以降解產(chǎn)物的量表征西羅莫司口服溶液質(zhì)量的探討

趙敬丹 聞宏亮 秦峰 劉浩

(上海市食品藥品檢驗(yàn)所，上海 201203)

西羅莫司(sirolimus)又稱雷帕霉素(rapamycin)，是1975年發(fā)現(xiàn)的親脂性大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑[1]。1999年10月惠氏制藥研制的西羅莫司口服溶液在美國首次上市，2005年國內(nèi)有3家企業(yè)獲批生產(chǎn)，主要適用于接受腎移植的患者，預(yù)防器官排斥?，F(xiàn)行各國藥典均未收載西羅莫司及其口服溶液，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)均為國家食品藥品監(jiān)督管理總局標(biāo)準(zhǔn)[2-4]。

西羅莫司口服溶液中的輔料主要有吐溫80及Phosal 50PG等。其中，Phosal 50PG是主要組成部分，其性狀為黏稠液體，是復(fù)合改性磷脂，主要包括磷脂酰膽堿、丙二醇、單甘油脂肪酸酯、乙醇、大豆脂肪酸和L-抗壞血酸棕櫚酸酯。經(jīng)本試驗(yàn)證實(shí)：吐溫80和Phosal 50PG在西羅莫司紫外吸收光譜范圍內(nèi)均有吸收，這增加了采用紫外檢測(cè)器測(cè)定西羅莫司口服溶液中有關(guān)物質(zhì)的難度。

由于輔料的干擾，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)分別采用質(zhì)譜法或通過改變檢測(cè)波長(zhǎng)控制其有關(guān)物質(zhì)。其中，質(zhì)譜法采用選擇性離子監(jiān)測(cè)的方式控制開環(huán)降解物、異構(gòu)體和同系物的量，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：該方法重現(xiàn)性差，通用性差。而液相色譜法僅控制西羅莫司發(fā)酵工藝中產(chǎn)生的雜質(zhì)—去甲基西羅莫司，不控制降解產(chǎn)物，并且存在明顯的輔料干擾現(xiàn)象，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性較差。

本文首先采用自建的西羅莫司有關(guān)物質(zhì)分析方法[5]，但試驗(yàn)結(jié)果顯示，輔料的色譜保留“貫穿”整個(gè)色譜分析過程。由于Phosal50PG具有類似蜂蜜一樣的黏稠度，在分析過程中不可避免會(huì)干擾測(cè)定。為了解決該問題，分別嘗試?yán)萌芙庑缘牟町惓恋磔o料或固相萃取除去輔料的方法及正相色譜法等，但沉淀后輔料仍干擾西羅莫司工藝雜質(zhì)及開環(huán)降解雜質(zhì)的測(cè)定；固相萃取法操作繁瑣，需兼顧提取回收率，且樣品處理后部分輔料仍干擾先于西羅莫司色譜峰洗脫的工藝雜質(zhì)的定量測(cè)定；正相色譜法存在多次進(jìn)樣后，色譜柱柱效明顯下降的現(xiàn)象。因此，為了有效地評(píng)價(jià)西羅莫司口服溶液的質(zhì)量，有必要建立通過控制特定降解產(chǎn)物的量評(píng)價(jià)產(chǎn)品質(zhì)量的分析方法。

本研究發(fā)現(xiàn)：西羅莫司在酸、堿、加熱等條件下均不穩(wěn)定，在其相對(duì)保留時(shí)間約為0.6處均有一個(gè)較明顯的降解產(chǎn)物色譜峰，經(jīng)質(zhì)譜分析及對(duì)照品驗(yàn)證，確認(rèn)該色譜峰為斷雷帕霉素。穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，斷雷帕霉素是西羅莫司主要的開環(huán)降解雜質(zhì)，并且其量的增加趨勢(shì)和西羅莫司含量的降低呈相關(guān)性。因此，本文采用通過控制降解雜質(zhì)—斷雷帕霉素量的方式間接表征西羅莫司口服溶液的質(zhì)量。新建的方法專屬性好，重現(xiàn)性好，通用性強(qiáng)，為完善質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，有效監(jiān)控產(chǎn)品質(zhì)量奠定了基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1200型高效液相色譜儀(Agilent公司，配備二極管陣列檢測(cè)器)；2695型高效液相色譜儀(Waters公司，配備二極管陣列檢測(cè)器)；LC-20AD型高效液相色譜儀(Shimadzu公司，配備紫外檢測(cè)器)。CP225D型電子天平(德國Sartorius公司)。乙腈，叔丁基甲醚均為色譜純，甲酸銨，甲酸及其他試劑均為分析純，水為Milli-Q超純水。西羅莫司對(duì)照品(浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，批號(hào)：20151112，純度：99.7%，圖1)；斷雷帕霉素(輝瑞制藥有限公司，批號(hào)：L20715-182-A，純度：80%，圖1)。西羅莫司口服溶液(A企業(yè)，批號(hào)160101，規(guī)格50mL:50mg；B企業(yè)，批號(hào)150916，規(guī)格50mL:50mg；C企業(yè)，批號(hào)FKC2602001，規(guī)格20mL:20mg；均為國內(nèi)抽樣樣品)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

