21]。劉靜雪等應(yīng)用低溫雙螺桿擠出技術(shù)對靈芝孢子粉進(jìn)行破壁處理，利用響應(yīng)面法對影響靈芝孢子粉破壁的主要因素進(jìn)行了優(yōu)化，為靈芝孢子粉破壁提供了一種新的工藝，可為靈芝孢子粉進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供參考[22]。

1.4 綜合法

在實(shí)際應(yīng)用中，靈芝孢子粉的破壁單一使用一種方法的很少，一般采用多種方法結(jié)合。靈芝孢子破壁方法技術(shù)具有重要的應(yīng)用價(jià)值，也申請了很多專利，多為上述生物、化學(xué)、物理、機(jī)械等方法的組合。例如，李淑芳等通過將萌發(fā)、超微粉碎和酶解三種方法相結(jié)合進(jìn)行靈芝孢子破壁處理，破壁率可達(dá)80%以上，破壁后的靈芝孢子粉可用于靈芝孢子油提取[23]。王欣宇等對近期靈芝孢子粉破壁技術(shù)進(jìn)行了綜述，認(rèn)為目前使用較多的是物理機(jī)械法，缺點(diǎn)是重金屬超標(biāo)，對機(jī)械設(shè)備要求高，破壁后碎片過多，不易分離。有必要研發(fā)投資小，成本低的設(shè)備進(jìn)行破壁。另外，需要研發(fā)新的破壁技術(shù)，增強(qiáng)破壁后有效成分吸收率[24]。Zhao 等使用一種冰浴結(jié)合超聲波處理的技術(shù)進(jìn)行靈芝孢子粉破壁，發(fā)現(xiàn)在冰浴條件下進(jìn)行超聲，靈芝孢子粉的破碎效率從45%升高到了75%，破壁孢子粉的有效成分也得到了提高[25]。Wang 等報(bào)道了一種化學(xué)反應(yīng)和物理刺激相結(jié)合的靈芝孢子破壁方法。這種方法首先采用氫氧化鈉軟化和溶解靈芝孢子細(xì)胞壁，然后加入尿素和乙醇加速化學(xué)反應(yīng)。再應(yīng)用超聲波處理加速化學(xué)反應(yīng)使靈芝孢子破裂，通過低溫冷凍是靈芝孢子膨脹破裂。最后通過加入過量的抗壞血酸中和反應(yīng)液，防止靈芝孢子活性物質(zhì)的氧化，還通過加入β-環(huán)糊精封住靈芝孢子壁的小孔，防止靈芝孢子生物活性物質(zhì)的揮發(fā)和氧化。β-環(huán)糊精和靈芝孢子活性物質(zhì)能夠形成包含物，增加了靈芝孢子的水溶解性和有效成分的穩(wěn)定性，更有助于靈芝孢子活性成分的消化和吸收[26]。近年來，浙江省壽仙谷藥業(yè)股份有限公司研發(fā)“靈芝孢子粉第三代去壁提純技術(shù)”，以破壁靈芝孢子粉為原料，進(jìn)一步運(yùn)用提取技術(shù)，分離孢子殼等無效成分，使功效成分多糖和三萜得到了倍增，提供了一種新的靈芝孢子粉“破壁”和“去壁”聯(lián)用的方法，該方法獲得了日內(nèi)瓦第46屆國際發(fā)明展金獎(jiǎng)?？梢姡`芝孢子粉的破壁技術(shù)，還有很大的提升空間，多種技術(shù)的聯(lián)用和新技術(shù)的引入，常常能夠收到較好的效果。

2 破壁靈芝孢子粉的質(zhì)量分析控制

目前，靈芝孢子粉的破壁方法很多，但破壁靈芝孢子粉的質(zhì)量還沒有統(tǒng)一的控制標(biāo)準(zhǔn)。破壁靈芝孢子粉主要功效成分包括三萜、多糖和油脂類等，主要存在問題是摻假、破壁率低、油脂過氧化、有效成分含量低及重金屬霉菌污染等。本文概括了破壁靈芝孢子粉檢測方法的一些重要進(jìn)展。

