GeneXpert MTB/RIF試驗在檢測利福平耐藥及耐多藥結(jié)核中的應(yīng)用評價

陳 軍，陳麗峰，任 易，饒有益，余 堅，劉 暢，肖 勇，袁保東

(武漢市肺科醫(yī)院/武漢市結(jié)核病防治所：1.檢驗科；2.結(jié)核科，湖北武漢 430030)

結(jié)核分枝桿菌對抗結(jié)核藥物的耐藥是結(jié)核病控制的主要威脅之一。耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)是指結(jié)核病患者感染的結(jié)核分枝桿菌體外藥敏試驗證實至少同時對異煙肼和利福平耐藥的結(jié)核病。而廣泛耐藥結(jié)核病(XDR-TB)是指結(jié)核病患者感染的結(jié)核分枝桿菌體外藥敏試驗證實至少同時對異煙肼和利福平耐藥外，還對任何氟喹諾酮類抗菌藥物產(chǎn)生耐藥，以及3種二線注射類藥物(卷曲霉素、卡那霉素和阿米卡星)中的至少1種耐藥的結(jié)核病。MDR-TB和XDR-TB的出現(xiàn)使得結(jié)核病流行勢態(tài)更為嚴峻，明顯影響治療的效果。

我國傳統(tǒng)的檢測結(jié)核分枝桿菌的方法主要是涂片抗酸染色、羅氏培養(yǎng)和比例法藥敏試驗。抗酸染色鏡檢方法的陽性檢出率低，而羅氏培養(yǎng)和藥敏方法耗時過長，需2～3個月，均不能滿足臨床快速診斷和藥敏的需要。GeneXpert MTB/RIF檢測試驗(簡稱Xpert)由美國Cepheid公司研發(fā)，是目前世界上唯一將DNA提取、PCR擴增和熒光檢測結(jié)合在一起，并自動進行結(jié)果報告的檢測系統(tǒng)。該系統(tǒng)采用半巢式PCR，針對rpoB基因81 bp利福平耐藥決定區(qū)(RRDR)設(shè)計了5個分子信標探針(以探針A、B、C、D、E命名)，以檢測是否有結(jié)核分枝桿菌，以及對利福平是否耐藥，同時以球芽孢桿菌(SPC)為內(nèi)對照，以判斷DNA擴增是否存在抑制[1]。Xpert不僅能用于結(jié)核的診斷，同時能獲得利福平是否耐藥，對結(jié)核病的早期診斷及控制MDR-TB的傳播有重要意義。國內(nèi)外關(guān)于Xpert在結(jié)核病診斷及利福平耐藥報道較多[2-5]，但關(guān)于Xpert在耐多藥結(jié)核的應(yīng)用評價，因試劑成本相對較高和樣本量較少而報道不多。本研究收集了本院檢驗科自2014年1月開展Xpert以來，在本院就診且Xpert與培養(yǎng)均陽性的1 300例結(jié)核病患者，探討Xpert在檢測利福平耐藥及MDR-TB的應(yīng)用價值，并進一步分析Xpert與比例法利福平藥敏結(jié)果不一致的原因。

1 材料與方法

1.1標本來源 收集2014年1月至2016年6月武漢市結(jié)核病防治所門診及病區(qū)送檢的各類標本共4 263例，包括痰、支氣管肺泡灌洗液、胸腹水、腦脊液、尿液、病理組織及穿刺物進行Xpert檢測、分枝桿菌培養(yǎng)，培養(yǎng)陽性菌株進行比例法藥敏試驗。對Xpert與比例法檢測利福平藥敏結(jié)果不一致的菌株進行rpoB基因的RRDR區(qū)測序和最小抑菌濃度(MIC)的測定。羅氏培養(yǎng)基分枝桿菌培養(yǎng)陽性1 359例，Xpert檢測結(jié)核分枝桿菌陽性1 662例，培養(yǎng)陽性而Xpert陰性59例(36例為非結(jié)核分枝桿菌),Xpert與培養(yǎng)均陽性的標本1 300例，均來自不同患者標本，剔除同一患者重復(fù)送檢標本。對1 300例Xpert與培養(yǎng)均陽性的標本納入分析。本研究經(jīng)武漢市結(jié)核病防治所倫理委員會批準。

