紫外分光光度法快速測(cè)定慶大霉素C1a含量在高通量篩選中的應(yīng)用

田江濤 李敏超 杭海峰 郭美錦 儲(chǔ)炬 莊英萍

(華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237)

慶大霉素(gentamicin, GM)屬于氨基糖苷類抗生素，對(duì)革蘭陽性菌和陰性菌具有廣譜抗菌活性[1]。慶大霉素C1a是慶大霉素單組分之一，是合成依替米星(etimicin, ETM)的重要前體物質(zhì)[2]，依替米星具有抗菌活性高、療效好、低毒性等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注[3-6]。目前慶大霉素C1a主要通過慶大霉素多組分分離純化得到，本實(shí)驗(yàn)室利用生產(chǎn)慶大霉素單組分C1a的絳紅小單孢菌工程菌株，可發(fā)酵產(chǎn)出單一組分且含雜質(zhì)較少的慶大霉素C1a。但該菌株產(chǎn)量較低，菌種穩(wěn)定性差，影響發(fā)酵效益。

高通量篩選技術(shù)常用于藥物篩選、微生物作用機(jī)理研究、酶制劑定量分析等[7-10]。在高通量篩選技術(shù)篩選慶大霉素C1a誘變菌株過程中，慶大霉素C1a的快速檢測(cè)是影響高通量篩選效率的瓶頸。由于慶大霉素C組分的分子結(jié)構(gòu)中不含共軛雙鍵，無紫外吸收峰，不能使用常規(guī)的方法進(jìn)行檢測(cè)，目前應(yīng)用慶大霉素的檢測(cè)方法來測(cè)定慶大霉素C1a的含量[11]。慶大霉素檢測(cè)方法有濁度法、生物法、高效液相色譜法、薄層層析法等。實(shí)驗(yàn)室常用的檢測(cè)方法是柱前OPA衍生樣品，使該樣品具有官能團(tuán)，然后通過高效液相色譜法測(cè)定其含量。在高通量篩選誘變菌株過程中，需要對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行處理，常規(guī)的檢測(cè)方法不利于大量樣品的快速檢測(cè)，需要建立慶大霉素C1a的快速檢測(cè)方法。

提高抗生素發(fā)酵生產(chǎn)效價(jià)的源頭是獲得高產(chǎn)菌株，近年來關(guān)于成功獲得高產(chǎn)菌株的報(bào)道很多[12-15]，但是關(guān)于慶大霉素單組分C1a生產(chǎn)菌誘變和高通量篩選的相關(guān)文獻(xiàn)很少。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 出發(fā)菌株

絳紅小單孢菌(Micromonospore purpurea)由河南仁華生物科技有限公司(平頂山)提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

(1)斜面培養(yǎng)基組成(g/L)：淀粉10，KNO31，K2HPO4·3H2O 0.3，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 0.5，L-天冬酰胺 0.02，CaCO31，麩皮17，瓊脂粉14，pH7.8，121℃高壓濕熱滅菌30min。

(2)種子培養(yǎng)基(g/L)：玉米粉15，淀粉10，葡萄糖1，低溫豆粉10，蛋白胨2，KNO30.5，CaCO35，121℃高壓濕熱滅菌30min。

(3)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：玉米粉15，淀粉31，葡萄糖5，高溫豆粉31，CaCO31，羽毛粉2，KNO30.5，(NH4)2SO40.6，CoCl2·6H2O 0.01，121℃高壓濕熱滅菌30min。

(4)平板培養(yǎng)基(g/L)：淀粉10，KNO31，K2HPO4·3H2O 0.3，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 0.5，L-天冬酰胺 0.02，CaCO31，麩皮17，瓊脂粉14，pH7.8，121℃高壓濕熱滅菌30min。

1.1.3 試劑

慶大霉素C1a標(biāo)準(zhǔn)品(河南仁華生物科技有限公司，純度為91.59%)；硼酸(分析純)；硫酸(分析純)配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的溶液；磷鎢酸鈉(分析純)配制成1×10-2g/mL水溶液；慶大霉素C1a標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為1000u/mL。

1.2 方法

1.2.1 慶大霉素C1a含量測(cè)定(紫外分光光度法)