2.1 鑒別

靈芝孢子粉的鑒別包括形態(tài)鑒別、真?zhèn)舞b別、破壁率鑒別等。一般來說，破壁靈芝粉為深褐色極細(xì)粉末，無結(jié)塊現(xiàn)象，手感細(xì)膩，嘗之味微苦。為了防止靈芝孢子粉摻假，實(shí)驗(yàn)室可以采用薄層色譜法、紫外光譜法、核磁共振波譜法（1H-NMR）法以及紅外光譜法等方法區(qū)別靈芝粉、靈芝孢子粉及破壁靈芝孢子粉[27-30]。靈芝孢子粉的破壁率一般通過血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。首先可以將靈芝孢子粉制成混懸液，然后使用放大倍數(shù)超過200 倍的顯微鏡進(jìn)行鏡檢。未破壁的孢子呈褐色，卵形，頂端平截，外壁無色，內(nèi)壁有疣狀突起，長度8-12 μm，寬5-7 μm；破壁后的孢子可見殘破的孢子壁。靈芝孢子的破壁率可以顯微鏡下利用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。由于這種方法成本低廉，簡便易行，是一種常用的檢測方法。但是，這種方法在精密度上有所不足，盡管可以通過對靈芝孢子粉進(jìn)行前處理和充分懸浮等方法改善鏡檢的精確度，人為因素和概率因素難以消除[31]。破壁檢測結(jié)合有效成分含量測試，能夠更為準(zhǔn)確地測定靈芝孢子破壁情況。

2.2 有效成分分析

研究表明，破壁靈芝孢子中富含多糖、三萜、甾醇、生物堿等物質(zhì)，而其中粗多糖與總?cè)剖谦@得業(yè)內(nèi)公認(rèn)的功效評價(jià)指標(biāo)。靈芝孢子粉中的粗多糖可以參照2015版《中國藥典》靈芝項(xiàng)目下測定靈芝多糖方法，采用硫酸蒽酮法，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算測定，但這種方法無法測定孢子粉中多糖的單糖組成及含量。黃曉蘭等采用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）、高效液相色譜（HPLC）分析靈芝孢子粉多糖的單糖組成，用凝膠滲透色譜（GPC）分析靈芝孢子粉多糖的相對分子質(zhì)量及其分布，發(fā)現(xiàn)靈芝孢子粉多糖是由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成的雜多糖，破壁與不破壁的多糖組成完全相同，其相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)略有區(qū)別。但破壁靈芝孢子粉多糖較不破壁孢子粉的多糖高出70%，增加部分為相對分子質(zhì)量較小的多糖[32]。2014 年，于青等報(bào)道建立了一種較為簡便的通過離子色譜法測定靈芝孢子粉中多糖的單糖組成的方法，結(jié)果表明靈芝孢子粉中多糖主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖和巖藻糖等單糖組成[33]。尚姝等也建立了一種通過高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器（HPLC-ELSD）法分析破壁靈芝孢子粉的多糖中單糖組成的方法，該方法較為準(zhǔn)確可靠，分離效果好[34]。于華崢等對靈芝子實(shí)體、菌絲體及孢子粉中的多糖成分進(jìn)行了比較，利用苯酚硫酸法進(jìn)行了多糖含量測定，利用離子色譜法分析其水解后單糖組成。結(jié)果表明，靈芝菌絲體中多糖含量最高，達(dá)到3.81%，孢子粉多糖含量為1.8%，靈芝子實(shí)體中多糖含量最低，僅為0.59%；水解后的單糖組成也有差異，子實(shí)體的單糖主要為葡萄糖和半乳糖，菌絲體和孢子粉的單糖主要為葡萄糖，靈芝三個(gè)不同部位的多糖含量、組成、結(jié)構(gòu)與活性均有所不同，需要區(qū)別對待[35]。靈芝孢子粉中的總?cè)祁愇镔|(zhì)主要包括赤芝孢子內(nèi)酯A 和B（Ganosporelactone A,B），靈芝孢子酸A（Ganosporeic acid A），靈芝酸A、B、C、E、γ、δ、ε、ζ、θ（Ganoderic acid A,B,C,E,γ,δ,ε,ζ,θ）等。楊小英等利用紫外分光光度法與HPLC法對靈芝孢子粉三萜類成分進(jìn)行化學(xué)分析，破壁孢子粉三萜類化合物的含量都大于未破壁孢子粉[36]。陳冠州等則采用香草醛-冰醋酸、高氯酸顯色的比色方法，以熊果酸為對照品對破壁靈芝孢子粉提取物的總?cè)坪窟M(jìn)行了測定，確立了一種快速穩(wěn)定測定靈芝孢子粉中總?cè)坪康姆椒╗37]。董虹玲等利用HPLC 法測定了靈芝孢子粉和子實(shí)體中的靈芝酸A、靈芝酸C2 和靈芝酸G 的含量，結(jié)果表明靈芝三萜酸類含量子實(shí)體大于孢子粉，市售靈芝孢子粉內(nèi)靈芝酸類含量較低而且差異較大。所測靈芝孢子粉樣品中靈芝酸A＞靈芝酸G＞靈芝酸C2，三者之間呈正相關(guān)[38]。江麗青等的研究也表明，靈芝子實(shí)體中靈芝酸A 的含量要大于靈芝孢子粉[39]。近年來，為了滿足企業(yè)自檢需要，葉銀鵬等還建立了紫外分光光度法，用于快速測定破壁靈芝孢子粉中三萜類與多糖類成分[40,41]。

