高糖環(huán)境對大鼠髓核細胞基質(zhì)代謝的影響

田文葭，李 琰，倪海祥

1)浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科 杭州 310006 2)浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院骨科 杭州 310009

椎間盤突出與糖尿病均是困擾現(xiàn)代人群的常見疾病，以往認為兩者是互相獨立的疾病，而近年來的多項研究[1-2]均表明，兩者之間存在密切聯(lián)系。椎間盤退變的主要病理特征為細胞外基質(zhì)(蛋白聚糖和Ⅱ型膠原)的降解增加以及合成減少。而糖尿病作為一種全身性的代謝疾病，除了會損害常見的靶器官如視網(wǎng)膜、腎臟、大血管、神經(jīng)，也會對眼肌、骨、腦、乳腺等器官組織造成損害[3-4]。腰椎及頸椎間盤突出癥患者患糖尿病的比例較其他疾病患者明顯升高[1-2]，糖尿病伴腰椎間盤突出癥患者髓核中的蛋白多糖含量較單純腰椎間盤突出癥患者顯著降低[5]。這些研究在一定程度上解釋了糖尿病患者更容易發(fā)生椎間盤突出的原因，但是都沒有分析具體機制。Zhang等[6]、Cheng等[7]的研究證實了高糖環(huán)境與髓核細胞凋亡、自噬相關(guān)，然而對髓核細胞基質(zhì)代謝與糖尿病的關(guān)系仍缺乏研究。本文分析了高糖環(huán)境對大鼠髓核細胞生長、基質(zhì)降解酶(MMP-3、MMP-13和ADAMTs)表達、基質(zhì)成分Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚糖表達的影響，以期明確葡萄糖濃度與髓核細胞基質(zhì)代謝之間的關(guān)系，旨在進一步探討糖尿病與椎間盤退變之間的可能聯(lián)系及作用機制。

1 材料與方法

1.1大鼠髓核細胞的分離與培養(yǎng)4～6周齡SD大鼠30只，雌雄對半，購自上海交通大學(xué)實驗動物中心，許可證號：SCXK(滬)2013-0021，飼養(yǎng)于全屏障清潔級動物實驗房內(nèi)。大鼠腹腔注射戊巴比妥(150 mg/kg)，處死，剪去背部毛發(fā)，絡(luò)合碘消毒后，沿棘突正中切口切開至脊柱，剝離椎旁肌，鈍性分離脊柱，咬除肋骨，完整分離胸椎下段及腰椎。將分離的胸、腰椎移至無菌操作臺內(nèi)，用尖刀切開纖維環(huán)，用顯微鑷挑出完整髓核組織，PBS清洗3遍，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管內(nèi)，加入2.5 g/L胰蛋白酶-EDTA消化液于37 ℃水浴中消化5 min，加入含血清DMEM培養(yǎng)液終止消化，1 000 r/min離心5 min，棄上清。再次加入2 g/LⅡ型膠原酶于37 ℃水浴中消化100 min，加入含血清DMEM培養(yǎng)液終止消化。用200目無菌不銹鋼濾網(wǎng)過濾后，將濾液移至離心管，1 000 r/min離心5 min，棄上清。使用DMEM培養(yǎng)液重懸細胞，計數(shù)后將細胞以3×108個/L接種至直徑為10 cm的培養(yǎng)皿中。

1.2實驗材料與儀器倒置顯微鏡(德國LEICA公司)，PCR儀(美國THERMO公司)，DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(美國Hyclone公司)，CCK-8試劑盒(日本同仁化學(xué)公司)，Trizol試劑(美國Invitrogen公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒(日本TAKARA)，ELISA檢測試劑盒(上海邦奕公司)，免疫組化試劑盒及Ⅱ型膠原蛋白一抗(武漢博士德公司)，MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4一抗(美國CST公司)，P38、磷酸化P38(p-P38)、GAPDH一抗(美國Abcam公司)。