圖1 對(duì)照品結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of standard substances

色譜柱：Kromasil100-5 C18(4.6mm×250mm,5μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)為277nm；流動(dòng)相：以20mmol/L甲酸銨溶液(用甲酸調(diào)節(jié)pH值至3.6)為流動(dòng)相A，乙腈(含1%的叔丁基甲醚)為流動(dòng)相B；按表1進(jìn)行線性梯度洗脫；流速為1.5mL/min；柱溫為35℃；進(jìn)樣體積20μL。西羅莫司主峰的保留時(shí)間在23～25min之間。

取西羅莫司對(duì)照品約5mg，置于5mL量瓶中，加2mL乙腈使溶解，加0.1mmol/L氫氧化鈉溶液1mL，振搖，使混合均勻，加0.1mmol/L鹽酸溶液1mL，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性溶液。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Tab. 1 Gradient elution program of mobile phase

2.2 專屬性試驗(yàn)

經(jīng)輔料干擾試驗(yàn)，酸破壞，堿破壞，氧化破壞，加熱破壞和光照破壞試驗(yàn)知，在建立的色譜條件下，各降解物峰及輔料峰均不干擾斷雷帕霉素和西羅莫司的測(cè)定，方法專屬性良好。典型色譜圖見圖2。

2.3 線性關(guān)系及相對(duì)響應(yīng)因子的測(cè)定

分別取西羅莫司對(duì)照品和斷雷帕霉素對(duì)照品各約10mg，精密稱定，置于同一100mL量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品貯備液。分別精密量取上述儲(chǔ)備溶液各適量，用乙腈按不同比例稀釋制成濃度分別為0.5、1、2、4、5、10、25和50μg/mL的線性溶液。分別精密量取上述溶液各20μL，分別考察在不同色譜系統(tǒng)及不同色譜柱上的響應(yīng)情況，記錄色譜圖。以濃度(C)對(duì)峰面積(A)進(jìn)行線性回歸分析。以斷雷帕霉素和西羅莫司線性方程的斜率計(jì)算斷雷帕霉素相對(duì)于西羅莫司的響應(yīng)因子f，其中f為斷雷帕霉素線性方程的斜率值/西羅莫司線性方程的斜率值，詳見表2。

上述結(jié)果表明，斷雷帕霉素和西羅莫司在0.5～50μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系均良好，斷雷帕霉素相對(duì)于西羅莫司的響應(yīng)因子在0.9～1.1之間。

由于斷雷帕霉素對(duì)照品難以大量制備且價(jià)格昂貴。因此，本文采用西羅莫司加堿破壞的色譜圖作為標(biāo)準(zhǔn)圖譜，對(duì)斷雷帕霉素進(jìn)行定位，并采用主成分自身對(duì)照法定量。

2.4 溶液的制備

2.4.1 供試品溶液

取本品適量，精密稱定，加乙腈稀釋制成約含西羅莫司0.5mg/mL的溶液，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4.2 對(duì)照溶液

取西羅莫司對(duì)照品適量，精密稱定，加乙腈溶解并定量稀釋制成每5μg/mL的溶液，作為對(duì)照溶液。

2.5 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取A企業(yè)樣品，按“2.4.1”項(xiàng)下制備供試品溶液，在4℃分別放置0、2、4、8、12和24h后，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算斷雷帕霉素的含量，6次測(cè)定結(jié)果的RSD為1.1%。結(jié)果表明，供試品溶液在4℃放置24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

圖2 專屬性試驗(yàn)HPLC色譜圖Fig.2 HPLC Chromatograms of specific test

表2 斷雷帕霉素相對(duì)響應(yīng)因子的測(cè)定結(jié)果Tab. 2 Determination results of the relative response factor