除多糖和三萜兩種主要活性成分外，靈芝孢子粉中還富含脂肪酸、生物堿、核苷酸、氨基酸和微量元素等或活性成分。靈芝孢子粉中的脂肪酸內(nèi)成分以油酸和亞油酸為主，秦臻等選用氣相色譜法（GC）建立了破壁靈芝孢子粉中油酸和亞油酸類成分含量的測定方法[42]。程夏倩等則利用HPLC-ELSD 法測定了破壁靈芝孢子粉中8個(gè)油脂類成分的含量[43]。靈芝中還含有膽堿和甜菜堿等有效成分，王亞濤等通過HPLC-ELSD測定靈芝及其孢子粉中膽堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并認(rèn)為該質(zhì)量分?jǐn)?shù)可以作為評價(jià)靈芝類產(chǎn)品質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)[44]。靈芝孢子粉的核苷酸類成分測定可以利用HPLC和指紋圖譜法[45,46]。靈芝孢子粉中的氨基酸類成分包括纈氨酸、谷氨酸、天門冬氨酸等，可以通過氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行測定[47]。靈芝孢子粉中還含有多種人體必需微量元素，包括天然有機(jī)鍺、有機(jī)硒、鉀、鈣、鎂、鉻等，微量元素可以通過分光光度法、石墨爐法、電感耦合高頻等離子體光譜法和微波消解-電感耦合等離子質(zhì)譜法（ICP-MS）等方法測定[48]。

2.3 安全性評價(jià)

破壁靈芝孢子粉的質(zhì)量安全性可以從重金屬殘留（包括靈芝栽培過程中的重金屬污染與靈芝破壁過程中夾帶的金屬碎屑）、有機(jī)溶劑殘留以及霉菌污染等方面進(jìn)行檢測。機(jī)械方法常會(huì)使破壁靈芝孢子粉金屬元素超標(biāo)，因此對于破壁靈芝孢子粉的金屬元素含量測定顯得很重要。勵(lì)炯等對破壁靈芝孢子粉中微量元素含量、金屬含量、破壁率及雜質(zhì)摻混情況進(jìn)行了研究[49,50]。徐靖等也應(yīng)用微波消解-ICP-MS 分析了不同破壁方法靈芝孢子粉中16中無機(jī)元素含量，發(fā)現(xiàn)與原料相比，破壁后靈芝孢子粉樣品中鉻（Cr）、鐵（Fe）、鎳（Ni）、鈷（Co）等元素含量顯著升高，但振動(dòng)破壁樣品升高倍數(shù)要比超音速氣流破壁樣品高1.75-48 倍，說明超音速氣流破壁方法更不易引入重金屬污染[51]。靈芝孢子粉破壁后如保存不當(dāng)，其中的孢子油容易被氧化，使靈芝孢子粉酸敗。靈芝孢子粉放置時(shí)間過長，甚至?xí)a(chǎn)生霉菌和毒素。勵(lì)炯等建立了通過高效液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）測定靈芝孢子粉黃曲霉毒素含量的方法，可以對靈芝孢子粉中的黃曲霉毒素進(jìn)行定性和定量的檢測[52]。

