金鉑合金納米顆粒的過(guò)氧化酶活性研究及對(duì)無(wú)機(jī)汞和甲基汞離子可視化比色傳感＊

蘇 婕，謝心雨，李楚慧，賈玉飛，張思奇，韓得滿

（臺(tái)州學(xué)院 醫(yī)藥化工與材料工程學(xué)院，浙江 臺(tái)州318000）

0 引言

汞在自然界中有三種存在形式，即元素汞（Hg）、無(wú)機(jī)汞（Hg+、Hg2+）和有機(jī)汞，各種形態(tài)的汞及其化合物都會(huì)對(duì)機(jī)體造成以神經(jīng)毒性和腎臟毒性為主的多系統(tǒng)損害［1-2］。作為一種生活中常見(jiàn)的重金屬元素，汞離子和甲基汞離子對(duì)人類(lèi)健康和環(huán)境均具有極大的危害，因此，建立一種快速、簡(jiǎn)便和準(zhǔn)確測(cè)定水中無(wú)機(jī)汞離子和甲基汞離子的分析方法具有重要意義［3-4］。

傳統(tǒng)的汞離子檢測(cè)方法主要有原子光譜法［5-6］、色譜法［7-8］、電化學(xué)分析法［9-10］和分光光度法［11-12］等，但是這些方法存在儀器昂貴、測(cè)定操作復(fù)雜、不易普及應(yīng)用等問(wèn)題，難以滿足環(huán)境中無(wú)機(jī)汞和甲基汞分析的需求，因此，需要開(kāi)發(fā)一種新型、簡(jiǎn)單、快速的無(wú)機(jī)汞和甲機(jī)汞的分析方法。

金鉑納米顆粒（PtAuNPs）是一種人工過(guò)氧化酶［13-14］，它能夠催化雙氧水和TMB 的反應(yīng)，將無(wú)色的TMB 底物催化氧化生成藍(lán)色的氧化態(tài)TMB［15］。而甲基汞和無(wú)機(jī)汞離子可以通過(guò)檸檬酸鈉還原作用沉積在金鉑納米顆粒的表面，從而破壞了金鉑納米顆粒的過(guò)氧化酶作用。這就為我們通過(guò)觀察其溶液顏色的變化，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)無(wú)機(jī)汞和甲基汞的濃度檢測(cè)提供了可能。與傳統(tǒng)的分析方法相比，本方法不需要昂貴的分析儀器，也無(wú)需樣品前處理，可以裸眼觀察溶液顏色的變化判斷無(wú)機(jī)汞和甲基汞離子的存在，再輔以分光光度計(jì)定量，可以實(shí)現(xiàn)水中痕量無(wú)機(jī)汞和甲基汞離子的可視化檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)Cary-60（安捷倫）；電子天平JM-83003（上海精天電子儀器有限公司）；恒溫加熱臺(tái)（上海予申儀器有限公司）；透射電子顯微鏡Tecnai G2（FEI Tecnai）等。2-嗎啉乙磺酸（MES）、TMB、氯金酸、氯鉑酸、檸檬酸鈉、硝酸汞、氯化鐵、硝酸銅、硝酸銀、氯化鎘、氯化鎂、氯化鈉（上海晶純?cè)噭┯邢薰荆?，以上試劑均為分析純?/p>

1.2 PtAuNPs的合成

按文獻(xiàn)［15］的要求用檸檬酸鈉還原法制備PtAuNPs：2.25 mL 的10 mmol/L HAuCl4，0.25 mL 的10 mmol/L H2PtCl6和100 mL 蒸餾水于置于250 mL 的錐形瓶中，磁子攪拌，持續(xù)加熱溶液至沸騰，然后加入3 mL1%的檸檬酸鈉溶液，再攪拌30 min 可以得到深紅色的PtAuNPs 溶液。

圖1 金鉑合金納米顆粒的制備方法及無(wú)機(jī)汞和甲基汞檢測(cè)示意圖Fig.1 Schematic representation of the preparation of the PtAuNPs for the detection of mercury ions

1.3 溶液制備及光譜測(cè)試

1.3.1 3，3"，5，5"-四甲基聯(lián)苯胺（TMB 溶液）和MES 緩沖溶液的制備

用分析天平準(zhǔn)確稱量化合物TMB 0.2884 g TMB 于10 mL 燒杯中，加入5 mL 二甲亞砜溶解，將溶液轉(zhuǎn)移后的試劑瓶定容至8 mL 后，即得到15 mmol/L 的TMB 溶液。

