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(1.日本國(guó)際農(nóng)林水產(chǎn)業(yè)研究中心,日本 茨城305-8686; 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100083)
影響熱帶地區(qū)家畜生產(chǎn)的主要因素是飼料短缺,特別是在旱季表現(xiàn)極為明顯[1]。在熱帶地區(qū),反芻家畜粗飼料的主要來(lái)源是天然牧草和農(nóng)作物副產(chǎn)品。用劣質(zhì)的粗飼料飼喂牛,會(huì)導(dǎo)致牛奶和肉品質(zhì)下降[2]。近年,許多飼料作物、牧草和農(nóng)作物副產(chǎn)品的應(yīng)用技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用,并且有學(xué)者對(duì)它們的各種生產(chǎn)條件、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和動(dòng)物生產(chǎn)性能進(jìn)行了深入研究[3]。通常,熱帶農(nóng)作物只有在雨季才能生長(zhǎng)良好[4]。就飼料與動(dòng)物生產(chǎn)系統(tǒng)而言,熱帶地區(qū)的飼料的制備應(yīng)在雨季作物收獲之后,有效利用其秸稈資源調(diào)制青貯,并可長(zhǎng)期貯藏為干旱季節(jié)備用,從而為反芻動(dòng)物提供新鮮的青貯飼料;因此,青貯飼料的調(diào)制和貯藏技術(shù)被認(rèn)為是解決熱帶地區(qū)動(dòng)物飼料短缺問(wèn)題的有效途徑[5]。
玉米(ZeamaysL.)秸稈和甘蔗(SaccharumofficinarumL.)秸稈是熱帶地區(qū)主要的農(nóng)作物副產(chǎn)品,通常收獲后被丟棄在田間,干燥后進(jìn)行焚燒處理或者當(dāng)做肥料使用[6]。玉米是一種分布極為廣泛的農(nóng)作物,作為糧食作物進(jìn)行收獲時(shí),植株莖、葉和穗軸部分占玉米全株干物質(zhì)的40%[7]。甘蔗上部秸稈是糖類(lèi)作物生產(chǎn)的主要副產(chǎn)品,占甘蔗全株干物質(zhì)中的15%~25%[8],在熱帶地區(qū),玉米秸稈和甘蔗秸稈是廉價(jià)而蘊(yùn)藏量極大的飼料資源,可作為新鮮或者干燥的秸稈飼料飼喂家畜。
飼料作物在青貯發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生乳酸抑制有害微生物的繁殖,從而使青貯飼料得到很好的保存。通常,熱帶牧草或飼料作物在青貯過(guò)程中存在含水量高和可溶性糖含量低的問(wèn)題,會(huì)影響高品質(zhì)飼料的調(diào)制和保藏[9]。隨著生物添加劑(如乳酸菌接種劑和纖維素酶)的開(kāi)發(fā)和利用,青貯飼料的技術(shù)革新受到廣泛關(guān)注。顯然,這些青貯添加劑可以有效地提高發(fā)酵品質(zhì)和貯藏效率,并且可提高家畜的生產(chǎn)性能。理論上講,纖維素酶可以提高纖維的降解效率,增加可溶性糖的含量,使其作為乳酸菌發(fā)酵的底物而產(chǎn)生更多的乳酸,從而使飼料作物的pH值顯著下降,使青貯飼料得到有效的保存[10]。
為了有效地利用非洲本地飼料資源,生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)并可長(zhǎng)期儲(chǔ)存的青貯飼料,本研究以收獲后的新鮮玉米秸稈和甘蔗秸稈為原料,對(duì)其分離出的乳酸菌進(jìn)行鑒定,并對(duì)其青貯發(fā)酵品質(zhì)進(jìn)行分析。為提高青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì),本研究利用乳酸菌接種劑和纖維素酶制劑等微生物添加劑制備了青貯飼料,并對(duì)其添加效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)。
2017年9月,在非洲莫桑比克馬普托的玉米生產(chǎn)區(qū)和工業(yè)制糖區(qū)獲得的玉米秸稈和甘蔗秸稈。
根據(jù)制造商的使用方法,將商用乳酸菌添加劑Chikuso-1(CH,植物乳桿菌,雪印種子有限公司,日本札幌)和枝頂孢屬纖維素酶(AC,Acremonium纖維素酶,明治制果制藥有限公司,日本東京)作為青貯飼料添加劑進(jìn)行使用。乳酸菌添加劑的菌種,是從牧草飼料作物中分離出的乳酸菌,在青貯環(huán)境下能產(chǎn)生大量的乳酸。纖維素酶的主要成分是葡聚糖酶和果膠酶,其酶活性為7 350 U/g。
