一株鋅抗性菌株強(qiáng)化印度芥菜修復(fù)鋅污染土壤的可行性研究

杜憲正，王 濤，鄒路易，郁紅艷，張海利，滕 躍

（江南大學(xué) 環(huán)境與土木工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

隨著工業(yè)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)規(guī)模的不斷擴(kuò)大，土壤重金屬污染日益嚴(yán)重。鋅是動(dòng)植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的微量元素，但是土壤中鋅含量過多時(shí)，會(huì)在食物鏈中積累、遷移和傳遞，最終會(huì)對(duì)人體健康帶來極大威脅[1-2]。目前，傳統(tǒng)的污染土壤修復(fù)技術(shù)如客土法、土壤淋洗、電動(dòng)修復(fù)、電熱修復(fù)、穩(wěn)定化/固化等，不但治理費(fèi)用高，還嚴(yán)重破壞土壤結(jié)構(gòu)，易引起土壤肥力下降，治理過程中使用的化學(xué)試劑可能導(dǎo)致土壤二次污染。而通過植物（特別是超積累植物）結(jié)合相關(guān)微生物從污染環(huán)境中吸收、富集和轉(zhuǎn)移重金屬，從而降低環(huán)境中污染重金屬的濃度的生物修復(fù)技術(shù)，是一種投資少、成本低、不引起二次污染、可美化景觀的新興技術(shù)，逐漸成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[3]。

迄今為止，國(guó)外已發(fā)現(xiàn)的鋅超積累植物達(dá)20余種，國(guó)內(nèi)也發(fā)現(xiàn)東南景天、黑麥草、木賊、香附子及蓖麻、印度芥菜等鋅超富集植物[4-5]。但是這些已發(fā)現(xiàn)的重金屬超積累植物由于生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、生物量小等因素，嚴(yán)重限制了它們用于工程修復(fù)重金屬污染土壤的潛力[6]。研究發(fā)現(xiàn)，根際微生物一方面可以為植物生長(zhǎng)提供生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)元素以促進(jìn)植物生長(zhǎng)，如一些根際促生菌（PGPR）具有固氮、溶磷、解鉀的作用，可以保證植物在污染環(huán)境中生長(zhǎng)發(fā)育所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供給[7]；另一方面，根際微生物可以通過自身分泌物土壤環(huán)境中重金屬提高鋅在土壤中的活性和生物有效性，促進(jìn)植物對(duì)鋅的吸收和富集[8]。同時(shí)，根際微生物還具有固氮、溶磷、供鐵及增強(qiáng)植物激素產(chǎn)生的能力，從而為植物生長(zhǎng)提供所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，直接影響植物的代謝過程[9]。當(dāng)前學(xué)術(shù)界應(yīng)用根際促生菌聯(lián)合超積累植物修復(fù)Cd 等重金屬污染土壤的研究較多，并取得很好的治理效果[10-11]。然而，有關(guān)根際微生物與植物聯(lián)合修復(fù)重金屬Zn 污染土壤的研究相對(duì)較少。本文通過鋅抗性菌株微紫青霉菌Penicillium janthinellum BC109-2對(duì)難溶態(tài)鋅的溶解能力和植物促生能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，并結(jié)合印度芥菜對(duì)鋅污染土壤進(jìn)行修復(fù)效果研究，評(píng)價(jià)其潛在應(yīng)用效果。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株及保存條件 本試驗(yàn)選用本課題組從土壤中分離純化得到的鋅抗性菌株微紫青霉菌BC109-2（Genbank 登錄號(hào)：KX891188）作為實(shí)驗(yàn)用菌株；菌株BC109-2 保存在含有5 mM ZnSO4·7H2O 的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基中。CAS：購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。印度芥菜種子：購自武漢安谷科技有限公司。

1.1.2 主要試劑和培養(yǎng)基 1-氨基環(huán)丙烷羧酸（ACC）和吲哚乙酸（IAA）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

金屬離子貯藏液：8.61 g ZnSO4·7H2O 溶于1 L超純水中制成30 mmol/L 的貯藏液，用0.22 μm 的濾膜過濾后保存在4 ℃冰箱中保存，實(shí)驗(yàn)中經(jīng)過滅菌后加入培養(yǎng)基中并使之達(dá)到所設(shè)計(jì)的濃度。

CAS 藍(lán)色檢測(cè)液按照文獻(xiàn)[12]的方法配制。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，超純水1 000 mL，自然pH，1×105Pa 滅菌20 min。PDB 培養(yǎng)基即為不加瓊脂的PDA 培養(yǎng)基。