1.2儀器與試劑 Xpert檢測系統(tǒng)及其配套試劑盒，由美國Cepheid公司提供。酸性羅氏培養(yǎng)基由檢驗科自制。中性羅氏培養(yǎng)基、異煙肼、利福平藥敏培養(yǎng)基及對硝基苯甲酸(PNB)培養(yǎng)基購自珠海貝索生物技術(shù)公司。7H9干粉和OADC均購自Difco公司。結(jié)核分枝桿菌標準株(H37Rv，ATCC27294)購自中國藥品生物制品檢定所。

1.3方法

1.3.1羅氏固體培養(yǎng) 于痰、纖維支氣管鏡灌洗液、膿汁等標本加入等量4%的氫氧化鈉，組織標本用勻漿器勻漿后加適量4%的氫氧化鈉，振蕩靜置20 min，無菌吸管吸取0.1 mL接種到酸性羅氏培養(yǎng)基上，胸腹水，腦脊液離心取沉淀直接接種中性羅氏培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第3天及每周觀察記錄結(jié)果，陰性培養(yǎng)至第56天。

1.3.2羅氏培養(yǎng)基藥敏比例法 按照《結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程》[6]進行。利福平、異煙肼的終濃度分別為40.0 μg/mL、0.2 μg/mL。

1.3.3利福平MIC測定 在專用超聲分散管中加入2.0 mL生理鹽水，取臨床分離的2～3周菌齡的新鮮培養(yǎng)物一環(huán)于分散管中，在超聲分散儀中超聲分散1 min自動比濁，用生理鹽水稀釋成1號麥氏比濁管的濁度，即配成1 mg/mL的菌懸液。將菌懸液用7H9-S肉湯進行20倍稀釋。在96孔無菌平板中，向第1～8孔各加入100 μL的7H9-S肉湯，將100 μL利福平原液(32.0 μg/mL)加入第1孔，將第1孔混勻后取100 μL，進行連續(xù)2倍稀釋至第8孔，第9孔為無抗菌藥物的陽性對照。第10孔為培養(yǎng)基無菌對照。第1～9孔每孔加應(yīng)用菌懸液100 μL。酶標板用封板紙密封，放入濕盒內(nèi)，在37 ℃孵育5 d，在第6天，加入30 μL的經(jīng)過濾除菌的0.1 g/L刃天青顯色液，繼續(xù)孵育24 h，如第9孔變成粉紅色，則加刃天青顯色液至其他各孔，再孵育24 h，記錄顏色結(jié)果。如果第9孔仍為蘭色，分別在第9、11天觀察。MIC定義為仍然保持蘭色的最低的抗菌藥物濃度。

1.3.4Xpert檢測 按試劑盒的說明書操作。Xpert對結(jié)核分枝桿菌的結(jié)果分為：結(jié)核分枝桿菌檢出(極低、低、中、高)和未檢出。Ct指探針循環(huán)閾值，ΔCt指探針早期Ct值與晚期Ct值之差。Xpert對利福平耐藥的檢測結(jié)果分為：利福平resistance檢出，ΔCt>3.5，對利福平耐藥；利福平resistance未檢出，ΔCt≤3.5，對利福平敏感。

1.3.5細菌DNA提取 用接種環(huán)刮取一環(huán)菌落至含1.0 mL生理鹽水的微量離心管。高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司,5417R)6 000×g離心10 min。在生物安全柜中打開離心管，去上清，加入無菌生理鹽水洗滌1次，6 000×g離心10 min。沉淀直接加入200 μL DNA提取液(上海生工生物工程公司)充分震蕩混勻，將EP管置于干式恒溫器中(100 ℃，10 min)，然后轉(zhuǎn)至4 ℃靜置6～8 h保證充分裂解。