此試驗(yàn)設(shè)計(jì)可分為對(duì)照組(Control)、乳酸菌組(CH)、纖維素酶組(AC)、乳酸菌和纖維素酶混合組(CH+AC)4個(gè)處理,每個(gè)處理3次重復(fù)。乳酸菌的添加劑量是每千克飼草中加入5 mg的菌劑,菌群數(shù)量是1.0×105(cfu)/g。纖維素酶的添加劑量是每千克飼草中加入10 mg的菌劑和20 mL的水。用去離子水稀釋乳酸菌和纖維素酶接種劑,實(shí)驗(yàn)組用電子噴霧器(日本Miki Fujiwara Sangyo Ltd.,SSP-5H)去噴灑添加劑溶液,對(duì)照組噴灑相同數(shù)量的去離子水。
在收獲后,將新鮮的玉米秸稈和甘蔗葉用粉碎機(jī)粉碎成長(zhǎng)度約為1~2 cm的小段,按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)加入添加劑,添加量以新鮮樣品的質(zhì)量為基礎(chǔ)。每個(gè)處理稱(chēng)取8 kg左右的樣品,然后將其裝入20 L的聚乙烯圓桶中,室溫(25~38 ℃)避光密封保存60 d后測(cè)定發(fā)酵品質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)成分及微生物含量。
在超凈工作臺(tái)中將待測(cè)樣品開(kāi)袋取樣。首先將樣品剪碎,混勻,稱(chēng)取20 g至裝有180 mL無(wú)菌水的三角瓶中,搖床在室溫下震蕩30 min,速度為180 r/min,將此溶液依次稀釋10~10 000倍,均勻進(jìn)行涂布,MRS培養(yǎng)基在37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)48 h,BLB、PDA和NA培養(yǎng)基在37 ℃有氧條件下培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。
取青貯樣品20 g,加入180 mL去離子水中,攪拌搖勻,放置4 ℃冰箱中靜置24 h,利用pH測(cè)定儀(雷磁PHS-3 ℃)測(cè)定濾液pH值;采用分光光度法測(cè)定氨態(tài)氮(NH3-N)含量[12];有機(jī)酸用高效液相色譜法測(cè)定[13]。青貯飼料的營(yíng)養(yǎng)成分按常規(guī)方法[14]測(cè)定:采用烘箱干燥法測(cè)定干物質(zhì)(DM)含量;采用凱氏定氮法測(cè)定粗蛋白質(zhì)(CP)含量;采用索氏提取法測(cè)定脂肪(EE)含量;采用范氏洗滌纖維法測(cè)定中性洗滌纖維(NDF)含量;粗灰分(Ash)采用GB6439-92燃燒法測(cè)定;碳水化合物(Carbohydrate)的計(jì)算公式為Carbohydrate=100-(CP+EE+NDF+Ash)。
利用MRS瓊脂培養(yǎng)基將乳酸菌培養(yǎng)48 h后,測(cè)定其革蘭氏染色和形態(tài)學(xué)特征,并進(jìn)行過(guò)氧化氫酶接觸試驗(yàn)和發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn),詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)[15]。
1.7.1 耐溫試驗(yàn)
將分離的菌株接種到乳酸菌液體培養(yǎng)基中,分別放至5、10 ℃恒溫冰箱中培養(yǎng)10 d,在40、45和50 ℃的恒溫水浴鍋中培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)結(jié)束后,與不加菌液的乳酸菌液體培養(yǎng)基進(jìn)行比對(duì),從而對(duì)不同溫度條件下乳酸菌的生長(zhǎng)情況進(jìn)行對(duì)比分析。
1.7.2 耐酸試驗(yàn)
將分離的菌株接種到pH值為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0和9.0的乳酸菌液體培養(yǎng)基上,在30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)結(jié)束后,和不加菌液的乳酸菌液體培養(yǎng)基進(jìn)行對(duì)比,觀察乳酸菌在pH值為3.0~9.0的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況。
1.7.3 發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)
將分離培養(yǎng)的單菌落接種到含有5 mL的乳酸菌液體培養(yǎng)基玻璃試管中(杜氏小管倒扣在試管液體內(nèi)),30 ℃培養(yǎng)48 h,觀察小管內(nèi)產(chǎn)氣狀況,記錄試驗(yàn)結(jié)果。
