穿孔素及顆粒酶B 與布魯菌病相關(guān)性研究進展

高國棟，其其格

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030）

1 布魯菌病的簡介

1.1 布魯菌病在世界各國的疫情

布魯菌病的別稱有弛張熱、波狀熱或者馬耳他熱，當(dāng)布魯氏菌侵入機體時，會引起人畜共患疾病，流行范圍廣泛，俗稱“懶漢病”。因攜帶有布魯氏菌病的羊、牛、豬等家畜在接觸中將其傳染給人類，因此其在生物接觸中具有傳染性，但目前研究證明發(fā)現(xiàn)，布魯菌病在人與人的接觸中不具傳染性。臨床癥狀內(nèi)容復(fù)雜，且不易分類，患病后主要為發(fā)熱、多汗、乏力、骨關(guān)節(jié)和肌肉酸痛，通常情況下，患者發(fā)熱可持續(xù)15 ～20 d，且反復(fù)性強；通過病理學(xué)診斷分析，該癥對人體的生殖系統(tǒng)影響效果較為直觀，一旦未能及時得到有效控制，將促使患者生殖能力損傷甚至喪失；同時將引發(fā)不同程度的關(guān)節(jié)、肌肉疼痛，嚴重情況下可直接剝奪患者勞動能力，甚至威脅生命[1]。據(jù)世界統(tǒng)計資料顯示，2018 年中國布魯氏菌病發(fā)病數(shù)量為21735 例，2017 年中國布魯氏菌病發(fā)病數(shù)為38554 例。而根據(jù)中國疾病預(yù)防控制中心的資料顯示，布魯菌病的治愈率在近年間雖然得到有效控制，但發(fā)病率仍舊處于較高水平[2]。

1.2 布魯菌病的發(fā)病機制

雖然布魯菌感染的病癥機理較為復(fù)雜，但其本質(zhì)上屬于傳染性疾病，而傳染源大多數(shù)是病菌，病菌從患者的皮膚或者粘膜侵入身體，隨著淋巴液的移動到達淋巴結(jié)，進而被吞噬細胞吞噬。因此欲分析其發(fā)病機制，需結(jié)合患者自身相關(guān)免疫功能，布魯菌病的免疫反應(yīng)功能包括兩種類型，即先天性免疫與適應(yīng)性免疫，前者通常為非特異性免疫，后者通常為特異性免疫[3]。在形成病灶的過程中，若免疫系統(tǒng)發(fā)揮功能，阻斷吞噬細胞，則可有效抑制病情，如果不能殺滅吞噬細胞，會促進細胞內(nèi)的細菌自由生長繁殖，因而形成局部的原發(fā)病灶。在分析布魯菌病的病變過程可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)病菌進入人體后，最先出現(xiàn)的是中性多核粒細胞。基于此，存活的布魯菌將隨淋巴液到達到局部淋巴結(jié)，并在相當(dāng)一段時間內(nèi)，不會出現(xiàn)明顯病變，此階段相當(dāng)于潛伏期[4]。隨著疾病進展，沒有被免疫系統(tǒng)殺滅的病菌被吞噬細胞吞噬，隨著血液的流動帶到全身各處，在人體的肝、脾等臟器內(nèi)繁殖，當(dāng)病菌繁殖到一定的數(shù)量之后，會沖破淋巴結(jié)的屏障，進而侵入人體的血液循環(huán)，在這種情況下就會出現(xiàn)毒血癥等相關(guān)癥狀，從而形成具有多發(fā)性的病灶。此時，如果吞噬細胞的吞噬能力低于患者病灶釋放的細菌時，會出現(xiàn)細菌在細胞外的血液中繁殖并生長，因此出現(xiàn)敗血癥的癥狀。需要注意的是，在不同因素的影響下，如果機體遭受破壞，由患者本身釋放的內(nèi)毒素等成分不僅會造成菌血癥、敗血癥等癥狀，還會發(fā)生毒血癥[5]。因此臨床檢測中，對于內(nèi)毒素的關(guān)注程度相對較高，如果患者感染細菌的量比較大，或者缺失免疫功能，機體中的一部分細菌會避開受到免疫功能的影響，故而這些細菌可能會被吞噬細胞吞噬，然后將其帶入到其他的組織或者器官中，最終形成新的感染灶，此階段在臨床中被稱為多發(fā)性病灶階段。因此，在不同組織病理損傷的影響下，布魯菌病的臨床表現(xiàn)通常呈現(xiàn)著多樣化的趨勢。

