異甘草素對小兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)特性及PI3K/AKT信號(hào)通路的影響

李 燕，張瑞麗

1)鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院(河南省兒童醫(yī)院；鄭州兒童醫(yī)院)藥學(xué)部 鄭州 450000 2)中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院藥學(xué)部 北京 100102

血管瘤是一種常發(fā)生于嬰幼兒皮膚和軟組織的先天性良性腫瘤或血管畸形，大部分可自行消退，但也有一少部分因生長在特殊部位或體積過大等因素影響到組織或器官功能，甚至危及生命。血管瘤常見的治療方法如手術(shù)切除、藥物治療和硬化治療等均不能達(dá)到理想的治療效果，因此尋找安全有效的治療手段一直是血管瘤臨床研究的熱點(diǎn)。血管瘤以血管內(nèi)皮細(xì)胞增生為主，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的過度增殖對血管瘤的治療具有重要意義。異甘草素是一種從中草藥甘草中提取的黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎和抗腫瘤等藥理活性，其抗腫瘤活性已引起人們的重視[1-2]。PI3K/AKT信號(hào)通路是血管形成的重要調(diào)節(jié)途徑，在血管瘤中異?；罨痆3]。近年來有研究[4-6]報(bào)道，異甘草素具有抗血管生成的作用，并能夠抑制實(shí)體瘤中PI3K/AKT信號(hào)通路激活，但其對小兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)行為和PI3K/AKT信號(hào)通路的影響尚不清楚。本研究旨在探討異甘草素對小兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞生長、侵襲和凋亡的影響及其機(jī)制，以期為兒童血管瘤的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1材料小兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞購自大連美侖生物公司。異甘草素購于美國Sigma公司，純度≥98%，使用時(shí)以DMSO溶解。RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基購于美國Gibco公司，胎牛血清購于杭州四季青生物公司，MTT試劑購于美國Promega公司，DMSO購于美國Sigma公司，RIPA裂解液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和細(xì)胞周期檢測試劑盒均購于中國碧云天生物技術(shù)研究所，Annexin V-FITC/PI試劑盒購于凱基生物公司，CyclinB1、Bax、MMP-9和p-Akt抗體均購于美國Abcam公司，Cleaved Caspase-3抗體購于武漢博士德公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG抗體購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。流式細(xì)胞儀購于美國BD Pharmingen公司，倒置顯微鏡購于日本Olympus公司，Transwell小室購于美國Coming公司，全自動(dòng)酶標(biāo)儀和細(xì)胞培養(yǎng)箱購于美國Thermo公司，轉(zhuǎn)膜儀購于美國Bio-RAD公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)小兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)蘇后，用含100 U/mL青鏈霉素雙抗和體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后，每2 d換液一次，待細(xì)胞鋪滿瓶底75%左右時(shí)，以胰蛋白酶消化傳代。

1.3細(xì)胞活力檢測取96孔細(xì)胞板，以每孔100 μL接種處于對數(shù)生長期的小兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，細(xì)胞密度為2×105個(gè)/mL，設(shè)對照組和低、中、高濃度異甘草素組，分別用0、20、40和80 μmol/L異甘草素處理，每組6個(gè)平行孔，另設(shè)1個(gè)只含有培養(yǎng)基的空白調(diào)零孔。于培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)24、48和72 h后，加入5 g/L MTT溶液200 μL。再培養(yǎng)4 h后，加入120 μL DMSO反應(yīng)10 min。上酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞在490 nm處的吸光度(A)值，細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組A-空白A)/(對照組A-空白A)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，下同。

1.4細(xì)胞侵襲能力的檢測收集上述培養(yǎng)72 h的各組細(xì)胞，經(jīng)2.5 g/L胰蛋白酶消化后，更換為無血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)設(shè)備計(jì)數(shù)。取Matrigel基質(zhì)膠包被的Transwell小室，在下室中加入500 μL完全培養(yǎng)基，上室中加入400 μL含105個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出。用磷酸鹽緩沖液洗滌上層小室，晾干后于預(yù)冷的甲醇中固定30 min。去甲醇并洗滌后，加入結(jié)晶紫染色20 min。洗滌晾干后，于倒置顯微鏡下觀察。選取6個(gè)區(qū)域計(jì)數(shù)細(xì)胞，細(xì)胞侵襲能力以6個(gè)區(qū)域細(xì)胞數(shù)的平均數(shù)來表示。