取A企業(yè)樣品，共6份，按“2.4.1”項(xiàng)下制備供試品溶液，分別進(jìn)樣分析，斷雷帕霉素量的平均值為1.0%，RSD為1.4%。重復(fù)性良好。

2.7 精密度試驗(yàn)

取“2.3”項(xiàng)下0.5μg/mL的對(duì)照溶液，精密量取20μL，分別連續(xù)注入液相色譜儀6次，記錄色譜圖。西羅莫司峰面積的RSD為0.6%。精密度良好。

2.8 檢測(cè)限

精密量取“2.3”項(xiàng)下線性對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適量，加乙腈逐級(jí)稀釋，進(jìn)樣分析。以信噪比S/N=3:1計(jì)算檢測(cè)限。檢測(cè)限為2.3ng(以進(jìn)樣20μL計(jì))，約相當(dāng)于0.02%。

2.9 樣品測(cè)定

按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，精密量取“2.1”項(xiàng)下的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液20μL，注入液相色譜儀，西羅莫司主峰的保留時(shí)間約為24min，相對(duì)西羅莫司主峰保留時(shí)間約為0.6處的色譜峰為斷雷帕霉素峰，其他色譜峰均不干擾西羅莫司及斷雷帕霉素的測(cè)定。A、B和C企業(yè)斷雷帕霉素檢出量分別為1.0%、1.3%和0.7%，典型色譜圖見圖3。

3 討論

3.1 現(xiàn)行注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法的缺陷

西羅莫司口服溶液現(xiàn)行注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)分別采用液相色譜法和質(zhì)譜法控制有關(guān)物質(zhì)的量。其中，液相色譜法控制西羅莫司發(fā)酵工藝雜質(zhì)去甲基西羅莫司，不控制開環(huán)等降解產(chǎn)物，標(biāo)準(zhǔn)存在缺陷，并且存在嚴(yán)重的輔料干擾現(xiàn)象，測(cè)定結(jié)果重復(fù)性差；質(zhì)譜法控制本品中的同系物、異構(gòu)體和降解產(chǎn)物。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：該方法的缺陷有：①開環(huán)降解產(chǎn)物為有機(jī)酸，流動(dòng)相體系為乙腈-水，開環(huán)降解雜質(zhì)保留較弱，易受輔料基質(zhì)效應(yīng)影響且離子化效率和其他雜質(zhì)存在差異。②樣品基質(zhì)復(fù)雜，測(cè)定結(jié)果重復(fù)性差，多次進(jìn)樣后離子源污染較嚴(yán)重。③質(zhì)譜方法成本高，通用性不強(qiáng)，方法難以推廣。

圖3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)(1)及供試品溶液(2)典型色譜圖Fig.3 HPLCChromatograms of system suitability test (1) and sample solution (2)

3.2 色譜系統(tǒng)建立的依據(jù)

由于西羅莫司及其制劑在各國藥典中均未收載，在比較了現(xiàn)行注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)[6-8]調(diào)研的基礎(chǔ)上，通過溶解樣品溶劑的選擇、柱溫、流動(dòng)相系統(tǒng)的優(yōu)化(包括流動(dòng)相組成、流動(dòng)相pH、緩沖溶液的選擇、流動(dòng)相中改性劑、互補(bǔ)分離模式的驗(yàn)證等)等試驗(yàn)過程，最終新建專屬性良好的，可同時(shí)控制西羅莫司開環(huán)降解雜質(zhì)和主要工藝雜質(zhì)的液相色譜系統(tǒng)[5]，為西羅莫司口服溶液色譜系統(tǒng)的建立奠定了基礎(chǔ)。