(1)發(fā)酵液預(yù)處理：將一定質(zhì)量的草酸加入發(fā)酵液中，玻璃棒攪拌，測(cè)得pH值為4.0～5.0，用膠頭滴管滴加50%硫酸溶液，使pH值為1.5～1.7之間。40℃水浴鍋中反應(yīng)1h。將酸化的發(fā)酵液加入10mL離心管，放入低速離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為4000r/min，離心10min，取上清液，待用。

(2)檢測(cè)波長(zhǎng)確定：分別取1.5mL pH值為3的磷鎢酸鈉水溶液與1.5mL pH值為3的酸化后發(fā)酵液上清液，加入100mL的容量瓶中，混合均勻，定容至100mL。各取200μL樣品加入96孔石英酶標(biāo)板中，在酶標(biāo)儀中進(jìn)行光譜掃描，測(cè)定不同波長(zhǎng)條件下磷鎢酸鈉溶液和發(fā)酵上清液的吸光值。通過特征吸收峰的最大吸光值確定檢測(cè)波長(zhǎng)。

(3)反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間的確定：在100mL容量瓶中加入1.5mL磷鎢酸鈉溶液與1mL慶大霉素C1a標(biāo)準(zhǔn)品溶液，定容至100mL。將反應(yīng)溫度設(shè)置為15、25和30℃。在波長(zhǎng)為248nm條件下，測(cè)定反應(yīng)時(shí)間為2、4、8、16、30和60min的上清液吸光值。

(4)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的建立：分別取0.1～2mL效價(jià)為1000u/mL的慶大霉素C1a標(biāo)準(zhǔn)溶液，放置于100mL容量瓶中，加入1.5mL濃度為1×10-2g/mL的磷鎢酸鈉水溶液，定容至100mL，靜置0.5h，取200μL上清液，置于96孔石英酶標(biāo)板中，在248nm的波長(zhǎng)條件下測(cè)定上清液的吸光值。以慶大霉素C1a效價(jià)為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，制作磷鎢酸鈉吸光度與慶大霉素C1a效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 慶大霉素C1a含量測(cè)定(高效液相色譜法)

按照中國(guó)藥典2015年版，高效液相色譜法(通則0512)測(cè)定慶大霉素C組分含量的方法測(cè)定其含量[11]。

1.2.3 菌種的不同誘變方法

(1)ARTP誘變：通過血球計(jì)數(shù)板對(duì)孢子懸浮液進(jìn)行計(jì)數(shù)，制備108個(gè)/mL的單孢子懸浮液。用移液槍取20μL均勻涂布在鐵環(huán)中央，在誘變距離為2mm條件下，參考ARTP誘變的相關(guān)文獻(xiàn)[16]，設(shè)定誘變時(shí)間為30、60、90、120、150、180和300s，對(duì)照組不進(jìn)行照射誘變。取980μL的無菌水，將鐵環(huán)的孢子清洗至1.5mL離心管中，分別將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的孢子懸浮液進(jìn)行梯度稀釋，取每個(gè)濃度梯度100μL菌液均勻涂布于篩選平板中，每個(gè)濃度梯度做3組平行實(shí)驗(yàn)。在36℃，濕度40%～60%條件下，培養(yǎng)10d。培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)同濃度梯度培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算誘變致死率。將對(duì)照組的單菌落與誘變菌株單菌落分別接入含有種子培養(yǎng)基的24孔板中，設(shè)置溫度為36℃，濕度40%～60%，搖床轉(zhuǎn)速為250r/min，培養(yǎng)48h；以10%的接種量，接入對(duì)應(yīng)的24孔板發(fā)酵培養(yǎng)基中，設(shè)置溫度為36℃，濕度40%～60%，搖床轉(zhuǎn)速為250r/min，培養(yǎng)96h。對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行酸化處理，通過紫外分光光度法，快速測(cè)定樣品的含量。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算正突變率，確定ARTP誘變時(shí)間。

(2)微波誘變：在超凈工作臺(tái)中，取100μL的108個(gè)/mL單孢子懸浮液置于1.5mL的EP管中，放入微波爐中，設(shè)定功率為600W，參考微波誘變的相關(guān)文獻(xiàn)[17]，設(shè)定誘變時(shí)間為30、60、90、120、150、180和300s。取900μL的無菌水將誘變菌株洗出，將未誘變孢子懸浮液和不同誘變時(shí)間的菌體進(jìn)行梯度稀釋，每個(gè)梯度的懸浮液取100μL均勻涂布于篩選平板中，每個(gè)濃度梯度做3組平行實(shí)驗(yàn)。在36℃，濕度40%～60%的條件下，培養(yǎng)10d。培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)同濃度梯度培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算誘變致死率。將單菌落接入24孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)定慶大霉素C1a的含量，統(tǒng)計(jì)獲得正突變株的個(gè)數(shù)，計(jì)算微波誘變的正突變率，確定微波誘變時(shí)間。