1.7.4 碳源發(fā)酵試驗(yàn)
采用Analytical Profile Index (API 50,bioMerieux,F(xiàn)rance)試驗(yàn)條進(jìn)行測(cè)試,方法依據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。
基礎(chǔ)數(shù)據(jù)整理用EXCEL軟件,用SAS (12.0版)軟件程序?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。
2.1.1 化學(xué)成分
在進(jìn)行青貯發(fā)酵之前,取新鮮的玉米秸稈和甘蔗秸稈樣品,測(cè)定其原料中的化學(xué)成分含量,測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。兩種農(nóng)作物副產(chǎn)品的DM占風(fēng)干樣的比例分別為42%和25%;玉米秸稈和甘蔗秸稈的CP和EE含量基本相同,沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。玉米秸稈的NDF和Ash含量顯著高于甘蔗(P<0.05)。
2.1.2 微生物構(gòu)成
玉米秸稈和甘蔗原料中微生物種類(lèi)構(gòu)成見(jiàn)圖2。新鮮玉米秸稈和甘蔗秸稈中含有的乳酸菌和大腸桿菌數(shù)量為5.00~6.00 lg cfu/g,好氧細(xì)菌的菌落數(shù)量為8.00 lg cfu/g,酵母菌的菌落數(shù)量為5.00~7.00 lg cfu/g,霉菌的菌落數(shù)量為3.00~4.00 lg cfu/g。
圖2 玉米秸稈和甘蔗秸稈的微生物構(gòu)成
2.2.1 化學(xué)成分
玉米秸稈和甘蔗秸稈加入添加劑青貯60 d后,其化學(xué)成分含量如圖3所示。對(duì)于玉米秸稈和甘蔗秸稈的化學(xué)成分而言,兩種材料添加劑組的CP含量與對(duì)照組沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。對(duì)于玉米秸稈而言,添加劑組的NDF含量與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。對(duì)于甘蔗秸稈而言,與對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比分析可知,AC和CH+AC處理組的NDF含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05),CH處理組與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。
圖3 玉米秸稈和甘蔗秸稈青貯的化學(xué)成分
2.2.2 發(fā)酵品質(zhì)
玉米秸稈和甘蔗秸稈加入添加劑青貯60 d后,其發(fā)酵品質(zhì)(pH和乳酸含量)如圖4所示。通過(guò)對(duì)pH值和LA進(jìn)行分析可知,玉米秸稈的對(duì)照組和添加劑組之間的pH值和LA沒(méi)有顯著差異(P>0.05),而對(duì)于甘蔗秸稈處理組而言,添加劑組的pH值含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05),LA含量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。
圖4 青貯發(fā)酵60 d的玉米秸稈和甘蔗秸稈的發(fā)酵品質(zhì)
2.2.3 乳酸菌菌種構(gòu)成與生理生化指標(biāo)
從玉米秸稈和甘蔗秸稈青貯飼料中分離出的乳酸菌菌種構(gòu)成比例如圖5所示。Lactobacillusplantarum和Weissellancibaria是主要的乳酸菌群落,他們?cè)谟衩捉斩捄透收峤斩捑曛兴嫉谋壤謩e超出50%。在青貯發(fā)酵60 d后,植物乳桿菌(L.plantarum)為優(yōu)勢(shì)菌種,在玉米秸稈青貯飼料AC處理和甘蔗秸稈青貯飼料CH處理中占總菌株的比例分別高于75%,然而對(duì)于甘蔗秸稈青貯飼料而言,對(duì)照組和AC處理組的優(yōu)勢(shì)菌種是西伯利亞乳桿菌,其占總菌株的比例為57%~60%。
圖5 乳酸菌的菌種構(gòu)成比例