稱取MES（2-嗎啉乙磺酸）0.24405 g 于100 mL 燒杯中，用2 mol/L 的氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH 至4.5。將溶液轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中定容即可得到50 mL 25 nmol/L 的MES 緩沖溶液。

1.3.2 TMB-H2O2 體系中PtAuNPs 濃度的優(yōu)化（以下光譜測(cè)試均使10 mm×10 mm 比色皿）

取5 支1 mL 離心管，加入20 μL H2O2，20 μL TMB 溶液，依次加入5 μL，10 μL，15 μL，20 μL，25 μL PtAuNPs，加入MES 緩沖溶液定容至2 mL，反應(yīng)10 min，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定反應(yīng)后體系的吸收曲線以及650 nm 處吸光度。

1.3.3 比色體系加入不同濃度的Hg2+的紫外-可見(jiàn)光譜滴定曲線的測(cè)定

為了考察Hg2+濃度離子對(duì)PtAuNPs 催化活性的影響，在H2O2-TMB 反應(yīng)體系中，加入不同量的Hg2+溶液，Hg2+最終濃度（μmol/L）分別為：0、0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0。用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定體系吸收曲線以及650 nm 處吸光度。

1.3.4 比色體系對(duì)各種干擾離子選擇性的測(cè)定

為了考察不同金屬離子對(duì)PtAuNPs 催化活性的影響，在H2O2-TMB 反應(yīng)體系中，選擇加入常見(jiàn)的金屬離子溶液，包括Hg2+，Cd3+，Mg2+，F(xiàn)e3+，Ag+，Cu2+，K+，Zn2+，Pb2+離子的最終濃度為1 μmol/L，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定體系吸收曲線以及650 nm 處吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 PtAuNPs的合成表征

如圖1PtAuNPs 的合成路線所示，加入檸檬酸鈉、氯金酸和氯鉑酸一鍋法制備，所得深紅色PtAuNPs膠體溶液，進(jìn)行透射電鏡表征如圖2 所示，納米顆粒的粒徑為13 nm。

圖2 PtAuNPs 透射電子顯微鏡圖Fig.2 TEM photograph of PtAuNPs

2.2 PtAuNPs的表征

將比色體系中加入的PtAuNPs 的體積優(yōu)化，按照1.3.2 所述方法進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)過(guò)程參數(shù)：分別加入5 μL，10 μL，15 μL，20 μL，25 μL PtAuNPs，反應(yīng)10 min。如圖3 所示，隨著PtAuNPs 的增加，體系在650 nm 處的吸光度值一直增加。當(dāng)加入25 μL PtAuNPs 納米顆粒時(shí)，吸光度最大。因此，選取加入25 μL PtAuNPs 作為最優(yōu)的條件，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采取加入25 μL PtAuNPs 來(lái)進(jìn)行無(wú)機(jī)汞和甲基汞的測(cè)定。

圖3 加入不同體積的PtAuNPs 對(duì)催化氧化TMB 的影響Fig.3 Peroxidase-like activity of Pt/Au with different concentrations of PtAuNPs in the colorimetric reaction of TMB in the presence of H2O2

2.3 無(wú)機(jī)汞離子和甲基汞離子的檢測(cè)

我們通過(guò)檢測(cè)不同濃度的Hg2+和CH3Hg+來(lái)確定比色方法的靈敏度和線性范圍。隨著Hg2+和CH3Hg+濃度的提高（0～1 μM），比色體系（TMB-H2O2）的吸光度逐漸降低（如圖4A 和圖5A 所示）。這是因?yàn)镠g2+和CH3Hg+通過(guò)PtAuNPs 膠體溶液中的檸檬酸鈉還原作用沉積到PtAuNPs 表面，破壞了PtAuNPs 的過(guò)氧化酶的催化作用。這樣TMB-H2O2的比色反應(yīng)體系就被破壞，引起了傳感體系吸光度的降低。我們可以用傳感體系的吸光度來(lái)定量Hg2+和CH3Hg+的濃度。如圖4B 和圖5B 所示，650 nm 處的吸光度比例變化值與Hg2+和CH3Hg+的濃度呈線性關(guān)系。線性方程分別為Y=0.0128+0.0635 CHg2+和Y=0.039+0.0541CHg2+。檢出限（LOD）根據(jù)公式LOD=3 σ/slope 計(jì)算為56.9 nmol/L（Hg2+）和61.3 nmol/L（CH3Hg+）。該結(jié)果可以應(yīng)用于無(wú)機(jī)汞和甲基汞的多重檢測(cè)。