1.3.6rpoB基因擴增與測序 用于擴增rpoB基因81 bp RRDR區(qū)的引物序列F 5′-CCA CCC AGG ACG TGG AGG CGA TCA CAC CG-3′、R 5′-CGT TTC GAT GAA CCC GAA CGG GTT GAC-3′[7]由上海生工生物工程公司合成。擴增片段大小為329 bp。擴增主要包括rpoB基因與利福平耐藥相關(guān)的507～533位點。反應(yīng)體系為30 μL：PCR MIX(2×) (Fermentas公司)15 μL，2 μmol/L上下游引物3 μL，滅菌蒸餾水10 μL， DNA模板2 μL。5 000×g離心片刻，置PCR擴增儀(杭州博日公司，LifeTouch TC96)中，擴增條件如下：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃ 35 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，40個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。rpoB基因測序由上海生工生物工程公司完成。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 建立Excel工作表收集實驗數(shù)據(jù)，運用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料采用百分比表示，統(tǒng)計分析采用四格表的χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。兩種方法一致性比較采用Kappa檢驗，Kappa值>0.75為優(yōu)。

2 結(jié) 果

2.11 300例培養(yǎng)陽性結(jié)核分枝桿菌對利福平和異煙肼比例法藥敏結(jié)果 1 300株結(jié)核分枝桿菌菌株中，比例法藥敏結(jié)果為1 011株對利福平敏感，289株對利福平耐藥；962株對異煙肼敏感，338株對異煙肼耐藥。MDR-TB為241株。

2.2Xpert和比例法利福平藥敏結(jié)果比較 在1 300例培養(yǎng)陽性的標本中，Xpert檢測結(jié)核分枝桿菌陽性，利福平耐藥未檢出的標本991株，利福平耐藥檢出的標本309株。二者均敏感為989株，均耐藥為287株，比例法敏感而Xpert耐藥為22株，比例法耐藥而Xpert敏感為2株。以比例法為“金標準”，Xpert檢出利福平耐藥的靈敏度為99.31%，特異度為97.82%，陽性預(yù)測值為92.88%，陰性預(yù)測值為99.80%，總符合率為98.15%，Kappa值=0.948。

2.3Xpert與比例法利福平藥敏結(jié)果不一致的菌株測序及利福平MIC測定 在22株比例法敏感而Xpert檢出耐藥的菌株中，6株在RRDR區(qū)未檢測到突變；16株在RRDR區(qū)檢測到突變，其中8株為L511P突變，MIC在0.125～0.500 μg/mL；4株為L533P突變，MIC均為0.500 μg/mL；1株為沉默突變，MIC為0.060 μg/mL；1株為D516Y突變，MIC為1.000 μg/mL；1株為F518C、L533P雙位點突變，MIC為2.000 μg/mL；1株為D516Y、F518D雙位點突變，MIC為0.500 μg/mL。在2株比例法耐藥而Xpert為敏感的菌株中，1株在RRDR區(qū)未檢測到突變，MIC為0.500 μg/mL；1株在RRDR區(qū)外存在E546G突變，MIC為8.000 μg/mL。見表1。

表1 24株Xpert與比例法利福平藥敏不一致菌株的RRDR測序及MIC結(jié)果

續(xù)表1 24株Xpert與比例法利福平藥敏不一致菌株的RRDR測序及MIC結(jié)果

注：SP為痰液；BALF為支氣管肺泡灌洗液；S為敏感；R為耐藥；-表示無此項

2.4不同治療類型患者利福平耐藥突變探針的檢出比例 309例患者利福平耐藥突變檢出的探針分布情況見表2。

表2 309例患者利福平耐藥突變檢出的探針比例[n(%)]

表3 利福平耐藥突變檢出的309例患者對應(yīng)菌株的比例法藥敏結(jié)果[n(%)]

注：R為利福平；H為異煙肼

2.5利福平耐藥突變檢出的309例患者對應(yīng)菌株的比例法藥敏結(jié)果 在利福平耐藥突變檢出的309例患者中，MDR-TB為239例，其中初治為94例，復(fù)治為145例。初復(fù)治患者中，雖然復(fù)治患者MDR-TB的占比比初治患者稍高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.552，P=0.458)。309例患者對應(yīng)菌株的表型藥敏結(jié)果見表3。