生理生化特性和API50 CH發(fā)酵糖實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1和表2。本試驗(yàn)測(cè)定了1 500個(gè)以上菌株的16S rRNA堿基序列。乳酸菌瓊脂平板上分離到97株MRS菌株,通過(guò)在乳酸菌瓊脂培養(yǎng)液中對(duì)不產(chǎn)乳酸的菌株進(jìn)行檢測(cè)可知,其革蘭氏染色呈陰性和過(guò)氧化氫酶呈陽(yáng)性,因此其中22株不具有乳酸菌特征。其余75株為革蘭氏染色呈陽(yáng)性和過(guò)氧化氫酶呈陰性的桿狀或球狀的細(xì)胞形態(tài),利用葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)確定菌株的同型或異型乳酸發(fā)酵形式,并生成D(-)、L(+)或近似等量的D(-)和L(+)-乳酸異構(gòu)體。通過(guò)對(duì)16S rDNA堿基序列進(jìn)行系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn),這些乳酸菌都可歸屬乳酸桿菌(包括2株)、魏氏菌、腸球菌和微球菌屬的菌種。根據(jù)形態(tài)學(xué),生理生化特性以及16S rRNA基因序列分析,這些分離菌株可鑒定為植物乳桿菌、短乳桿菌、西伯利亞魏氏桿菌、糞腸球菌和酸乳球菌。在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中,這些分離菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株最近緣,且序列相似度大于99.80%。
表1 乳酸菌生理生化性質(zhì)
表1(續(xù))
注:“+”表示生長(zhǎng);“-”表示不生長(zhǎng);“W”表示弱生長(zhǎng)。
表2 乳酸菌發(fā)酵碳源試驗(yàn)
表2(續(xù))
注:“+”,陽(yáng)性反應(yīng);“-”,負(fù)反應(yīng);“W”,弱陽(yáng)性反應(yīng)。
通常,熱帶牧草的種類(lèi)不同其化學(xué)成分也有所不同,尤其是DM、CP、NDF和WSC的含量。由于一些熱帶牧草存在水分和LBC高、WSC含量低的問(wèn)題,因此難以調(diào)制成高質(zhì)量的青貯飼料[1-16]。在本研究中,兩種作物秸稈的CP含量基本相同;但玉米秸稈比甘蔗秸稈具有更適宜的青貯特性,其具有水分含量和緩沖能低及WSC含量高的優(yōu)點(diǎn)。
為了探明農(nóng)作物秸稈附著微生物數(shù)量與青貯發(fā)酵品質(zhì)的關(guān)系,本試驗(yàn)對(duì)乳酸菌、好氧細(xì)菌、大腸桿菌,霉菌和酵母菌5種微生物進(jìn)行了檢測(cè)。一般來(lái)說(shuō),青貯發(fā)酵是以自然乳酸發(fā)酵為基礎(chǔ),在青貯過(guò)程中,由于牧草本身附著的乳酸菌將水溶性碳水化合物轉(zhuǎn)化成有機(jī)酸,從而降低pH值,使飼料得到有效的保存。因此,牧草本身附生乳酸菌的數(shù)量、種類(lèi)和特性已成為預(yù)測(cè)青貯發(fā)酵規(guī)律的重要指標(biāo)。當(dāng)乳酸菌少量存在于牧草或飼料作物時(shí),其自身無(wú)法在青貯發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生足夠的乳酸去降低pH并抑制梭酸菌的生長(zhǎng),由此產(chǎn)生的青貯飼料的品質(zhì)較差[17]。如圖2所示,玉米秸稈中存在著數(shù)量相對(duì)較高的乳酸菌105(cfu/g FM),即乳酸菌是優(yōu)勢(shì)菌群。因此在青貯發(fā)酵過(guò)程中不需要使用其他接種劑來(lái)控制對(duì)照組的微生物數(shù)量。與之相反,在本試驗(yàn)甘蔗秸稈中所含的乳酸菌數(shù)量較少,只有103的乳酸菌,因此威氏菌是主要的菌群。這個(gè)結(jié)果表明,玉米秸稈可依靠野生乳酸菌自然發(fā)酵,而甘蔗秸稈則需要添加乳酸菌制劑來(lái)改善青貯發(fā)酵品質(zhì)。
筆者曾在16S rRNA序列和DNA-DNA雜交實(shí)驗(yàn)中,對(duì)乳酸菌的鑒定和遺傳相關(guān)性進(jìn)行了廣泛的研究,并從青貯飼料中成功分離出乳酸菌的新菌種(New species)。以往的研究表明,乳酸桿菌、片球菌、腸球菌、明串珠菌、魏氏菌和乳球菌屬彼此之間表現(xiàn)出高度的序列相似性,形成一個(gè)與其他細(xì)菌相獨(dú)立的系統(tǒng)發(fā)育的群體[18]。本研究中,將代表性菌株置于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中的乳酸桿菌屬(包括2株)、魏氏菌、腸球菌和片球菌中,證實(shí)這些菌株屬于魏氏乳桿菌屬、片球菌屬和腸球菌屬。這些菌株分別與植物乳桿菌、短乳桿菌、西伯利亞威塞菌、糞腸球菌和酸性乳球菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株(Type strain)具有極其近緣的關(guān)系。這些菌株的16S rRNA序列相似性均在99.80%以上,與其他標(biāo)準(zhǔn)菌株的相似性均小于97.00%。根據(jù)16S rDNA序列分析,這些菌株可歸屬于植物乳桿菌、短乳桿菌、西伯利亞小腸桿菌、糞腸球菌和酸性乳球菌。事實(shí)上,API50 CH數(shù)據(jù)也支持這一結(jié)果,這些菌株與每種近緣標(biāo)準(zhǔn)菌株具有相似的糖源發(fā)酵規(guī)律。