DF 培養(yǎng)基按照文獻(xiàn)[13]的方法配制。在經(jīng)過高溫滅菌的DF 液體培養(yǎng)基中，準(zhǔn)確加入終濃度為3.0 mmol L-1 的ACC（1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸）即為ADF 培養(yǎng)基。

PKO 培養(yǎng)基[14]：葡萄糖10.0 g，（NH4）2SO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.036 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，Ca3（PO4）32.0 g，總體積1 000 mL，pH 7.0。

SA 液體培養(yǎng)基配方：蔗糖20.0 g，L-天門冬酰胺2.0 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g；pH 7.0。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鋅抗性菌株對(duì)難溶性鋅的溶解作用 將供試菌株轉(zhuǎn)接到含難溶性ZnCO3的PDB 培養(yǎng)基（1 000 mg/L ZnCO3）中，30 ℃，搖床振蕩培養(yǎng)72 h，每隔18 h 取一次樣，10 000 r/min 離心5 min，測(cè)定上清液中的鋅含量及溶液pH。

1.2.2 菌株BC109-2 的促生特性研究

1）檢測(cè)菌株利用氨基環(huán)丙烷羧酸（ACC）作為唯一氮源的能力。

將微生物菌株于含有不同濃度Zn2+（0，1，2，3 mmol/L）的ADF 培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)24 h 誘導(dǎo)其產(chǎn)生ACC 脫氨酶，離心洗滌后破碎細(xì)胞得粗酶液，每個(gè)濃度做3 組重復(fù)試驗(yàn)。菌株ACC 脫氨酶活性參照龔鳳娟和張宇鳳的方法[15]測(cè)定α-酮丁酸在540 nm處吸光度值。粗酶液中總蛋白質(zhì)含量用考馬斯亮藍(lán)蛋白試劑盒測(cè)定。將每分鐘形成1 μmol α-丁酮酸的量定義為1 個(gè)酶活力單位。

2）吲哚乙酸（IAA）的產(chǎn)生能力測(cè)定。

將菌株接種到添加了0.5 mg/mL L-色氨酸以及不同濃度Zn2+（0，1，2，3 mmol/L）的PDB 液體培養(yǎng)基中28 ℃搖床震蕩培養(yǎng)48 h，每個(gè)濃度做3 組重復(fù)試驗(yàn)[16]，對(duì)照組不接種菌株。取2 mL 菌液，10 000 r/min 離心15 min，準(zhǔn)確移取2 mL Salkowski試劑[17]（0.5 mol/L FeCl3溶液10 mL、35%高氯酸500 mL，于使用前混合搖勻，避光保存）加入到1 mL 上清液中，于暗處顯色30 min，測(cè)定波長(zhǎng)530 nm 處的吸光度值。配制純IAA 溶液（質(zhì)量濃度梯度為0、7、14、21、28、35 ug/mL）測(cè)定對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)下的吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算不同Zn2+濃度下微生物的IAA 產(chǎn)生量。

3）鐵載體產(chǎn)生量測(cè)定。

菌株鐵載體產(chǎn)生量采用通用CAS 檢測(cè)法[18]測(cè)定。將新鮮菌種于限鐵SA 液體培養(yǎng)基中，28 ℃搖床培養(yǎng)（150 r/min）48 h，對(duì)照組接種相同量的死菌；菌懸液經(jīng)10 000 r/min 離心15 min 取3 mL 上清液，將菌液和CAS 檢測(cè)液1∶1 的體積充分混勻，1 h 后測(cè)定630 nm 處的吸光度（A），另取3 mL 對(duì)照組的培養(yǎng)基上清液加入到3 mL CAS 藍(lán)色檢測(cè)液中，測(cè)得吸光值作為參比值（Ar），A/Ar的比值作為定量指標(biāo)。

4）溶磷能力測(cè)定。

取1 mL 菌懸液接種于含有不同濃度Zn2+（0，1，2，3 mmol/L）的PKO 液體培養(yǎng)基中，置28 ℃搖床（150 r/min）振蕩培養(yǎng)48 h，以死菌菌懸液作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度做3 組重復(fù)試驗(yàn)。采用鉬銻抗比色法[19-20]定量測(cè)定微紫青霉菌BC109-2 的溶磷能力，取2 mL 培養(yǎng)液1 500 r/min 離心后取上清液加入20 mL NaHCO3浸提劑及一勺無磷活性炭粉，搖床振蕩30 min 充分浸提，過濾后取10 mL 濾液加入35 mL 蒸餾水及5 mL 鉬銻抗試劑，混勻，室溫靜置30 min，測(cè)定700 nm 處吸光度。