(3)LiCl誘變：在超凈工作臺(tái)中，在1.5mL的EP管中加入500μL濃度為20%的氯化鋰溶液和500μL孢子數(shù)為108個(gè)/mL的單孢子懸浮液。誘變時(shí)間分別為5、10、15和20min。吸取100μL不同誘變時(shí)間的單孢子懸浮液，涂布于篩選培養(yǎng)基中，通過培養(yǎng)獲得單菌落，計(jì)算致死率。單菌落在24孔板培養(yǎng)，測(cè)定樣品含量，計(jì)算正突變率，從而確定LiCl誘變時(shí)間。

(4)ARTP和LiCl復(fù)合誘變

將500μL濃度為10%的氯化鋰溶液加入500μL孢子數(shù)為108個(gè)/mL的單孢子懸浮液中，振蕩混合5min，取20μL的LiCl誘變的單孢子懸浮液進(jìn)行ARTP誘變，誘變時(shí)間為60、90、120、150和180s。通過梯度稀釋的方式將復(fù)合誘變的單孢子懸浮液稀釋至103個(gè)/mL，取100μL加入篩選培養(yǎng)基中。計(jì)算致死率和正突變率。確定ARTP和LiCl復(fù)合誘變的條件。

1.2.4 高通量篩選誘變菌株

(1)初篩：將濃度為108個(gè)/mL的單孢子懸浮液，通過不同方式進(jìn)行誘變。稀釋一定倍數(shù)，分散涂于平板培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。挑選生長(zhǎng)旺盛，面積小且突起的孢子，接入24孔板中進(jìn)行種子培養(yǎng)43h。一方面以10%的接種量接入24孔板發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；另一方面取100μL種子液，接入孔板斜面中，進(jìn)行斜面培養(yǎng)。通過紫外分光光度法，快速檢測(cè)24孔板中發(fā)酵液效價(jià)，標(biāo)注產(chǎn)量高于對(duì)照組的菌株所對(duì)應(yīng)的孔板斜面，進(jìn)行復(fù)篩。

(2)復(fù)篩：將初篩獲得的高產(chǎn)菌株與對(duì)照組菌株的斜面接入500mL三角瓶中，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)。通過紫外分光光度法檢測(cè)搖瓶中慶大霉素C1a的含量，篩選含量高于對(duì)照組效價(jià)10%的菌株進(jìn)行下一步的菌株穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。

(3)穩(wěn)定性驗(yàn)證：將高產(chǎn)的菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)5代，記錄每一代的效價(jià)變化。挑選穩(wěn)定性好且效價(jià)高的誘變菌株。將活化的種子，按照10%的接種量，加入發(fā)酵搖瓶中進(jìn)行第一代培養(yǎng)。發(fā)酵進(jìn)行48h時(shí)，在超凈工作臺(tái)中，取出對(duì)數(shù)期的種子液，按照10%的接種量，加入發(fā)酵搖瓶中，進(jìn)行第二代培養(yǎng)。第一代發(fā)酵培養(yǎng)96h后，檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物效價(jià)，連續(xù)進(jìn)行五代培養(yǎng)。

1.2.5 高產(chǎn)穩(wěn)定性菌株5L發(fā)酵罐培養(yǎng)

在5L發(fā)酵罐中，對(duì)高產(chǎn)穩(wěn)定性菌株和出發(fā)菌株進(jìn)行分 批發(fā)酵。通過測(cè)定菌濃、殘?zhí)橇俊z氧率(oxygen uptake rate, OUR)、溶氧和產(chǎn)物效價(jià)等過程參數(shù)，考察誘變菌株的代謝特性，初步分析高產(chǎn)原因。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 慶大霉素C1a快速檢測(cè)方法的建立