1.3 布魯菌病的病理分析

根據(jù)人體免疫系統(tǒng)的原理可見，先天性免疫系統(tǒng)是抵抗病原菌入侵的第一道防線，其中以巨噬細胞及樹突狀細胞為主，而適應(yīng)性免疫主要由Th1免疫為主，其能夠有效清除病原體，從而避免病菌進行擴散。相關(guān)研究表明，機體在對抗布魯菌時，主要靠CD4+及CD8+T 淋巴細胞、Th1類細胞因子（IFN-γ TNF-α）及活化的巨噬細胞和樹突狀細胞[6]。另一方面，布魯菌建立了很多逃逸固有免疫與適應(yīng)性免疫應(yīng)答的機制，因此其傳染途徑較多，且不易被自愈因子發(fā)現(xiàn)，因此布魯菌病具有極高的發(fā)病率，均源自胞內(nèi)布式小體達到在宿主胞內(nèi)長期寄生及復(fù)制的目的。巨噬細胞及DCs 吞噬布魯菌的過程中，清除細菌的過程可在數(shù)小時完成，而殘留的細菌將進入復(fù)制小體[7]?？梢?，布魯菌病主要以Th1型細胞免疫應(yīng)答為主，在治療的過程中，可通過抑制腫瘤壞死因子的分泌而抑制巨噬細胞凋亡，從而有效弱化其抗原提成功能，達到阻斷抗原特異性T 細胞的識別效果，形成有利于生存和繁殖的微環(huán)境。因此，布魯菌的侵犯范圍可達人體內(nèi)的每一處器官組織，對胞內(nèi)環(huán)境的適應(yīng)能力極強，所以可側(cè)面證實。細菌、病原菌分泌的毒素、免疫抑制、變態(tài)反應(yīng)及內(nèi)分泌紊亂等現(xiàn)象在布病的發(fā)病或在維持疾病狀態(tài)中都發(fā)揮著重要的作用[8]。

通過以上揭示的布魯菌發(fā)病機制，在特異性T細胞免疫應(yīng)答中，此過程由CTL 細胞參與，而穿孔素及顆粒酶B 在CTL 細胞殺傷病原體方面發(fā)揮著重要作用。所以穿孔素及顆粒酶B 在布魯菌病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中亦起著不可忽視的作用。

2 穿孔素及顆粒酶的簡介

2.1 穿孔素和顆粒酶的一般性質(zhì)

穿孔素是細胞毒性T 細胞（CTL）和NK 細胞殺傷的主要毒性蛋白（Perforin），又稱孔形成蛋白（PFP），在自身免疫、抗病毒免疫以及抗腫瘤免疫中都有重要的調(diào)節(jié)作用，是重要的免疫調(diào)節(jié)及免疫效應(yīng)分子。單純從生物學(xué)方面理解，穿孔素屬于淋巴因子，但因淋巴因子的種類繁多，目前臨床研究已明確機制的淋巴因子種類較少，因此臨床上廣泛認定為淋巴因子的有白細胞介素（約有10 余種）、單核-巨噬細胞移動抑制因子（MIF）、白細胞移動抑制因子（LIF）、單核-巨噬細胞趨化因子（MCF）、白細胞趨化因子（LCF）、B 細胞生長因子（BCGF）、B 細胞分化因子（BCDF）、細胞毒性因子、干擾素等。顆粒酶是外源性的絲氨酸蛋白酶，來自細胞毒淋巴細胞（CTLs）和自然殺傷細胞（NK）釋放的細胞漿顆粒，顆粒酶進入細胞，在其內(nèi)容物釋放的影響下，將導(dǎo)致細胞凋亡。此類大分子通常在自然殺傷細胞（NK）中表達，它們在CTL 中的表達受幾種細胞因子的調(diào)節(jié)。其中，已知IL-2、IL-12 都能誘導(dǎo)PFP和顆粒酶mRNA 的大量增加[9]。目前可以確定的是，穿孔素與顆粒酶的效果均是Ca2+十分依賴的，因此在不同的臨床情況下測定顆粒酶與穿孔素均可作為健康與病態(tài)的全新提示。