圖4 無(wú)機(jī)汞離子的靈敏度測(cè)試（A） UV-vis absorption spectra of the supernatant solution for TMB-H2O2 reaction against various concentrations ofHg2+ ranging from 0-1 μmol/L；（B） Linear curve of absorbance value at 650 nm versus the Hg2+concentrationFig.4 Sensitivity for Hg2+ detection

圖5 甲基汞離子的靈敏度測(cè)試（A） UV-vis absorption spectra of the supernatant solution for TMB-H2O2 reaction against various concentrations ofCH3Hg+ ranging from 0-1 μmol/L；（B） Linear curve of（A0-Ai）/A0 at 650 nm versus the CH3Hg+ concentrationFig.5 Sensitivity for CH3Hg+ detection

2.4 無(wú)機(jī)汞離子和甲基汞離子的選擇性檢驗(yàn)

我們使用無(wú)機(jī)汞、甲基汞和其他不同種類(lèi)的金屬離子溶液對(duì)比色傳感器的選擇性進(jìn)行了測(cè)試，所有金屬離子的濃度均為1.0 μmol/L。相同實(shí)驗(yàn)條件下的測(cè)試結(jié)果如圖6 所示。從圖中可以看出，加入無(wú)機(jī)汞和甲基汞的兩組吸光度變化值要遠(yuǎn)大于加入其它金屬離子的幾組。這是因?yàn)槠渌饘匐x子不會(huì)破壞PtAuNPs 的過(guò)氧化酶活性，阻礙TMB 和H2O2的催化反應(yīng)。結(jié)果說(shuō)明比色傳感器對(duì)Hg2+和CH3Hg+具有較高的選擇性，可用于水中Hg2+和CH3Hg+離子的選擇性檢驗(yàn)。我們還測(cè)試了各共存離子的干擾上限值，嘗試使用10 倍濃度的共存離子進(jìn)行測(cè)試，發(fā)現(xiàn)除了Cd2+以外的離子均無(wú)影響，Cd2+的干擾較大。因此其他共存離子的上限為10 μmol/L，Cd2+為1 μmol/L。

圖6 Hg2+和CH3Hg+的選擇性測(cè)試：當(dāng)溶液中存在著1.0 μmol/L的不同金屬離子時(shí)在650 nm 處的吸光度比例變化值的柱狀圖Fig.6 Selectivity for Hg2+ and CH3Hg+detection：Histogram of（A0-Ai）/ A0 at 650 nm of the supernatant solution for TMB-H2O2 reaction in the presence of different ions

2.5 水樣中無(wú)機(jī)汞離子和甲基汞離子的測(cè)定

為了檢驗(yàn)傳感體系在實(shí)際水樣中的應(yīng)用能力，實(shí)驗(yàn)選擇海水和湖水作為樣品本底。將水樣用濾紙過(guò)濾后，測(cè)定2 個(gè)水樣中的無(wú)機(jī)汞和甲基汞，并對(duì)其進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，回收率在95%～105%之間，證明本檢測(cè)體系可以用于環(huán)境水樣中無(wú)機(jī)汞和甲基汞的準(zhǔn)確檢測(cè)。

表1 環(huán)境水樣中無(wú)機(jī)汞和甲基汞的分析結(jié)果Table 1 Analytical results of inorganic mercury and methylmercury in the environmental water samples

3 結(jié)論

本研究提出了一種簡(jiǎn)單、高效的水樣中無(wú)機(jī)汞和甲基汞離子的檢測(cè)方法。該方法基于無(wú)機(jī)汞和甲基汞離子在體系中被檸檬酸鈉還原沉積于金鉑納米顆粒表面，從而破壞了金鉑納米顆粒的過(guò)氧化酶活性，導(dǎo)致TMB-H2O2催化體系被破壞。我們可以通過(guò)監(jiān)測(cè)比色反應(yīng)中溶液顏色的變化，來(lái)定量無(wú)機(jī)汞和甲基汞離子的濃度。該方法的檢出限為56.9 nmol/L（Hg2+）和61.3 nmol/L（CH3Hg+）。與其它傳統(tǒng)的汞離子檢測(cè)方法相比，本方法具有靈敏度高、選擇性好、簡(jiǎn)單快速的優(yōu)點(diǎn)，且無(wú)需昂貴的分析儀器和前處理手段，就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)環(huán)境中水樣的高靈敏檢測(cè)。