2.1.1 反應(yīng)上清液pH對(duì)吸光度的影響

通過滴加H2SO4和NaOH溶液調(diào)節(jié)磷鎢酸鈉溶液與慶大霉素C1a標(biāo)準(zhǔn)液的反應(yīng)上清液的pH值。不同pH磷鎢酸鈉反應(yīng)上清液吸光值的光譜掃描圖如圖1所示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，pH為1時(shí)吸收峰在265nm處；當(dāng)pH為2時(shí)，吸收峰在255nm處；pH在3～7的范圍內(nèi)，反應(yīng)上清液吸收峰在248nm；當(dāng)pH值大于7時(shí)，上清液無特征吸收峰，慶大霉素C1a與磷鎢酸鈉溶液反應(yīng)不產(chǎn)生白色沉淀物質(zhì)。上述結(jié)論與pH對(duì)紫外分光光度法檢測(cè)慶大霉素波長(zhǎng)的影響基本一致[18]。另一方面pH在3～6時(shí)，特征吸收峰在248nm的反應(yīng)體系比較穩(wěn)定，特征峰的吸光值和波長(zhǎng)變化不大。當(dāng)樣品與磷鎢酸鈉反應(yīng)后pH值為3～6時(shí)，該方法可適用于反應(yīng)體系的檢測(cè)。

2.1.2 檢測(cè)波長(zhǎng)確定

對(duì)pH值為3的磷鎢酸鈉溶液和發(fā)酵上清液進(jìn)行光譜掃描，根據(jù)磷鎢酸鈉溶液的特征吸收峰來確定檢測(cè)波長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在波長(zhǎng)為240～260nm范圍內(nèi)，磷鎢酸鈉溶液具有特征吸收峰，發(fā)酵上清液則沒有吸收峰。并且在波長(zhǎng)為248nm時(shí)，磷鎢酸鈉與發(fā)酵液的吸光度差值最大。因此確定合適的測(cè)定波長(zhǎng)為248nm。

圖1 不同pH條件下反應(yīng)上清液的光譜掃描圖Fig.1 The spectra of the supernatant with different pH values

圖2 不同波長(zhǎng)條件下的吸光度Fig.2 The absorbance at different wavelengths

表1 溫度和時(shí)間反應(yīng)變化對(duì)吸光度的影響Tab.1 The effects of temperature and reaction time on absorbance

圖3 分光光度法慶大霉素C1a測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 The standard curve of gentamicin C1a detection by spectrophotometry

2.1.3 反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度對(duì)吸光值的影響

反應(yīng)時(shí)間和溫度是影響化學(xué)反應(yīng)達(dá)到平衡的兩個(gè)重要因素。慶大霉素C1a與磷鎢酸鈉溶液反應(yīng)，生成白色沉淀物質(zhì)。在反應(yīng)過程中反應(yīng)速度與反應(yīng)溫度有關(guān)，產(chǎn)物穩(wěn)定性與反應(yīng)時(shí)間相關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，在相同反應(yīng)時(shí)間條件下，不同溫度的吸光度數(shù)值無明顯變化，可以將室溫(25℃)作為反應(yīng)溫度。在一定溫度條件下吸光度隨著時(shí)間的增加而逐漸減小，在30min時(shí)，吸光值趨于恒定值。在最初的幾分鐘，吸光值下降較快，說明溶液快速反應(yīng)，反應(yīng)體系不穩(wěn)定，在30min之后，吸光值保持一定值，溶液穩(wěn)定。綜上所述，確定反應(yīng)液的反應(yīng)溫度為室溫(25℃)，反應(yīng)時(shí)間為30min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相同[18]。

2.1.4 慶大霉素C1a標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

在波長(zhǎng)為248nm條件下測(cè)定磷鎢酸鈉與慶大霉素C1a反應(yīng)上清液的吸光值。以慶大霉素C1a效價(jià)為橫坐標(biāo)，上清液的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制慶大霉素C1a的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

由圖3可知，當(dāng)慶大霉素C1a濃度為0～20u/mL時(shí)，慶大霉素C1a濃度與在波長(zhǎng)為248nm時(shí)的吸光度有較高的線性關(guān)系。慶大霉素C1a的含量越高時(shí)，上清液的吸光度越小。線性方程式如式(1)所示，其中C為慶大霉素C1a的濃度u/mL，A為與磷鎢酸鈉反應(yīng)后上清液吸光度，相關(guān)系數(shù)為0.9978。在波長(zhǎng)為248nm時(shí)，通過測(cè)定反應(yīng)上清液的吸光度，可以計(jì)算慶大霉素C1a的濃度。