3 靈芝孢子粉的深加工（提取物）研究

隨著靈芝孢子粉破壁技術(shù)的提高，以及靈芝孢子粉有效成分檢測技術(shù)的不斷進(jìn)步，有關(guān)靈芝孢子粉的深加工研究也不斷深入。目前的靈芝孢子粉提取物產(chǎn)品以靈芝孢子油為主。靈芝孢子油的工業(yè)制備以超臨界二氧化碳萃?。⊿FE-CO2）法為主，具有無溶劑殘留、無污染、工藝簡單、萃取物純度高等優(yōu)點(diǎn)，但也存在設(shè)備昂貴、生產(chǎn)成本高的缺點(diǎn)。楊文婧等對靈芝孢子油的三種提取方法（SFE-CO2法、索氏抽提法和水酶法）進(jìn)行了研究。研究結(jié)果表明，在三種方法中，以索氏抽提法得油率最高，超臨界二氧化碳萃取法次之，水酶法最低，但提取的靈芝孢子油中三萜類含量反之。這種結(jié)果可能是因?yàn)樗阜ㄌ崛∵^程中，多糖形成了乳化液，降低了提油率，但三萜化合物存在親水基團(tuán)，從而較易溶入提取物中[53]。由于靈芝孢子油價(jià)格昂貴，市場混淆品較多，趙維良等建立了靈芝孢子油的HPLC指紋圖譜，用以鑒別靈芝孢子油及其混淆品[54]。靈芝孢子粉破壁提取孢子油后，余下的孢子粉稱為脫脂孢子粉，粉內(nèi)包含有豐富的靈芝多糖。為了提高靈芝脫脂孢子粉多糖的提取率，解決孢子粉多糖水提取液中孢子粉難以產(chǎn)業(yè)化過濾分離的困難，華正根等采用臥式螺旋離心機(jī)和蝶式離心機(jī)聯(lián)用技術(shù)，克服了孢子粉水提取液的產(chǎn)業(yè)化分離難題，為實(shí)現(xiàn)靈芝孢子粉多糖的產(chǎn)業(yè)化大生產(chǎn)提供了新的技術(shù)[55]。馮印等以超聲提取為主，漆酶破壁法為輔提取靈芝孢子粉中的靈芝酸，并應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化了靈芝酸的破壁提取工藝，為靈芝酸的工業(yè)制備提供了理論基礎(chǔ)[56]。