1.3不同濃度葡萄糖作用后髓核細胞的生長情況大鼠髓核細胞貼壁后在光鏡下觀察。取2～3代細胞，重懸后以5×103個/孔的密度種于96孔板中，使用含不同濃度(5、15、25 mmol/L)葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h，每24 h使用CCK-8試劑盒檢測1次細胞增殖情況。檢測時，移除96孔板內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入CCK-8溶液10 μL，室溫下孵育2 h,使用酶標儀檢測450 nm處的吸光度。每個濃度設(shè)5個復(fù)孔。實驗重復(fù)3次。

1.4不同濃度葡萄糖作用后髓核細胞中Ⅱ型膠原蛋白、蛋白聚糖mRNA的檢測將髓核細胞以1×105個/mL的密度種于6孔板中，用含不同濃度(5、15、25 mmol/L)葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。吸棄培養(yǎng)液，PBS洗3遍。使用Trizol法提取總RNA，DEPC水溶解，使用紫外分光光度計檢測RNA濃度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，冰上操作，每1 μg RNA加入4 μL反轉(zhuǎn)錄混合試劑，補DEPC水使總體積至20 μL，然后按照37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s的條件行反轉(zhuǎn)錄。以制備的cDNA為模板,以GAPDH為內(nèi)參基因，進行Real-time PCR。使用BLAST設(shè)計引物(表1)。冰上操作配置20 μL PCR反應(yīng)體系：SYBR酶10 μL、上下游引物各0.4 μL、ROX Dye Ⅱ 0.4 μL、DNA模板2.0 μL、DEPC水6.8 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃34 s，共40個循環(huán)；溶解曲線：95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s。使用2-ΔΔCT法計算目的mRNA表達水平。實驗重復(fù)3次。

表1 引物列表

1.5不同濃度葡萄糖作用后髓核細胞中MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4、P38及p-P38蛋白的檢測將髓核細胞以1×105個/mL的密度種于6孔板中，使用含不同濃度(5、15、25 mmol/L)葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。吸棄培養(yǎng)基，使用RIPA裂解細胞并提取總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。配置100 g/L SDS-PAGE凝膠，加入蛋白樣品及Marker，80 V恒壓電泳2 h，切下凝膠，冰浴下恒流(0.25 A)轉(zhuǎn)膜2 h。50 g/L脫脂牛奶室溫封閉1 h，然后加入按1∶1 000稀釋的MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4、P38及p-P38一抗4 ℃孵育過夜，加入按1∶5 000稀釋的二抗室溫孵育1 h。以GAPDH作為內(nèi)參，實驗重復(fù)3次。使用Odyssey的紅外成像系統(tǒng)(LI-COR)檢測蛋白條帶并進行定量分析。

1.6不同濃度葡萄糖作用后髓核細胞培養(yǎng)液中Ⅱ型膠原交聯(lián)羧基端肽(CTX-Ⅱ)質(zhì)量濃度測定將髓核細胞以1×105個/mL的密度種于6孔板中，用含不同濃度(5、15、25 mmol/L)葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。取培養(yǎng)液1 mL，4 000 r/min離心5 min后取上清,使用CTX-Ⅱ ELISA試劑盒檢測CTX-Ⅱ質(zhì)量濃度。實驗重復(fù)3次。

1.7不同濃度葡萄糖作用后髓核細胞中Ⅱ型膠原蛋白的檢測制備髓核細胞爬片，在含不同濃度(5、15、25 mmol/L )葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基中生長5 d，取出細胞爬片，用PBS清洗，以多聚甲醛固定30 min；再次用PBS清洗，用Triton X-100處理10 min，用體積分數(shù)3% H2O2處理5 min。PBS清洗，加入按1∶200稀釋的Ⅱ型膠原蛋白一抗4 ℃孵育過夜，加入二抗室溫孵育1 h。DAB顯色，PBS沖洗，脫水，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察并拍照。使用Image-Pro Plus 6.0 分析染色結(jié)果，以積分光密度(IOD)值表示目的蛋白表達水平。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS21.0進行數(shù)據(jù)分析，3組細胞各指標的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠髓核細胞的生長狀況大鼠髓核細胞貼壁后在光鏡下呈不規(guī)則多邊形，細胞折光性好，隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞周圍可見基質(zhì)樣物質(zhì)沉積。第1～3代髓核細胞活力較佳，生長快，約5 d可以達到90%融合。從第4代開始細胞逐漸出現(xiàn)退變現(xiàn)象，細胞呈長梭形，體積縮小，基質(zhì)樣物質(zhì)減少，細胞生長減緩，細胞間隙減小，逐漸向類成纖維細胞發(fā)展(圖1)。本實驗選取第2～3代細胞進行CCK-8增殖實驗，結(jié)果(圖1)顯示： 25 mmol/L組的髓核細胞生長較5、15 mmol/L組減緩(P<0.001)。