2.1.5 高效液相色譜法與紫外分光光度法的比較

通過高效液相色譜法與紫外分光光度法分別測(cè)定發(fā)酵液中慶大霉素C1a的含量。兩種不同檢測(cè)方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，最大相對(duì)誤差為3.98%。兩種不同的檢測(cè)方法具有一致性。紫外分光光度法具有較高的準(zhǔn)確性，檢測(cè)速度快，可以應(yīng)用于高通量篩選和誘變菌株的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。

2.2 菌株的不同誘變方式

2.2.1 ARTP誘變

使用常溫室壓等離子體儀器對(duì)絳紅小單孢菌進(jìn)行誘變，在其等離子發(fā)射源與單孢子懸浮液的距離，氣體流速，輸出功率等參數(shù)一定的條件下，通過改變誘變時(shí)間，進(jìn)行誘變實(shí)驗(yàn)。誘變使用的工作氣體為高純氮(99.99%)，產(chǎn)生的等離子體溫度控制在25～35℃之間。通過計(jì)算菌體致死率，確定誘變時(shí)間。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示：隨著誘變時(shí)間的增加，孢子致死率增加，90s之前ARTP對(duì)孢子的誘變效果明顯。在120s時(shí)，致死率高達(dá)95%，180s后孢子致死率達(dá)到100%，選擇誘變時(shí)間為120s。

2.2.2 微波誘變

表2 高效液相色譜法和分光光度法測(cè)定發(fā)酵液中慶大霉素C1a含量的比較Tab. 2 Comparison of the gentamicin C1a contents in the broth determined by HPLC and spectrophotometry

在一定功率條件下，通過改變誘變時(shí)間，對(duì)單孢子懸浮液進(jìn)行微波誘變，獲得高產(chǎn)誘變單菌落。通過計(jì)算誘變致死率，確定微波誘變時(shí)間。

圖4 ARTP誘變孢子致死率Fig.4 Lethality rate of the spores by ARTP

微波誘變實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，隨著誘變時(shí)間增加，致死率升高，在150s之后致死率接近于100%。當(dāng)誘變致死率達(dá)到90%時(shí)，微波誘變時(shí)間為135s。

2.2.3 氯化鋰誘變

使用20%氯化鋰誘變?cè)噭┡c慶大霉素C1a單孢子懸浮液作用，隨著作用時(shí)間的增加，突變率增大。如圖6所示，當(dāng)誘變時(shí)間為20min后，菌體致死率只有10%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于ARTP和微波誘變方式的致死率。說明通過氯化鋰單一誘變方式誘變慶大霉素C1a菌種，致死率低，產(chǎn)生高產(chǎn)菌株的概率小?？梢圆扇RTP＋LiCl的復(fù)合誘變方式，對(duì)菌株進(jìn)行誘變。

2.2.4 復(fù)合誘變

通過ARTP與LiCl復(fù)合誘變的方式，對(duì)慶大霉素C1a單孢子懸浮液進(jìn)行誘變。通過計(jì)算致死率，確定復(fù)合誘變時(shí)間。如圖7所示，樣品菌種致死率隨著誘變時(shí)間的增加而提高，當(dāng)誘變時(shí)間為120s時(shí)，致死率高達(dá) 98%，150s時(shí)，致死率為100%。

圖5 微波誘變孢子致死率Fig.5 Lethality rate of the spores by microwave

誘變時(shí)間的確定：當(dāng)致死率達(dá)到90%時(shí)，ARTP誘變時(shí)間在90s到120s之間。復(fù)合誘變過程中加入化學(xué)試劑LiCl，可以提高菌體致死率，在90s之前高致死率的現(xiàn)象明顯，確定誘變時(shí)間為110s。

圖6 氯化鋰誘變孢子致死率Fig.6 Lethality rate of the spores by LiCl

圖7 ARTP和LiCl復(fù)合誘變孢子致死率Fig.7 Lethality rate of the spores by the combination of ARTP and LiCl

2.3 誘變菌株高通量篩選

2.3.1 初篩

通過快速檢測(cè)的方法測(cè)定發(fā)酵液效價(jià)，標(biāo)記高產(chǎn)菌株。通過不同誘變方式獲得2336株誘變菌株，經(jīng)過24孔板培養(yǎng)進(jìn)行初步篩選，測(cè)定結(jié)果如圖8所示。其中含量高于對(duì)照組誘變菌株共計(jì)475株，效價(jià)高于對(duì)照組10%的高產(chǎn)菌株有221株，其中最高效價(jià)為925u/mL，該高產(chǎn)菌株是通過LiCl和ARTP復(fù)合誘變獲得，多數(shù)誘變菌株發(fā)酵的效價(jià)低于對(duì)照組(625.7u/mL)。