近年來，對于靈芝孢子油、靈芝孢子粉水提物和醇提物的藥理學(xué)研究也不斷取得新的進(jìn)展。有關(guān)靈芝孢子粉提取物的藥理學(xué)研究集中在靈芝孢子粉提取物的抗癌作用方面。靈芝孢子油是從破壁靈芝孢子中提取的脂質(zhì)活性物質(zhì)，主要以甘油三酯類化合物存在，還有少量的游離脂肪酸、類固醇酯、脂溶性維生素，以及微量的三萜類成分、有機(jī)鍺和氨基酸等。據(jù)報(bào)道，靈芝孢子油具有顯著的抗腫瘤、提高免疫、保肝護(hù)肝、抗氧化、抗衰老以及治療神經(jīng)疾病等作用，但產(chǎn)生上述作用的靈芝孢子油的主要活性成分還不是很清楚，抗腫瘤的機(jī)制也不是很清楚[57]。Chen 等的研究表明，靈芝提取物與靈芝孢子油對于腫瘤均有明顯的抑制效果，這種效果與抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶I和II的活性相關(guān)，靈芝孢子油的作用也可能與抑制細(xì)胞周期蛋白的水平相關(guān)[58]。劉國健等的研究認(rèn)為靈芝孢子中甘油三酯類成分可能是主要抗腫瘤活性成分之一，并認(rèn)為靈芝孢子油的抗腫瘤作用可能與單不飽和脂肪酸靶向抑制腫瘤細(xì)胞脂肪酸合成通路有關(guān)[59]。袁誠等的研究也表明，靈芝孢子油口服乳具有顯著的免疫增強(qiáng)作用，這種作用可能與富含的ω-9 脂肪酸相關(guān)[60]。近年來，對靈芝孢子粉的水提物和乙醇提取物的研究結(jié)果表明，靈芝孢子粉的水提物以多糖為主，也含有少量的三萜與甾醇。靈芝孢子粉的醇提物以三萜與甾醇為主，并含有少量的多糖。它們兩者均具有抑癌、降低血糖血脂和保肝護(hù)肝作用。并且它們均能夠通過調(diào)控與細(xì)胞循環(huán)和細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因和蛋白的活性，顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的活力，阻止結(jié)直腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，可以開發(fā)為預(yù)防和治療結(jié)直腸癌的很有前景的抗癌藥物，破壁靈芝孢子粉的水提物還能夠通過重建腸道微生物群，對乳腺癌細(xì)胞治療起到輔助作用，可以用來開發(fā)成為很有前景的治療和預(yù)防乳腺癌的藥物[61-63]。上述研究為靈芝孢子粉提取物在抗癌方面的應(yīng)用提供了扎實(shí)的理論依據(jù)。

4 結(jié)語與討論

靈芝在中國有上千年的藥用歷史。近50年以來，靈芝的大規(guī)模種植推動(dòng)了靈芝精深加工產(chǎn)業(yè)與相關(guān)研究的進(jìn)展，而在國內(nèi)市場上流行的主要靈芝產(chǎn)品中，破壁靈芝孢子粉憑借其卓越療效，迅速占領(lǐng)了國內(nèi)市場。據(jù)陳祖琴等對國內(nèi)2005 年至2015 年間的靈芝深加工保健食品的不完全統(tǒng)計(jì)，88%的靈芝保健品是單方，其中以孢子粉為原料的靈芝保健品占單方靈芝的40%，其次是子實(shí)體提取物、子實(shí)體和孢子油,分別占26%、17%、13%[64]。目前，中國破壁靈芝孢子粉年產(chǎn)量居世界首位，除國內(nèi)銷售，還出口到日本、韓國和歐美一些國家，產(chǎn)品療效受到國內(nèi)國際認(rèn)可。

在現(xiàn)有的一些靈芝孢子破壁方法中，實(shí)際生產(chǎn)中多綜合運(yùn)用物理和機(jī)械方法，破壁過程中主要存在問題包括破碎不充分，破碎過程中產(chǎn)生重金屬殘留以及靈芝孢子內(nèi)含物易氧化等。葉坤等將低溫微波處理與氣流粉碎相結(jié)合的破壁方法，以及劉春延等將超聲破壁處理與高壓均質(zhì)超微粉碎相結(jié)合的方法，都取得了較好的破壁效果，并減少了孢子內(nèi)含物的氧化，對于實(shí)際生產(chǎn)具有重要指導(dǎo)意義[20,21]。為了更好地解決靈芝孢子粉破壁過程中的一些問題，可以在破壁預(yù)處理過程中加入生物學(xué)方法，例如孢子萌發(fā)法和酶解破壁法等。目前，靈芝孢子萌發(fā)法的主要問題在于孢子萌發(fā)率低，不穩(wěn)定，需要對靈芝孢子萌發(fā)條件進(jìn)行進(jìn)一步摸索。而酶解破壁法優(yōu)勢在于作用條件溫和，但所使用的溶壁酶類價(jià)格較高，需要進(jìn)一步降低成本。在對于現(xiàn)有靈芝孢子粉破壁方法的評價(jià)方面，不能簡單地以使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法所得破壁率作為標(biāo)準(zhǔn)。在破壁過程中，如何更好的保護(hù)靈芝孢子內(nèi)含物的活性，防止其中的活性物質(zhì)的氧化，或許具有更重要的意義。Wang等的方法通過將靈芝孢子先進(jìn)行化學(xué)處理，再通過超聲波和低溫處理使靈芝孢子壁形成很多小孔，最后使用β-環(huán)糊精封住小孔，既保留了靈芝孢子活性成分不泄露和氧化，又提高了靈芝孢子粉的穩(wěn)定性和溶解性，這種方法很值得借鑒[26]。而壽仙谷藥業(yè)研發(fā)的“靈芝孢子粉第三代去壁提純技術(shù)”將破壁與去殼技術(shù)聯(lián)用，也是未來的發(fā)展方向。