*：與5、15 mmol/L組比較，P<0.001

2.2 3組大鼠髓核細胞蛋白聚糖mRNA、Ⅱ型膠原蛋白mRNA和蛋白及CTX-Ⅱ質(zhì)量濃度的比較見圖 2、表2。培養(yǎng)24 h后25 mmol/L組細胞Ⅱ型膠原蛋白、蛋白聚糖mRNA表達水平較5、15 mmol/L組降低(P<0.05)。培養(yǎng)48 h后25 mmol/L組細胞培養(yǎng)液中CTX-Ⅱ質(zhì)量濃度較5、15 mmol/L組增加(P<0.05)。培養(yǎng)5 d后，Ⅱ型膠原蛋白免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，3組均陽性染色，25 mmol/L組細胞的IOD值較其他兩組降低(P<0.05)。

A:5 mmol/L組；B:15 mmol/L組；C:25 mmol/L組

組別nⅡ型膠原蛋白mRNA蛋白聚糖mRNAⅡ型膠原蛋白ρ(CTX-Ⅱ)/(μg/L)5 mmol/L組30.98±0.021.01±0.0611.58±0.920.82±0.1315 mmol/L組31.04±0.090.96±0.0811.28±0.930.71±0.1525 mmol/L組30.81±0.06*#0.82±0.04*4.23±0.13*#1.16±0.06*#F10.5877.52690.107 11.519P0.0110.023<0.001 0.009

*：與5 mmol/L比較，P<0.05；#：與15 mmol/L比較，P<0.05

2.3 3組髓核細胞中MMP-3、MMP-13和ADAMTS-4表達水平的比較見圖3和表3。25 mmol/L組細胞MMP-3、MMP-13表達水平較5、15 mmol/L組升高，而3組ADAMTS-4表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖3 3組細胞中基質(zhì)降解酶的表達

組別nMMP-3MMP-13ADAMTS-45 mmol/L組30.28±0.050.38±0.040.55±0.0515 mmol/L組30.30±0.020.40±0.020.53±0.0425 mmol/L組30.47±0.05*#0.50±0.01*#0.49±0.04F18.16717.7141.474P0.0030.0030.302

*：與5 mmol/L比較，P<0.05；#：與15 mmol/L比較，P<0.05

2.4 3組髓核細胞中P38磷酸化水平的比較Western blot結(jié)果見圖4。培養(yǎng)24 h后，5、15、25 mmol/L組p-P38/P38分別為(0.10±0.01)、(0.17±0.01)和(0.63±0.09),3組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=89.892,P<0.001)；25 mmol/L組細胞P38磷酸化水平較其他2組升高(P<0.001)。