3.3 排除輔料對(duì)有關(guān)物質(zhì)測(cè)定影響的嘗試

西羅莫司口服溶液為黃色澄清黏稠液體。主要輔料為Phosal 50PG，其為復(fù)配磷脂，主要為含有溶于丙二醇/乙醇中的約50%磷脂的脂質(zhì)體形成的組合物[9-10]。由于Phosal組合物具有類似蜂蜜一樣的黏稠度。在分析過程中不可避免會(huì)產(chǎn)生輔料干擾問題。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：采用西羅莫司原料有關(guān)物質(zhì)檢查方法[5]時(shí)，需要在每次進(jìn)樣后用乙腈沖洗色譜系統(tǒng)30min以上，并且輔料的色譜保留“貫穿”整個(gè)色譜分析過程。為優(yōu)化分析方法，嘗試沉淀離心去除磷脂的方法，但輔料仍干擾部分工藝雜質(zhì)及開環(huán)降解雜質(zhì)的測(cè)定；嘗試采用正相色譜分析系統(tǒng)，利用輔料在正相色譜系統(tǒng)中難保留的特點(diǎn)排除干擾。但是，多次進(jìn)樣后，柱效顯著下降，需要活化色譜柱后才能繼續(xù)檢測(cè)；通過正相色譜分析系統(tǒng)建立的思路，嘗試通過固相萃取的方式，除去輔料的干擾，但部分輔料仍干擾先于西羅莫司色譜峰洗脫的雜質(zhì)的測(cè)定。故上述方法均不是口服溶液有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)的理想方法。

3.4 以斷雷帕霉素的量表征西羅莫司口服溶液質(zhì)量的合理性分析

在西羅莫司分析方法建立的過程中，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：西羅莫司在酸、堿、加熱等條件下均不穩(wěn)定，在相對(duì)保留時(shí)間約為0.6處均存在較明顯的降解色譜峰，經(jīng)質(zhì)譜分析及對(duì)照品驗(yàn)證，確認(rèn)該色譜峰為斷雷帕霉素。

經(jīng)穩(wěn)定性試驗(yàn)研究，斷雷帕霉素是主要的開環(huán)降解雜質(zhì)，并且其檢出量的增加趨勢(shì)和西羅莫司含量的降低呈相關(guān)性，詳見表3～4。因此，擬采用通過控制口服溶液中降解雜質(zhì)—斷雷帕霉素量的方式間接控制西羅莫司口服溶液的質(zhì)量。為了規(guī)避輔料的干擾，在西羅莫司原料有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法的基礎(chǔ)上對(duì)流動(dòng)相pH值進(jìn)行調(diào)整，并且增加了梯度過程中乙腈的洗脫時(shí)間。試驗(yàn)證明，新建的方法操作方便，重復(fù)性好，通用性強(qiáng)。

3.5 斷雷帕霉素色譜峰定位及定量方式的選擇

由于斷雷帕霉素對(duì)照品難以大量制備，且市場(chǎng)上購置的斷雷帕霉素價(jià)格昂貴。在沒有對(duì)照品的前提下，為了更好地實(shí)現(xiàn)對(duì)斷雷帕霉素的定位及后續(xù)的定量分析，根據(jù)西羅莫司原料方法專屬性研究中西羅莫司在堿性條件下易降解產(chǎn)生斷雷帕霉素的現(xiàn)象，在方法中增加堿破壞試驗(yàn)作為系統(tǒng)適用性溶液，并附標(biāo)準(zhǔn)圖譜，明確斷雷帕霉素的保留行為。由于斷雷帕霉素相對(duì)于西羅莫司的響應(yīng)因子在0.9～1.1之間，因此以主成分自身對(duì)照法定量，提高定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。

4 小結(jié)

現(xiàn)行西羅莫司口服溶液標(biāo)準(zhǔn)均存在一定的缺陷，難以真實(shí)反映產(chǎn)品的質(zhì)量。本文通過色譜系統(tǒng)的篩選及流動(dòng)相條件的優(yōu)化，自建了以主要開環(huán)降解雜質(zhì)斷雷帕霉素的量表征西羅莫司口服溶液質(zhì)量的方法，為完善質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，有效監(jiān)控產(chǎn)品的質(zhì)量奠定了基礎(chǔ)。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)斷雷帕霉素量和西羅莫司含量結(jié)果Tab. 3 Stability test results of seco-rapamycin and the content of sirolimus

表4 斷雷帕霉素和西羅莫司測(cè)定結(jié)果相關(guān)分析Tab. 4 Correlation analysis result between seco-rapamycin and the content of sirolimus

將開環(huán)降解雜質(zhì)斷雷帕霉素作為表征制劑工藝及貯藏過程中影響產(chǎn)品質(zhì)量的特定雜質(zhì)，解決了西羅莫司口服溶液中輔料對(duì)檢測(cè)造成的嚴(yán)重干擾問題。此方法專屬性、重復(fù)性好，簡(jiǎn)便易行，為復(fù)雜體系樣品中有關(guān)物質(zhì)的考察提供了新的思路和方法。