迄今為止，有關(guān)靈芝孢子粉的質(zhì)量評價(jià)方面還沒有統(tǒng)一的推薦性或強(qiáng)制性國家標(biāo)準(zhǔn)。靈芝孢子粉的質(zhì)量評價(jià)可以參考藥典靈芝質(zhì)量評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)和一些地方制定的靈芝孢子粉飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，如浙江省食品藥品監(jiān)督管理局修訂的2015 版《浙江省中藥炮制規(guī)范》中的靈芝孢子粉炮制標(biāo)準(zhǔn)，以及2017 年新版《安徽省中藥飲片炮制規(guī)范》公示草案中的靈芝孢子粉飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（草案）。本文對近年來靈芝孢子粉的鑒別、活性成分分析和安全性評價(jià)等方面的一些新的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了總結(jié)，可見一些新技術(shù)給靈芝孢子粉提供了更為可靠的質(zhì)量評價(jià)方法。在另一方面，由于靈芝已列入藥典，而靈芝孢子粉的功效已經(jīng)為廣大消費(fèi)者所認(rèn)同，并且?guī)讉€(gè)省市也作為地方中藥飲片，建議加入中國藥典，以利于靈芝孢子粉產(chǎn)業(yè)健康有序發(fā)展。

伴隨著靈芝孢子破壁技術(shù)的進(jìn)展，靈芝孢子破壁后提取活性成分是靈芝孢子深加工的又一個(gè)重要的研究開發(fā)方向。目前，靈芝孢子粉提取物中，由于靈芝孢子粉三萜和多糖的含量低，提取純化較為復(fù)雜，市場上主要產(chǎn)品以靈芝孢子油為主。盡管靈芝孢子油的主要活性成分尚不確定，靈芝孢子油卻顯示出很強(qiáng)的抗腫瘤、提高免疫力和保肝護(hù)肝等藥理學(xué)作用，在對腫瘤臨床輔助治療的過程中，也具有很好的效果。在對靈芝孢子油的提取過程中，提取過孢子油的破壁靈芝孢子粉還可以用來提取靈芝孢子多糖，以降低成本，提高生產(chǎn)效率。除靈芝孢子油外，藥理學(xué)研究表明，靈芝孢子粉的水提物和醇提物均可以抑制腫瘤細(xì)胞活性，可以開發(fā)預(yù)防和治療結(jié)直腸癌的藥物，靈芝孢子粉的水提物可以開發(fā)預(yù)防和治療乳腺癌的藥物?？梢姡`芝孢子粉提取物在預(yù)防和治療腫瘤方面，具有很大的科研價(jià)值和應(yīng)用前景。最近的研究報(bào)道表明，靈芝孢子粉可以用來合成具有良好的生物兼容性、成纖維細(xì)胞活力和抗菌活性的幾丁聚糖，所合成幾丁聚糖可以作為一種新的生物材料，這為靈芝孢子粉的綜合利用又提供了一種新的方式[65]。隨著靈芝孢子粉相關(guān)研究的不斷深入，靈芝孢子粉的深加工產(chǎn)業(yè)必將迎來更加成熟和穩(wěn)定的發(fā)展。