1.2.3 根伸長(zhǎng)實(shí)驗(yàn) 將種子浸在乙醇∶30% H2O2（1∶1）溶液中消毒15 min，后用蒸餾水洗滌兩次。根伸長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)根據(jù)Patten C L 所描述的方法[21]在濾紙上進(jìn)行。菌種在含有0.5 mg/mL 色氨酸的LB 培養(yǎng)基中28 ℃，150 r/min 培養(yǎng)24 h，離心收集菌體后將0.1 mL OD600為0.2 的菌體培養(yǎng)液懸于9.9 mL 無菌生理鹽水中制成細(xì)胞懸液（約2.0×108CFU mL-1）加入濾紙上。放種子之前，不同濃度Zn2+以ZnSO4·7H2O形態(tài)（0，1，2，3 mmol/L）加到濾紙上。每天加水保持濾紙濕潤(rùn)，室溫黑暗條件下培養(yǎng)5 d 后測(cè)量種子根伸長(zhǎng)量。

1.2.4 印度芥菜與抗鋅菌株聯(lián)合修復(fù)鋅污染土壤試驗(yàn)

1）土壤染毒處理。

供試土壤取自江蘇省無錫市15 cm 深的花園土，經(jīng)過風(fēng)干，研磨過2 mm 篩，然后121 ℃高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌15 min，土壤背景值如表1 所示。

土壤染毒處理根據(jù)文獻(xiàn)[11]操作。滅菌后的土壤風(fēng)干后做5 種處理：分別外加0、2、4、8、16 mmol/kg ZnSO4·7H2O 溶液，攪拌混合均勻，放置約一個(gè)月，使金屬穩(wěn)定，期間保持土壤濕潤(rùn)，含水率在60%左右。

表1 花園土的理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of garden soil

2）盆栽試驗(yàn)。

將印度芥菜種子浸在乙醇∶30% H2O2（1∶1）溶液中消毒15 min，后用蒸餾水洗滌兩次備用。試驗(yàn)均采用外口直徑18 cm，內(nèi)口直徑15.5 cm，高11 cm的花盆種植印度芥菜。每盆裝入處理后風(fēng)干的土壤2 kg，播種前，每種濃度土壤做接種菌和不接種菌兩種處理，共10 種處理，每種處理做3 組重復(fù)，使形成106cfu/g 的土壤。每盆播種經(jīng)過消毒處理的飽滿的印度芥菜種子10 粒，出苗后2、4、6 周再各接種一次相同濃度菌懸液，培養(yǎng)期間，用稀釋后的化肥施肥。生長(zhǎng)8 周后收獲植物，洗滌干凈，分為根和莖兩部分，80 ℃條件下烘箱烘24 h 至恒重，酸4∶1（HNO3∶HClO4）消解后用火焰原子吸收法測(cè)鋅含量。結(jié)果表示為μg/g 植物干重。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及差異顯著性檢驗(yàn)，然后用origin 9.0 作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 鋅抗性菌株對(duì)難溶性鋅的溶解作用

根際微生物從土壤中和植物分泌物中獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并通過其自身的代謝產(chǎn)物，如有機(jī)酸、氨基酸等促進(jìn)土壤重金屬的溶解[22]，提高土壤重金屬有效性，促進(jìn)植物吸收和富集，從而減少土壤中的重金屬。

圖1 為鋅抗性菌株BC109-2 對(duì)難溶態(tài)重金屬的溶解性，可以看出菌株BC109-2 在培養(yǎng)18 h 時(shí)，培養(yǎng)基中可溶性鋅含量有所降低，可能是由于細(xì)胞對(duì)Zn 的吸附作用從而暫時(shí)降低了培養(yǎng)液中可溶性鋅含量；18 h 后隨著細(xì)胞數(shù)量的增多，菌株代謝能力增強(qiáng)，培養(yǎng)液中可溶性鋅含量逐漸增加；并在培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到54～72 h 時(shí)，培養(yǎng)液中可溶性鋅含量增加的趨勢(shì)開始減緩。培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到72 h 時(shí)，與接種滅活菌的對(duì)照組相比，接種菌株BC109-2 的培養(yǎng)液中可溶性鋅含量增加了213%，同時(shí)菌株BC109-2降低了培養(yǎng)液中的pH，由最初的7.0 下降到了5.7，文獻(xiàn)[23]也發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌可以通過產(chǎn)有機(jī)酸酸化土壤環(huán)境，活化土壤中的重金屬，提高其生物有效性，從而促進(jìn)植物對(duì)重金屬的提取效率。菌株BC109-2 的培養(yǎng)液pH 降低說明其對(duì)鋅的活化作用主要是由代謝產(chǎn)酸引起的，因此該菌株對(duì)難溶態(tài)鋅具有較強(qiáng)的溶解能力。