目前臨床研究已經(jīng)證實，穿孔素是一種細胞毒顆粒，主要寄存在NK 和CTL 細胞漿內(nèi)，本質(zhì)上是糖蛋白的一種，功能和結(jié)構(gòu)與C9補體相似，不具特異性識別功能，因穿孔素是天然殺傷細胞與胞毒T 細胞產(chǎn)生，故而天然殺傷細胞屬于非特異性免疫范疇，產(chǎn)生穿孔素只是胞毒T 細胞的功能之一；另外，穿孔素可以使人體細胞破裂也可以使細菌破裂，自然不存在特異性。結(jié)合其分子內(nèi)部信息可見，其通常多個二硫鍵連接，在非還原狀態(tài)下，分子量為60 ～65 KD；而在還原狀態(tài)下，分子量為70 KD。因此人體一旦發(fā)生病毒感染或出現(xiàn)傳染性疾病，機體內(nèi)有較高的幾率出現(xiàn)病毒感染或腫瘤、移植排斥反應(yīng)，因此穿孔素的表達也會隨之提升。國內(nèi)外眾多文獻顯示，經(jīng)純化的穿孔素能夠快速促使靶細胞發(fā)生溶解，但在細胞膜自我修復(fù)能力的影響下，其必須與顆粒酶共同作用方能促成大規(guī)模靶細胞的凋亡效果。

目前臨床研究已經(jīng)證實，顆粒酶是一種絲氨酸蛋白酶，廣泛分布于活化的CTL 與NK 細胞胞漿中，截至目前為止，臨床上已發(fā)現(xiàn)人體中的顆粒酶種類共3 類，為顆粒酶A、顆粒酶B 與顆粒酶C，而發(fā)現(xiàn)鼠的顆粒酶有7 種，即顆粒酶A、B、C、D、E、F、G（GrA、GrB、GrC、GrD、GrE、GrF、GrG）[10]。人體內(nèi)的顆粒酶基因分子量存在30kD、32kD、35kD 等形式，且同一蛋白帶有不同的輔基，不僅具有門冬氨酸的活性，同時可被Boc-Ala-Ala-Asp-Ch2Cl 抑制。因此，活化后的CTL 在識別靶細胞后，通過顆粒外排的方式，將顆粒酶分泌到細胞間隙，進而對其進行殺傷，在殺傷的同時，CTL 又能夠迅速合成顆粒酶，這些新和成的顆粒酶不僅能夠直接分泌到細胞外，又可以儲存起來，以供殺傷下一個靶細胞[11]。

2.2 顆粒酶和穿孔素的殺傷機制

明確穿孔素與顆粒酶的生物特性后，臨床上已將其廣泛應(yīng)用于疾病的檢測與分析中，由于二者均存在于前體細胞中，雖然穿孔素的表達水平并不明顯，但是穿孔素在激活NK 和CTL 中卻發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，從而實現(xiàn)提升其表達水平的目的。值得注意的是，一旦CTL、NK 細胞充分融合于靶細胞后，經(jīng)顆粒胞吐反應(yīng)，效應(yīng)細胞釋放致密的胞漿顆粒。同時內(nèi)容物入靶細胞和效應(yīng)細胞的結(jié)合位點處，靶細胞將受到十分嚴重的攻擊，甚至喪失細胞功能。通過眾多文獻資料可見，其反應(yīng)過程中將釋放出大量的大分子物質(zhì)，而其中尤以PFP 和顆粒酶占較大比例[12]。因此，分離、純化的PFP 和GrB 與雙標(biāo)記的靶細胞，并聯(lián)合51Cr 標(biāo)記靶細胞膜的特性，是有效降低靶細胞損傷有效途徑之一；需滿足靶細胞DNA 被125I-Udr 標(biāo)記、單用PFP 引起靶細胞膜受損釋放51Cr 等條件，但若出現(xiàn)125I-Udr 釋放，則將促使其損傷延續(xù)，加劇疾病反應(yīng)。而唯有確保靶細胞DNA 連接完整，才能有效保障其反應(yīng)過程的安全性?；诖?，可推測出，將GrB 單用并不是導(dǎo)致1Cr 釋放的唯一因素，同時也不是導(dǎo)致125I-Udr 釋放的必要原因，其需要在同一時間內(nèi)滿足PFP、GrB 兩項條件，缺一不可，才能有效檢測出51Cr的釋放，觀察125I-Udr 快速釋放的過程。因此，靶細胞受損的先決條件來自于PFP，而正因為PFB 導(dǎo)致了靶細胞損傷，才能保障后續(xù)過程中，GrB 對靶DNA 促成斷裂干擾。不過雖然單純的PFP 無法導(dǎo)致細胞凋亡，但是仍會起到溶解細胞膜的作用，常見于細胞滲透性溶解現(xiàn)象。如果二者同時存在，則需要觀察在靶細胞漿內(nèi)是否再次分布，同時明確其余細胞核的距離；如果在細胞核中同時存在二者，就會直接導(dǎo)致細胞凋亡。分析《穿孔素和顆粒酶的研究進展》中的內(nèi)容可見，GrB 一旦進入靶細胞，通過目前尚未知的中介物激活P 34 cdc2，可引起染色體濃縮，DNase激活，DNA被切割，最后發(fā)生細胞凋亡（Apoptosis）。其在臨床研究中，通常將其定義為PFP 間接殺傷功能[13]。