通常,在青貯發(fā)酵初期,一些能夠產(chǎn)乳酸的球菌能夠創(chuàng)造出適合乳酸桿菌生長(zhǎng)的厭氧環(huán)境。乳酸桿菌在厭氧環(huán)境下,能夠繁殖較長(zhǎng)時(shí)間并產(chǎn)生大量的乳酸。許多研究表明,干酪乳桿菌、植物乳桿菌等同源發(fā)酵乳酸菌在促進(jìn)乳酸發(fā)酵和提高青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)等方面具有重要作用[19]。在本研究中,所有的玉米秸稈青貯都發(fā)酵良好,乳酸含量較高,pH值較低。促成青貯飼料良好發(fā)酵的主要原因與玉米秸稈的化學(xué)成分和附生乳酸菌的生理特性有密切關(guān)聯(lián)。如圖2所示,玉米秸稈的乳酸菌附生數(shù)量較多(105cfu/g FM)。此外,分布在玉米秸稈上的優(yōu)勢(shì)菌種是野生植物乳酸桿菌,該菌株為同源發(fā)酵型乳酸菌,在pH較低條件下會(huì)生長(zhǎng)良好,乳酸產(chǎn)量也會(huì)高于其他菌株。在青貯發(fā)酵期間,乳酸桿菌可以利用足夠的糖產(chǎn)生更多的乳酸,以降低pH值并抑制有害細(xì)菌的生長(zhǎng),從而使得對(duì)照組的青貯在內(nèi)的玉米秸稈青貯飼料能夠得到良好的發(fā)酵和儲(chǔ)藏[20]。與之相反,甘蔗秸稈對(duì)照組青貯品質(zhì)較差,而微生物添加劑處理組的青貯品質(zhì)較好。此外,甘蔗秸稈對(duì)照組的青貯飼料pH值沒(méi)有下降到4.0以下,允許丁酸菌進(jìn)行丁酸發(fā)酵和氨態(tài)氮產(chǎn)生。然而,用乳酸菌或纖維素酶處理的甘蔗青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)優(yōu)于對(duì)照。這些結(jié)果可能是用于本研究的纖維素酶可以降解纖維,增加可溶性碳水化合物的含量,使其作為乳酸生產(chǎn)的底物,從而提高乳酸發(fā)酵品質(zhì)。事實(shí)上,甘蔗秸稈處理組的NDF和ADF含量的下降也能支持這一論點(diǎn)。本試驗(yàn)的結(jié)果顯示,如果飼料作物有足夠的乳酸菌和糖含量,即使不添加乳酸菌,也能夠生產(chǎn)出高質(zhì)量的青貯飼料;因此,乳酸菌種類(lèi)和纖維素酶可能會(huì)改變和影響青貯飼料的發(fā)酵質(zhì)量。當(dāng)農(nóng)作物秸稈中乳酸菌和可溶性碳水化合物含量不足時(shí),需要及時(shí)添加乳酸菌和纖維素酶制劑對(duì)青貯飼料的發(fā)酵進(jìn)行調(diào)控。
近年,在非洲農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,農(nóng)作物秸稈資源迅速增加,出于對(duì)經(jīng)濟(jì)和環(huán)境的考慮,需要對(duì)農(nóng)作物副產(chǎn)品進(jìn)行有效的利用。結(jié)果表明,利用當(dāng)?shù)剞r(nóng)作物副產(chǎn)物資源制備青貯飼料是一種非常行之有效的發(fā)酵工藝[21]。我們的研究結(jié)果表明,玉米秸稈在天然青貯發(fā)酵過(guò)程中因存在有效乳酸菌種可調(diào)制成高品質(zhì)的飼料,甘蔗秸稈通過(guò)利用乳酸菌接種劑也能夠被制成良好的青貯飼料。兩種作物秸稈均含有一定的營(yíng)養(yǎng)成分,并在青貯發(fā)酵過(guò)程中得到了很好的保存;因此,作物秸稈作為一種粗飼料資源去解決非洲干旱季節(jié)飼料短缺問(wèn)題具有很大的潛力[22]。
玉米和甘蔗新鮮秸稈中富含一定的營(yíng)養(yǎng),玉米秸稈附著大量的乳酸菌,具有良好的青貯特性,適合青貯發(fā)酵。甘蔗秸稈需添加乳酸菌或纖維素酶制劑進(jìn)行調(diào)貯。這項(xiàng)研究表明,兩種農(nóng)作物秸稈均可以調(diào)制成良好的青貯飼料,將其作為粗飼料資源可以有效地解決非洲旱季地區(qū)家畜飼料短缺的問(wèn)題。
西華大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)2019年1期