膀胱癌中Galectin-3的表達(dá)及其對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響

張廣云，張海芳，喬明洲

安陽(yáng)市人民醫(yī)院泌尿外科 河南安陽(yáng) 455000

近些年來(lái)，膀胱癌的發(fā)病率呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，且患者有較高的復(fù)發(fā)率和病死率[1]。膀胱癌的發(fā)生發(fā)展與癌基因的激活及抑癌基因的失活密切相關(guān)。半乳凝素(Galectin)-3是Galectins家族中研究最多的一員，主要定位于細(xì)胞質(zhì)，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、周期調(diào)控、新生血管形成等過(guò)程[2]。多種人類腫瘤中Galectin-3呈現(xiàn)出過(guò)度表達(dá)，如肝癌、乳腺癌、肺癌，而其表達(dá)的抑制可抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[3-5]。Galectin-3對(duì)膀胱癌細(xì)胞的影響目前尚未明確。本研究旨在探討Galectin-3對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響，并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源收集2015年6月至2016年7月于安陽(yáng)市人民醫(yī)院接受手術(shù)切除治療的膀胱癌患者組織標(biāo)本54例，并取距腫瘤2 cm以上的癌旁正常組織作為對(duì)照組?；颊咧心?5例，女19例，年齡46～80(62.2±11.2)歲。術(shù)前所有患者均未行放療及化療，樣本的采集均經(jīng)過(guò)患者、家屬的知情同意。

1.2主要試劑和儀器NC-siRNA、Galectin-3-siRNA購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；CCK8試劑盒購(gòu)自日本Dojindo公司；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購(gòu)自南京凱基公司；Galectin-3、Notch1、Hes1、Cleaved Caspase-3、PCNA和Ki-67單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；PCR劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自Bio-Rad公司。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)SV-HUC-1、BIU-87、T24和5637細(xì)胞在含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清及青、鏈霉素雙抗的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基中，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2、95%飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.4Westernblot檢測(cè)Galectin-3、Notch1、Hes1、CleavedCaspase-3、PCNA和Ki-67的表達(dá)提取組織及細(xì)胞總蛋白。BCA法對(duì)總蛋白進(jìn)行定量后用Western blot方法檢測(cè)蛋白含量，其過(guò)程依次為點(diǎn)樣、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育(Galectin-3、Notch1、Hes1、Cleaved Caspase-3、PCNA、Ki-67和內(nèi)參GAPDH，1∶1 000稀釋)、洗膜、孵育HRP標(biāo)記的二抗(1∶1 000稀釋)、洗膜、ECL顯色、顯影、定影。采用Quantity One軟件分析目的蛋白及內(nèi)參GAPDH蛋白條帶灰度值，采用Image J軟件對(duì)蛋白灰度值進(jìn)行量化，以目的蛋白與GAPDH蛋白的灰度值比值作為各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染接種T24細(xì)胞至6孔板，每孔2 mL，細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，細(xì)胞分為NC-siRNA組(用非特異性siRNA干預(yù)細(xì)胞)、Galectin-3-siRNA1和Galectin-3-siRNA2組(用Galectin-3-siRNA干預(yù)細(xì)胞)，未轉(zhuǎn)染任何siRNA的細(xì)胞作為對(duì)照組。方法參照Invitrogen 公司的Lipofectamine 2000說(shuō)明。細(xì)胞轉(zhuǎn)染過(guò)程中使用無(wú)血清培養(yǎng)基，6 h后更換為正常的細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6Galectin-3siRNA轉(zhuǎn)染T24效果評(píng)價(jià)采用qRT-PCR及Western blot兩種方法。取轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞，提取細(xì)胞中的總RNA，紫外分光光度儀檢測(cè)提取的RNA質(zhì)量，反轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA。Oligo6軟件設(shè)計(jì)Galectin-3及內(nèi)參GAPDH的PCR引物，由上海生工生物工程有限公司合成。Galectin-3引物序列：上游5’-GCCACTGATTGTGCCTTAT-3’，下游5’-CTCATTGAAGCGTGGGTTA-3’；GAPDH引物序列：上游5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，下游5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。PCR擴(kuò)增條件及程序參照PCR試劑盒。每個(gè)樣品重復(fù)6次，根據(jù)所得Ct值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算Galectin-3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7細(xì)胞增殖檢測(cè)收集轉(zhuǎn)染Galectin-3-siRNA 12、24、48 h的T24細(xì)胞，同時(shí)設(shè)對(duì)照組和NC-siRNA組，加CCK-8試劑10 μL于每孔中，常規(guī)孵育4 h，490 nm波長(zhǎng)處采用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(A)值。每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(轉(zhuǎn)染組細(xì)胞A值/對(duì)照組細(xì)胞A值)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8細(xì)胞凋亡檢測(cè)收集轉(zhuǎn)染Galectin-3-siRNA 48 h的T24細(xì)胞，同時(shí)設(shè)對(duì)照組和NC-siRNA組，PBS洗滌及結(jié)合緩沖液重懸后，分別加Annexin-V-FITC 5 μL和PI 10 μL，避光室溫條件下靜置20 min，上機(jī)前再加400 μL結(jié)合緩沖液，1 h內(nèi)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。膀胱癌組織及癌旁正常組織Galectin-3相對(duì)表達(dá)量的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；各組間Galectin-3 siRNA轉(zhuǎn)染效果，細(xì)胞存活率，凋亡率及Notch1、Hes1、PCNA、Ki-67和Cleaved Caspase-3相對(duì)表達(dá)量的比較均采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1膀胱癌組織及細(xì)胞中Galectin-3蛋白的表達(dá)膀胱癌組織中Galectin-3蛋白的表達(dá)(0.389±0.042)高于癌旁正常組織(0.053±0.006)(t配對(duì)=16.937，P<0.001)。以人膀胱上皮永生化細(xì)胞SV-HUC-1作為對(duì)照，檢測(cè)膀胱癌T24、5637、BIU-87細(xì)胞中Galectin-3的表達(dá)，結(jié)果顯示T24、5637、BIU-87細(xì)胞中Galectin-3的表達(dá)水平均高于SV-HUC-1細(xì)胞中的表達(dá)，T24細(xì)胞中Galectin-3的表達(dá)水平最高，選擇該細(xì)胞用于后續(xù)研究。見圖1、表1。