1.5細(xì)胞周期和凋亡檢測取生長良好的小兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，以每孔2×105個(gè)/mL的密度接種至6孔細(xì)胞板，每孔100 μL。按照1.3中的分組處理細(xì)胞72 h，以胰蛋白酶消化后，加入500 μL 完全培養(yǎng)基終止消化，轉(zhuǎn)移至離心管中，1 000 r/min離心5 min。經(jīng)磷酸鹽緩沖液洗滌3遍后，分別參照試劑盒說明書的步驟檢測細(xì)胞周期和凋亡。

1.6PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)分子mRNA的檢測采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。收集培養(yǎng)72 h后的各組細(xì)胞，采用Trizol法提取總RNA。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒以總RNA為模板合成cDNA。配制含有2 μL cDNA、8.5 μL ddH2O、12.5 μL SYBP Premix Ex Taq和各1 μL上下游引物的反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性60 s；95 ℃變性15 s，52～62 ℃退火20 s，72 ℃延伸70 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA的相對表達(dá)量。其中，由上海生工生物工程股份有限公司合成的各引物序列見表1。

1.7PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)分子蛋白的檢測采用Western blot檢測。收集培養(yǎng)72 h后的各組細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取總蛋白，并根據(jù)BCA蛋白檢測試劑盒測定提取總蛋白的濃度。取60 μg總蛋白與蛋白上樣緩沖液(體積比5∶1)混勻后置于95 ℃下反應(yīng)10 min。采用移液槍將蛋白上樣至 SDS-PAGE凝膠中以80 V電壓電泳2 h。轉(zhuǎn)膜后，放入含去脂奶粉的封閉液中反應(yīng)1.5 h。以封閉液洗滌后，加入Cleaved Caspase-3(1∶800稀釋)、Bax(1∶500稀釋)、CyclinB1(1∶500稀釋)、MMP-9(1∶1 000稀釋)和p-AKT(1∶5 000稀釋)抗體，4 ℃搖床孵育24 h。以封閉液洗滌后，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，37 ℃反應(yīng)1.5 h。洗膜后，加入ECL顯影，凝膠成像系統(tǒng)收集圖片，以β-actin為內(nèi)參，校正目的蛋白的相對表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

F:上游引物；R：下游引物

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 22.0處理數(shù)據(jù)。采用3×4析因設(shè)計(jì)的方差分析比較不同濃度的異甘草素處理不同時(shí)間對細(xì)胞存活率的影響，多組間其他指標(biāo)的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 4組細(xì)胞存活率的比較隨異甘草素作用濃度的增加和作用時(shí)間的延長，小兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞存活率降低，見表2。

2.2 4組細(xì)胞侵襲能力的比較處理72 h后，對照組侵襲細(xì)胞數(shù)為(165.25±8.52)，低、中、高濃度異甘草素組侵襲細(xì)胞數(shù)減少，分別為(137.82±6.35)、(87.65±5.80)和(54.37±5.05)(F=18.847，P=0.002)。

表2 4組細(xì)胞存活率的比較(n=3) %

F組間=226.648，P<0.001；F時(shí)間=30.221，P<0.001；F交互=5.105，P=0.002

2.3 4組細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡情況比較處理72 h后，隨異甘草素作用濃度的升高，G0/G1期細(xì)胞百分比逐漸降低，而G2/M期細(xì)胞百分比逐漸升高。同時(shí)，異甘草素能夠呈濃度依賴性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。見表3。

表3 4組細(xì)胞周期分布和凋亡率的比較(n=3) %

*：組間兩兩比較，P<0.05

2.4 4組細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)分子mRNA及蛋白表達(dá)的比較見圖1。隨異甘草素作用濃度的增加，Cleaved Caspase-3、Bax mRNA表達(dá)水平逐漸升高，而CyclinB1、MMP-9、p-AKT mRNA表達(dá)水平逐漸下降，見表4。PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)分子蛋白的表達(dá)結(jié)果與mRNA一致，見表5。

1～4：分別為對照組和低、中、高濃度異甘草素組

組別Cleaved Caspase-3*Bax*CyclinB1MMP-9*p-AKT*對照組1.00±0.071.16±0.123.78±0.623.62±0.562.66±0.39低濃度異甘草素組1.38±0.121.85±0.362.85±0.452.75±0.382.08±0.35中濃度異甘草素組1.79±0.162.67±0.281.89±0.30#1.89±0.451.32±0.21高濃度異甘草素組2.25±0.283.58±0.551.02±0.12#△1.00±0.200.83±0.06F28.123 24.969 24.710 21.711 30.244 P<0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

*：組間兩兩比較，P<0.05；#:與對照組和低濃度異甘草素組比較，P<0.05；△：與中濃度異甘草素組比較，P<0.05

表5 4組細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)分子蛋白的相對表達(dá)量(n=3)