圖4 3組細胞P38、p-P38的表達

3 討論

椎間盤是人體內(nèi)最大的無血供組織，主要通過兩種方式獲取營養(yǎng)物質(zhì)，其一為終板途徑(主要通過軟骨終板擴散營養(yǎng)物質(zhì))，其二為纖維環(huán)途徑(主要通過纖維環(huán)表面的血管來傳送營養(yǎng)物質(zhì))，因此椎間盤內(nèi)的髓核細胞長期在低糖、低氧的環(huán)境中生長。葡萄糖是椎間盤的主要供能物質(zhì)，已有研究[8]表明，椎間盤內(nèi)的葡萄糖主要通過濃度梯度擴散進行運輸，這也就意味著血糖升高勢必造成椎間盤內(nèi)葡萄糖濃度隨之升高。高濃度的葡萄糖可能導(dǎo)致椎間盤內(nèi)乳酸堆積，進而誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而抑制髓核細胞的增殖以及促使髓核細胞凋亡[7]。另一項體外實驗[9]也證實，高濃度葡萄糖對髓核細胞的增殖有顯著的抑制作用。本研究中體外分離培養(yǎng)的大鼠髓核細胞在貼壁后增殖迅速，在使用25 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)48 h后，髓核細胞的增殖明顯受抑，且隨著時間的延長，抑制作用逐漸加強；而15、5 mmol/L濃度的葡萄糖對大鼠髓核細胞增殖的影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義；提示髓核細胞對葡萄糖濃度存在耐受閾值，超過這個閾值后其增殖會受到抑制，而在此閾值之下增殖并未受到明顯影響。

在正常椎間盤中，細胞外基質(zhì)處于不斷降解和合成的動態(tài)平衡中?；|(zhì)降解酶與其抑制劑的表達失衡是椎間盤退變的重要原因之一[10-11]。在椎間盤中，MMP和ADAMTS是主要的基質(zhì)降解酶。研究[12-14]發(fā)現(xiàn)，血糖升高會導(dǎo)致血清MMP水平增高，從而影響MMP與其抑制劑TIMP的平衡，進而增強細胞外基質(zhì)的降解。Won等[15]發(fā)現(xiàn)糖尿病模型大鼠椎間盤組織內(nèi)MMP的表達較非糖尿病大鼠顯著增強，從而間接證實糖尿病與椎間盤退變存在聯(lián)系。我們的研究結(jié)果也顯示：25 mmol/L組的髓核細胞MMP-3和MMP-13表達上升，同時細胞培養(yǎng)液中CTX-Ⅱ質(zhì)量濃度增加；而ADAMTS-4的表達并無明顯變化。這提示我們，高糖環(huán)境對基質(zhì)降解酶的調(diào)控主要針對MMP。不僅如此，高糖環(huán)境對髓核細胞的基質(zhì)合成也可能存在一定影響。Robinson等[5]發(fā)現(xiàn)，合并糖尿病的腰椎間盤突出癥患者髓核中蛋白聚糖的含量較非糖尿病患者減少。作為髓核組織細胞外基質(zhì)的主要成分之一，蛋白聚糖的減少與基質(zhì)含量減少直接相關(guān)。我們的研究也證實高糖環(huán)境能夠顯著減少大鼠髓核細胞Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚糖mRNA的表達。結(jié)合上述研究結(jié)果，我們認為高糖環(huán)境可以通過抑制基質(zhì)合成及增加基質(zhì)降解兩條途徑來減少髓核細胞胞外基質(zhì)含量。

P38是MAPK信號通路的成員之一，已有研究[16-17]證實其與椎間盤基質(zhì)代謝關(guān)系密切；P38抑制劑能夠顯著改善由炎癥因子引起的基質(zhì)分解增加與合成下降。Cheng等[7]證實高糖環(huán)境能夠誘發(fā)大鼠髓核細胞P38磷酸化，進而引起細胞氧化應(yīng)激和凋亡增加。我們也發(fā)現(xiàn)25 mmol/L組大鼠髓核細胞中P38磷酸化水平提高。這一結(jié)果與髓核細胞的基質(zhì)變化相符，提示P38在髓核細胞對高糖環(huán)境的反應(yīng)中起了重要作用。

綜上所述，高濃度葡萄糖可抑制大鼠髓核細胞的生長，并通過抑制基質(zhì)合成及增加基質(zhì)降解兩條途徑來減少髓核細胞胞外基質(zhì)含量，從而導(dǎo)致椎間盤的退變；這一變化可能與P38磷酸化程度有密切關(guān)系。未來可以針對這一方向展開進一步研究，從而明確高糖環(huán)境對髓核細胞基質(zhì)代謝調(diào)控的具體作用機制。