2.3.2 復(fù)篩

對(duì)初篩高于對(duì)照組效價(jià)10%的誘變菌株進(jìn)行編號(hào)。其中編號(hào)為A101-A140和A201-A250是ARTP誘變方式的高產(chǎn)菌株，共計(jì)90株；W101-W130和W201-W228為微波誘變方式的高產(chǎn)菌株，共計(jì)58株；L1-L8為L(zhǎng)iCl誘變方式的高產(chǎn)菌株，共計(jì)8株；AL101-AL120、AL201-A220和AL301-AL325為ARTP+LiCl復(fù)合誘變方式的高產(chǎn)菌株，共計(jì)65株。對(duì)初篩獲得的221株高產(chǎn)菌株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，結(jié)果如圖9所示，得到高于對(duì)照組效價(jià)10%以上的突變株10株。其中復(fù)篩最高效價(jià)為950u/mL，編號(hào)為AL324。

2.3.3 慶大霉素C1a初篩、復(fù)篩實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)匯總

圖8 4種不同誘變方式的24孔板初篩結(jié)果Fig.8 The results of 4 different mutation methods with 24 MTPs in preliminary screening process

通過上述4種不同誘變方式，共計(jì)獲得2336株誘變菌株，如表3所示，其中ARTP誘變方式為841株，微波誘變方式為623株，LiCl誘變方式為452株，ARTP和LiCl復(fù)合誘變420株。正突變率分別為23%、20%、4%和33%，高產(chǎn)菌分別為193株、125株、18株和139株，共計(jì)475株。含量高于對(duì)照組含量10%的菌株為221株。其中LiCl誘變方式致死率最低，致死率僅為10%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在慶大霉素C1a菌種誘變中，LiCl只能作為輔助誘變劑使用且正突變最低。不同誘變方式的正突變株的最高效價(jià)分別為821、793、732和925u/mL，通過ARTP和LiCl復(fù)合誘變方式獲得的突變菌效價(jià)最高，與對(duì)照相比產(chǎn)量提高48%。采用復(fù)合誘變(ARTP+LiCl)的方式誘變菌株，正突變率較高。王風(fēng)芹等[19]通過ARTP和亞硝基胍對(duì)兼性厭氧產(chǎn)丁醇芽孢桿菌(Bacillussp.)C2菌株進(jìn)行復(fù)合誘變，獲得了高產(chǎn)菌株。

圖9 4種不同誘變方式的搖瓶復(fù)篩結(jié)果Fig.9 The results of 4 different mutation methods with shake flask in rescreening process

表3 不同誘變方式的初篩數(shù)據(jù)Tab. 3 The data summary of different mutation methods in preliminary screening process

通過搖瓶復(fù)篩篩選出10株效價(jià)高于對(duì)照組10%效價(jià)的誘變菌株。其中ARTP誘變方式為2株，微波誘變方式為2株，LiCl誘變方式為1株，ARTP+LiCl復(fù)合誘變方式為5株。通過搖瓶培養(yǎng)進(jìn)行復(fù)篩實(shí)驗(yàn)，在10株高產(chǎn)誘變菌株中，ARTP+LiCl復(fù)合誘變方式獲得的菌株最高效價(jià)950u/mL，編號(hào)為AL324，比出發(fā)菌株提高了52%，該誘變方式可以較大概率獲得高產(chǎn)菌株。這10株誘變菌株編號(hào)分別為A114、A213、W112、W127、L7、AL109、AL120、AL205、AL217和AL324。

2.4 高產(chǎn)菌株穩(wěn)定性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

將復(fù)篩得到的10株高產(chǎn)菌株進(jìn)行穩(wěn)定性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。將種子培養(yǎng)液按照10%的接種量加入發(fā)酵搖瓶中進(jìn)行連續(xù)5代的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證菌株的穩(wěn)定性。通過紫外分光光度法快速測(cè)定發(fā)酵液效價(jià)，結(jié)果如圖10所示：AL324、AL120、AL205和AL217在培養(yǎng)5代過程中，產(chǎn)物效價(jià)比較穩(wěn)定，可以作為高產(chǎn)菌株進(jìn)行后續(xù)相關(guān)研究。A114、A213、W112、W127、L7和AL109在培養(yǎng)2～3代之后，產(chǎn)物效價(jià)有大幅度的減少，其中A114、A213、W112、AL109效價(jià)與對(duì)照組效價(jià)(600u/mL)接近，而W127、L7低于對(duì)照組效價(jià)，這可能是由于在連續(xù)培養(yǎng)過程中菌種產(chǎn)生回復(fù)突變?cè)斐傻腫20]。