1：癌旁正常組織；2：膀胱癌組織；3：SV-HUC-1細(xì)胞；4：T24細(xì)胞；5：5637細(xì)胞；6：BIU-87細(xì)胞

圖1 Galectin-3在膀胱癌組織(A)及細(xì)胞(B)中的表達(dá)

F=120.603，P<0.001；*：與SV-HUC-1細(xì)胞比較，P<0.05

2.2轉(zhuǎn)染后T24細(xì)胞中Galectin-3的表達(dá)結(jié)果見圖2、表2。可知，與對(duì)照組比較，NC-siRNA組Galectin-3 mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Galectin-3-siRNA1組和Galectin-3-siRNA2組與對(duì)照組比較，Galectin-3 mRNA表達(dá)降低，Galectin-3-siRNA1組的抑制效果更明顯，用于后續(xù)研究。

1：對(duì)照組；2：NC-siRNA組；3：Galectin-3-siRNA1組；4：Galectin-3-siRNA2組

圖2 Galectin-3 siRNA轉(zhuǎn)染后T24細(xì)胞中Galectin-3蛋白的表達(dá)

F=46.916，P<0.001；*：與對(duì)照組、NC-siRNA組比較，P<0.05

2.3抑制Galectin-3表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的影響結(jié)果見表3。可知，Galectin-3-siRNA組細(xì)胞在12、24和48 h的存活率均低于對(duì)照組。

表3 各組細(xì)胞存活率的比較(n=3) %

*：與對(duì)照組、NC-siRNA組比較，P<0.05

2.4抑制Galectin-3表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響各組細(xì)胞凋亡率見表4?？芍珿alectin-3-siRNA組細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組和NC-siRNA組。