3 穿孔素及顆粒酶與布魯菌病發(fā)病的關(guān)系

通過布魯氏菌效應(yīng)蛋白及其互作靶標(biāo)篩選鑒定，解讀胞內(nèi)轉(zhuǎn)運、致病作用、免疫逃逸或持續(xù)性感染機制發(fā)現(xiàn)，布魯菌病患者的免疫抑制過程中，CD4+T 淋巴細胞、CD8+T 淋巴細胞、Th1類細胞因子（IFN-γ、TNF-α）及活化的巨噬細胞和樹突狀細胞占據(jù)著主要位置。而統(tǒng)計眾多研究文獻資料可見，CD8+CTL 具有良好的保護效果[14]?；罨腃TL 細胞可以通過Fas 途徑，在細胞毒作用和IFN-γ 分泌過程中，激活自身免疫功能，從而抑制布魯氏菌。經(jīng)臨床資料顯示，慢性化及復(fù)發(fā)患者的外周血CTLs 細胞數(shù)量可見其明顯高于其他類型的患者，從側(cè)面即可證實，由于慢性期患者的CD4+T 淋巴細胞存在明顯的功能缺陷，因此導(dǎo)致患者的病情遷延不愈，反復(fù)發(fā)作。同時，慢性期患者CD4+T 淋巴細胞上的CD152（CTLA-4）表達上調(diào)，能夠反映出CD4+T淋巴細胞的損害?；诂F(xiàn)有研究的相關(guān)數(shù)據(jù)，CD4+T 淋巴細胞數(shù)量起到了決定性作用，如果其水平降低，將導(dǎo)致布魯菌重要免疫反應(yīng)的增強，從而促使已失去活性的免疫細胞重新工作，并不斷刺激新的免疫細胞誕生，正因如此，在患者疾病發(fā)作的過程中，部分患者會從急性期感染癥狀自然過渡至慢性期感染，在一定程度上，屬于典型的免疫抑制效果[15-16]。

綜上所述，在布魯菌病患者的病變感染過程中，在證實外周血白細胞被激活，而細胞毒性淋巴細胞（CTL）接觸靶細胞后的情況下，可充分利用穿孔素與顆粒酶生物特性，促使其進入細胞間隙中，在Ca2+的存在下迅速附著于靶細胞膜中，并在其中開拓不同孔道的跨膜通路，完全作用于雙層磷脂中，進而促使顆粒酶A、B 等能夠完全進入細胞漿與細胞核中，對病毒細胞的DNA 產(chǎn)生阻斷效果，從而促成布魯氏病菌凋亡。

4 展望

布魯氏菌屬內(nèi)種型繁多，各種型間毒力強度、生物型性狀、宿主傾向性、流行特征等方面各不相同。雖然關(guān)于此病的研究已有較長的時間，但是在該病的相關(guān)領(lǐng)域仍存在較多的問題，而且關(guān)于此病的治療方面，結(jié)果仍不理想，因此，在臨床中需要進一步明確布魯菌病的發(fā)病機制，充分利用穿孔素與顆粒酶的生物特性，加強二者在布魯氏菌的分型和病原學(xué)檢測中的應(yīng)用，深入研究布魯氏菌的流行病學(xué)特征，繼而提升對布魯氏菌病的治療效果，以期為布魯菌病患者帶來更多福音。