2.5 高產(chǎn)菌株5L發(fā)酵罐驗(yàn)證

由搖瓶復(fù)篩的結(jié)果可知，AL324菌株的發(fā)酵單位最高，經(jīng)過5次傳代穩(wěn)定性考察，產(chǎn)物濃度基本保持在900u/mL以上。而AL120、AL205、A217經(jīng)過5次傳代雖然發(fā)酵效價(jià)保持在800u/mL，但是明顯低于AL324高產(chǎn)菌株。鑒于此，在5L發(fā)酵罐上進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)采用出發(fā)菌株作為對(duì)照組(control)，AL324作為實(shí)驗(yàn)組，考察高產(chǎn)菌株代謝性能變化。

圖11為高產(chǎn)菌株與出發(fā)菌株過程參數(shù)對(duì)比曲線圖，分別對(duì)比了在5L發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中的菌濃、殘?zhí)恰UR、溶氧和慶大霉素C1a的發(fā)酵單位。由圖11A可知，出發(fā)菌株與高產(chǎn)菌株在發(fā)酵過程中菌濃并沒有明顯差異；圖11B中可知，高產(chǎn)菌株殘?zhí)窍陆邓俾拭黠@高于出發(fā)菌株，而在過程曲線圖11C中也明顯看到高產(chǎn)菌株耗氧能力明顯強(qiáng)于出發(fā)菌株，在40h前高產(chǎn)菌株的OUR明顯高于出發(fā)菌株；從圖11E中可以看出C1a含量AL324菌株明顯高于出發(fā)菌株，發(fā)酵96h后AL324效價(jià)能達(dá)到1193u/mL，比對(duì)照組效價(jià)提高了81.3%。綜合各曲線圖分析表明，高產(chǎn)菌株AL324代謝活性要高于出發(fā)菌株。

3 結(jié)論

圖10 高產(chǎn)穩(wěn)定性菌株驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)Fig.10 The genetic stability verification with high yield GM C1a mutants

為了得到高產(chǎn)的慶大霉素C1a生產(chǎn)菌株，本論文建立了慶大霉素C1a的快速檢測(cè)方法，在此基礎(chǔ)上采用ARTP等誘變方法和高通量篩選技術(shù)獲得了高產(chǎn)穩(wěn)定的菌株。

圖11 高產(chǎn)菌株AL324與出發(fā)菌株過程參數(shù)對(duì)比圖Fig.11 The comparison of the process parameter between the high yield mutant of AL324 and the parent strain

(1)建立了紫外分光光度法測(cè)定慶大霉素C1a含量的快速檢測(cè)方法。磷鎢酸鈉在248nm紫外波長(zhǎng)條件下有特征吸收峰，磷鎢酸鈉與慶大霉素C1a能發(fā)生反應(yīng)生成白色沉淀物質(zhì)，通過測(cè)定反應(yīng)上清液的吸光值，可以計(jì)算慶大霉素C1a的含量。結(jié)果表明，反應(yīng)上清液吸光值與慶大霉素C1a效價(jià)具有線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9978。與高效液相色譜法對(duì)比，該方法的最大相對(duì)誤差為3.98%，說明本文建立的慶大霉素C1a快速檢測(cè)方法的有效性。

(2)考察了慶大霉素C1a菌株的不同誘變方法(ARTP、微波、LiCl和ARTP+LiCl)，并通過高通量篩選獲得了高產(chǎn)穩(wěn)定的菌株。通過對(duì)2336株菌株的初篩，獲得了221株產(chǎn)量提高10%以上的菌種，通過搖瓶復(fù)篩獲得了10株菌株，其中ARTP+LiCl復(fù)合誘變產(chǎn)生的AL324菌株搖瓶效價(jià)提高了52%，復(fù)合誘變的正突變率較高。然后進(jìn)行穩(wěn)定性傳代實(shí)驗(yàn)，獲得了4株高產(chǎn)穩(wěn)定性菌株。在5L發(fā)酵罐驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，AL324菌株效價(jià)比出發(fā)菌株提高了81.3%。