表4 各組細(xì)胞凋亡率的比較 %

F=333.007，P<0.001；*：與對(duì)照組、NC-siRNA組比較，P<0.05

2.5抑制Galectin-3表達(dá)對(duì)Notch1信號(hào)及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見表5和圖3?？芍珿alectin-3-siRNA組Notch1、Hes1、PCNA和Ki-67表達(dá)低于對(duì)照組，Cleaved Caspase-3表達(dá)高于對(duì)照組。

表5 各組細(xì)胞Ki-67、PCNA、Cleaved Caspase-3、Notch1和Hes1蛋白表達(dá)的比較(n=3)

*：與對(duì)照組、NC-siRNA組比較，P<0.05

1：對(duì)照組；2：NC-siRNA組；3：Galectin-3-siRNA組

3 討論

Galectin-3是目前認(rèn)為與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的基因。Galectin-3定位于人類染色體14q21-22，可通過(guò)糖識(shí)別區(qū)域與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、細(xì)胞表面分子、細(xì)胞內(nèi)糖蛋白相互作用，從而參與細(xì)胞的增殖、凋亡及腫瘤進(jìn)展等過(guò)程[6]。細(xì)胞中Galectin-3的大量表達(dá)可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)而加快細(xì)胞增殖[7]。目前的研究[8]發(fā)現(xiàn)，Galectin-3在卵巢癌、惡性黑色素瘤等多種腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。本研究也檢測(cè)到Galectin-3在膀胱癌組織及細(xì)胞中有高表達(dá)。

RNA干擾是由雙鏈RNA介導(dǎo)的特異性同源靶基因轉(zhuǎn)錄后發(fā)生沉默的現(xiàn)象，可通過(guò)抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到治療的目的[9]。研究[10]顯示，RNA干擾技術(shù)抑制大腸癌細(xì)胞中Galectin-3的表達(dá)后可使癌細(xì)胞增殖減慢，凋亡增加。惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Galectin-3呈現(xiàn)高表達(dá)，轉(zhuǎn)染siRNA可降低Galectin-3的表達(dá)，且Galectin-3表達(dá)的抑制可明顯降低細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]。Ki-67位于人類基因10q25，是反映細(xì)胞增殖活性的關(guān)鍵指標(biāo)[12]。PCNA的表達(dá)可影響細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)、侵襲及DNA合成，是細(xì)胞增殖活性檢測(cè)的一個(gè)有效標(biāo)志物[13]。Caspase-3是Caspase家族的成員之一，其活化可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[14]。目前Ki-67、PCNA、Caspase-3等的作用已在膀胱癌中得到證實(shí)[15]。有研究[16]顯示，Galectin-3表達(dá)可調(diào)節(jié)癌細(xì)胞Ki-67、PCNA、Caspase-3表達(dá)，從而影響癌細(xì)胞生長(zhǎng)。本研究結(jié)果顯示，膀胱癌細(xì)胞中Galectin-3表達(dá)抑制對(duì)癌細(xì)胞增殖有抑制作用，且可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、下調(diào)PCNA、Ki-67表達(dá)，上調(diào)Cleaved Caspase-3表達(dá)。

Notch信號(hào)由Notch受體、Notch配體、Notch調(diào)節(jié)分子、DNA結(jié)合蛋白、細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)分子等組成，在許多器官及組織的正常生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中有關(guān)鍵作用，可通過(guò)一系列過(guò)程激活下游一些靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮生物學(xué)作用[17-18]。研究[19-21]表明，多種人類腫瘤中Notch信號(hào)通路處于激活狀態(tài)，如膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌等。Galectin-3可調(diào)控Notch信號(hào)通路，影響腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[22]。本研究結(jié)果顯示，膀胱癌細(xì)胞中Galectin-3表達(dá)抑制可下調(diào)Notch1及Hes1表達(dá)。

綜上所述，抑制膀胱癌中Galectin-3表達(dá)可明顯降低細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與Notch信號(hào)的下調(diào)有關(guān)。該研究結(jié)果提示Galectin-3可能是膀胱癌診療的有效靶點(diǎn)，但還需更多研究證實(shí)。