圖1 菌株BC109-2 對(duì)堿式碳酸鋅的促溶作用Fig.1 Solubilization of ZnCO3 by strain BC109-2

2.2 菌株BC109-2 的促生特性

大量研究結(jié)果表明，植物體內(nèi)及根際土壤存在一些可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)的促生菌，它們能夠產(chǎn)生促植物生長(zhǎng)激素吲哚乙酸（IAA）[24]，1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）脫氨酶和鐵載體等物質(zhì)[25]，降低土壤中重金屬對(duì)植物的毒害作用，刺激植物根系的發(fā)育，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，從而增強(qiáng)植物對(duì)土壤中重金屬的富集效率[26]。

由表2 可知，菌株BC109-2 在不同鋅濃度下均具有ACC 脫氨酶活性，且隨著鋅濃度升高活力逐漸降低，培養(yǎng)基中無鋅存在時(shí)，酶活力最大為0.58 U/mg pro。該菌株具有分泌植物生長(zhǎng)素的能力，但能夠產(chǎn)生生長(zhǎng)素的量不大，其中在培養(yǎng)環(huán)境中鋅濃度為1 mmol/L 時(shí)產(chǎn)生量最大為1.504 mg/L。而文獻(xiàn)[27]篩選出的16 株菌株IAA 產(chǎn)量在0.78～30.48 mg/L之間，與已報(bào)道的產(chǎn)IAA 菌株相比，菌株BC109-2的產(chǎn)IAA 能力相對(duì)較弱。此外，菌株BC109-2 具有鐵載體產(chǎn)生能力，且在鋅濃度為0 的培養(yǎng)基中鐵載體產(chǎn)生能力達(dá)到2+水平。菌株BC109-2 在含有不同濃度鋅的PKO 培養(yǎng)基中溶磷能力差異較小，且在不含鋅的PKO 培養(yǎng)基中溶磷量達(dá)到最大值0.487 8 ug/mL。由此可見，鋅抗性菌株BC109-2 是一株能夠?yàn)橹参锾峁┑V質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素，同時(shí)能分泌植物激素、合成特異性酶的促生菌，其表現(xiàn)出的促生特性有可能促進(jìn)印度芥菜根系的生長(zhǎng)和植株的發(fā)育，為其聯(lián)合印度芥菜修復(fù)鋅污染土壤提供了依據(jù)。

表2 不同鋅濃度下菌株BC109-2 的促生特性Table 2 Promoting characteristics of the strain BC109-2 under different zinc concentrations

2.3 鋅抗性菌株對(duì)印度芥菜根伸長(zhǎng)量的影響

在一般情況下，根伸長(zhǎng)有助于提高植物富集土壤中重金屬的能力。根伸長(zhǎng)量是植物根際促生菌（PGPR）的重要指標(biāo)[28]。圖2 為不同鋅濃度下是否接種微生物菌株對(duì)印度芥菜種子5 d 的根伸長(zhǎng)量的影響。在沒有接種菌株的情況下，隨著鋅濃度的不斷增加，培養(yǎng)5 d 后，印度芥菜種子根伸長(zhǎng)量逐漸降低，表明重金屬鋅脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)有一定的抑制作用，且鋅濃度越高該抑制作用越強(qiáng)，這也與文獻(xiàn)[29]和文獻(xiàn)[30]的研究結(jié)果一致。

在接種根際促生菌BC109-2 后，與對(duì)照組相比，接種菌株BC109-2 的印度芥菜種子根伸長(zhǎng)量在不同鋅濃度（0，1，2，3 mmol/L）下分別增加了9.3%、4.14%、44.83%和9.78%，這說明根際促生菌BC109-2 可以促進(jìn)印度芥菜種子的根伸長(zhǎng)量，并且在鋅污染的脅迫下該菌株也可以緩解鋅對(duì)印度芥菜根伸長(zhǎng)的抑制作用。