*：組間兩兩比較，P<0.05；#:與對照組和低濃度異甘草素組比較，P<0.05；△：與中濃度異甘草素組比較，P<0.05

3 討論

血管瘤的治療一直是臨床上的棘手問題，手術(shù)切除治療雖然效果較好，但在一些特殊器官如眼、鼻和耳等不宜開展，因此尋找安全有效的治療藥物一直是血管瘤研究的熱點(diǎn)。甘草是一種補(bǔ)益中草藥，具有祛痰止咳、補(bǔ)中益氣、緩急止痛、解毒和調(diào)和諸藥等功效。異甘草素是從甘草根分離出來的黃酮類化合物，其抗腫瘤活性在腫瘤治療領(lǐng)域備受關(guān)注。Peng等[7]發(fā)現(xiàn)，異甘草素通過降低miR-37a增加PTEN的表達(dá)，抑制AKT信號(hào)，發(fā)揮抗乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移的作用。Chen等[8]在卵巢癌中也證實(shí)異甘草素能夠呈濃度、時(shí)間依賴性抑制腫瘤細(xì)胞的活力，誘導(dǎo)G2/M期阻滯和細(xì)胞凋亡。此外，異甘草素也表現(xiàn)出較好的抗血管生成的作用。Ji等[5]研究指出，異甘草素通過抑制軟骨下骨的骨吸收和血管生成延緩骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展；王志強(qiáng)等[9]發(fā)現(xiàn)，異甘草素可抑制人微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞阻滯于S期并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。然而，異甘草素對血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的影響未見報(bào)道。本研究以20、40和80 μmol/L的異甘草素處理體外培養(yǎng)的小兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，采用常規(guī)生物學(xué)手段檢測細(xì)胞生長、侵襲、凋亡以及細(xì)胞周期變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，異甘草素能夠呈時(shí)間、濃度依賴性抑制小兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的生長，并呈濃度依賴性抑制其侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞阻滯于G2/M期。這一結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了異甘草素抗腫瘤的廣譜性。

腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移有賴于腫瘤血管的生成，而腫瘤血管生成的過程是一個(gè)受多種基因和信號(hào)通路共同調(diào)控的復(fù)雜過程，PI3K/AKT通路是該過程中一條重要的信號(hào)通路。AKT是PI3K/AKT信號(hào)通路的核心蛋白，活化的AKT可通過直接或間接介導(dǎo)下游相關(guān)蛋白參與腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)過程，調(diào)控腫瘤血管生成[10-12]；CyclinB1是一種G2期周期蛋白，在細(xì)胞從G2進(jìn)入M期過程中發(fā)揮促進(jìn)作用。Bax是Bcl-2基因家族中的促凋亡基因，可與抑凋亡基因Bcl-2形成異二聚體，抑制Bcl-2 產(chǎn)生，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；Caspase-3是公認(rèn)的細(xì)胞凋亡執(zhí)行因子，Caspase-9的活化可激活下游Caspase-3引起細(xì)胞凋亡；MMP-9是MMPs家族成員，在維持細(xì)胞外基質(zhì)降解和重塑過程中發(fā)揮著重要作用，與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移關(guān)系密切；同時(shí)，CyclinB1、Bax、Caspase-9和MMP-9均是AKT下游相關(guān)靶基因，也均在血管瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[13-15]。此外，吉毅等[16]指出PI3K/AKT信號(hào)通路在嬰幼兒血管瘤中異?；罨种芇I3K/AKT通路能夠明顯促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。Huang等[6]研究已證實(shí)異甘草素可通過阻斷PI3K/AKT信號(hào)通路抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和凋亡。本研究結(jié)果顯示，異甘草素處理后小兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞中Cleaved Caspase-3和Bax表達(dá)均升高，而CyclinB1、MMP-9和p-AKT表達(dá)均降低。這一結(jié)果與前人[3,17-18]發(fā)現(xiàn)的異甘草素可通過下調(diào)CyclinB1表達(dá)誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞周期阻滯在S和G2/M期，下調(diào)MMP-9蛋白的表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞的侵襲，上調(diào)Caspase-3和Bax表達(dá)可誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡的結(jié)果相吻合。提示異甘草素可能通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的活化發(fā)揮抑制血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞生長、侵襲和促進(jìn)凋亡的作用。

綜上所述，異甘草素可抑制小兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞生長和侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與抑制PI3K/AKT信號(hào)通路活化有關(guān)。這一研究結(jié)果為異甘草素用于臨床治療小兒血管瘤提供了理論依據(jù)。