鋅抗性菌株菌株BC109-2 在鋅污染脅迫下能夠產(chǎn)生IAA，而IAA 對(duì)誘導(dǎo)植物細(xì)胞的增殖與分化具有重要作用[31]，因而接種根際促生菌的印度芥菜種子的根伸長(zhǎng)量比對(duì)照組明顯，這不僅可以提高印度芥菜對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收效率，也可以促進(jìn)印度芥菜對(duì)土壤中重金屬鋅的富集與吸收。

圖2 不同鋅濃度下印度芥菜種子5 d 的根伸長(zhǎng)量Fig.2 Root lengths of Indian mustard cultivated in the absence or presence of zinc at various concentrations after germination for 5 d

2.4 鋅抗性菌株BC109-2 聯(lián)合印度芥菜修復(fù)鋅污染土壤效果研究

采用溫室盆栽實(shí)驗(yàn)觀察鋅抗性菌株BC109-2聯(lián)合印度芥菜修復(fù)鋅污染土壤的效果，結(jié)果如表3所示。結(jié)果顯示，5 組實(shí)驗(yàn)接種根際促生菌的地上部分（莖）干重與對(duì)照組相比分別增加了14.89%、12.90%、10.17%、11.37%和32.26%，地下部分（根）則分別增加了18.18%、65.60%、3.77%、0.13%和44.24%，說明菌株BC109-2 能夠促進(jìn)印度芥菜干生物量的增加。

不接種菌株BC109-2 時(shí)，印度芥菜富集土壤中重金屬鋅的結(jié)果顯示地上部分（莖）Zn 含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于地下部分（根），說明印度芥菜富集的鋅大部分集中于地上部分。接種菌株后，印度芥菜地上部分和地下部分鋅含量均有不同程度增加，這可能是因?yàn)榫闎C109-2 使印度芥菜生物量有所增加，從而使印度芥菜增富集污染土壤中重金屬鋅的量增加[32]。

另外，接種根際促生菌BC109-2 之后，與未接種的對(duì)照組相比，接種了促生菌的整株印度芥菜所富集的鋅含量分別是對(duì)照組的1.10、1.24、1.02、1.16和1.14 倍，說明了菌株BC109-2 對(duì)提高印度芥菜富集土壤中的鋅有明顯的促進(jìn)作用。一般來說，植物根際促生菌具有溶磷作用，能產(chǎn)生IAA 和鐵載體，具有ACC 脫氨酶活性，降低植株體內(nèi)乙烯的生成，提高植物對(duì)鋅的抗逆性[33]。菌株BC109-2 的促生實(shí)驗(yàn)和盆栽試驗(yàn)結(jié)果也證明了該菌株能夠促進(jìn)印度芥菜對(duì)鐵、磷的同化作用，促進(jìn)印度芥菜的生物量增加和對(duì)土壤中鋅的富集。

表3 鋅污染土壤中印度芥菜生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)Table 3 Growth of Indian mustard planted in zinc-contaminated soil

3 結(jié)語

本研究對(duì)從土壤中篩選純化得到的鋅抗性菌株BC109-2 進(jìn)行了促生特性研究，得出以下結(jié)論：1）在PDB 培養(yǎng)基（含1 000 mg/L ZnCO3）中培養(yǎng)72 h 后，菌株BC109-2 能使培養(yǎng)基上清液中鋅濃度增加了213%，培養(yǎng)液的pH 由初始的7.0 降低到5.7；說明該菌株對(duì)難溶態(tài)鋅具有較強(qiáng)的溶解能力，且該溶解性是由代謝產(chǎn)酸引起的；2）該菌株能產(chǎn)IAA 和鐵載體，并且具有ACC 脫氨酶活性和溶磷能力，充分表明菌株BC109-2 是一株根際促生菌；3）種子根伸長(zhǎng)量實(shí)驗(yàn)和盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，根際促生菌BC109-2 能促進(jìn)植物根系伸長(zhǎng)，伸長(zhǎng)率在4.14%～44.83%之間，同時(shí)使印度芥菜生物量得到不同程度的增加；4）盆栽實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，接種根際促生菌BC109-2 的印度芥菜對(duì)土壤中鋅的富集量提升了1.02～1.24 倍不等，說明了根際促生菌BC109-2 可以增加印度芥菜提取土壤中鋅的效率。

根際促生菌BC109-2 促進(jìn)植物吸收土壤中重金屬的機(jī)理還不清楚，對(duì)于根際微生物的作用機(jī)理以及重金屬生物有效性的影響因子等理論問題還有待進(jìn)一步研究，從而為重金屬污染土壤的植物與微生物聯(lián)合修復(fù)研究提供理論支撐。