3 討 論

利福平通過與結(jié)核分枝桿菌DNA依賴的RNA聚合酶β亞單位結(jié)合而阻止該酶與合成RNA的底物三磷酸核苷結(jié)合，阻斷RNA轉(zhuǎn)錄過程，使RNA和蛋白的合成停止，從而導(dǎo)致細菌死亡。RNA聚合酶的β亞單位由rpoB基因編碼，結(jié)核分枝桿菌對利福平耐藥主要因為rpoB基因發(fā)生突變所致。這些改變主要是集中在rpoB中的81個堿基區(qū)域(利福平耐藥決定區(qū))內(nèi)的各種突變，也有少量堿基插入或缺失。95%以上的利福平耐藥與rpoB基因突變有關(guān)。本研究以比例法藥敏為“金標準”，Xpert利福平耐藥檢出的靈敏度為99.31%，特異度為97.82%，陽性預(yù)測值為92.88%，陰性預(yù)測值為99.80%，Xpert與比例法藥敏的一致性為優(yōu)(Kappa值=0.948)，與國內(nèi)外報道相一致[5,8]。如果以測序結(jié)果(22例比例法敏感的菌株中16例均檢測到突變)進行較正，陽性預(yù)測值從92.88%提高到98.06%。說明表型藥敏可能會導(dǎo)致部分低度耐藥菌漏檢，分子檢測手段一定程度彌補了表型檢測的不足。

在22例表型敏感而Xpert利福平耐藥檢出不一致的標本中，分離菌株經(jīng)基因測序有16株檢測出突變，6株未檢出突變。突變以有爭議的L511P、L533P檢出為主，這2個位點突變在表型藥敏中多表現(xiàn)為敏感或低度耐藥，MIC測定結(jié)果在0.125～0.500 μg/mL，因此容易出現(xiàn)結(jié)果不一致的情況。對于6例測序無突變的標本中，有4例E探針，1例B探針和1例C探針檢出突變，MIC為0.125 μg/mL，為敏感，可能是探針循環(huán)閾值延遲導(dǎo)致的假陽性，或者由于Xpert用的是原始標本而基因測序用的是培養(yǎng)陽性的菌株，兩類樣本中的優(yōu)勢菌群不同導(dǎo)致結(jié)果不一致。MARLOWE等[9]報道有3株測序無突變而Xpert檢出耐藥，均顯示為B探針循環(huán)閾值延遲。而RUFAI等[10]研究則為E探針循環(huán)閾值延遲。在2例表型耐藥而Xpert利福平耐藥未檢出的標本中，1例在81 bp的RRDR之外檢測到E546G突變，1例未檢測到突變，可能是RRDR之外其他區(qū)域的突變或為異質(zhì)性耐藥[11-13]。

在測序結(jié)果中，筆者發(fā)現(xiàn)1例沉默突變菌株(測序結(jié)果CCG520CCA,氨基酸改變P520P)。該菌株Xpert檢測為耐藥，比例法檢測為利福平敏感，MIC為0.060 μg/mL。國內(nèi)外許多其他的研究也報道了在81 bp的RRDR區(qū)沉默突變[14-17]。因此，在少數(shù)病例中，Xpert并不能區(qū)別沉默突變，從而可能導(dǎo)致假陽性。

在Xpert試驗設(shè)計的5條覆蓋507-533位點的探針中，E探針對應(yīng)528-533位點，D探針對應(yīng)523-527位點，C探針對應(yīng)518-522位點，B探針對應(yīng)513-517位點，而A探針對應(yīng)507-512位點。在309例檢出利福平突變探針中，以E探針(65.70%)、D探針(14.56%)和B探針(10.68%)為主，這與利福平耐藥突變位點以531、526、516位點為主一致[18-19]。本研究結(jié)果與其他報道的探針比例相符[14,20-21]。需要注意的是，單獨A探針共檢出11例突變，雖然在全部檢出突變的探針中比例不高(3.56%)，但其中8例A探針所檢測的511位點突變表型藥敏為敏感，提示A探針檢出突變易出現(xiàn)與表型藥敏結(jié)果不一致，這與GURBANOVA等[22]報道相一致。

利福平耐藥可作為耐多藥結(jié)核的標志物，有報道超過90%的耐利福平的菌株對異煙肼耐藥[1,4,23]。本研究結(jié)果顯示，在309例Xpert檢出利福平耐藥的菌株中，MDR-TB占77.35%，雖在復(fù)治患者中MDR-TB的比例(78.80%)稍高于初治患者(75.20%)，但初、復(fù)治患者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。這說明對于Xpert檢出利福平耐藥時，不管患者是否為初治還是復(fù)治，應(yīng)高度懷疑耐多藥的可能。OCHERETINA等[15]報道153例Xpert檢出利福平耐藥的菌株中，MDR-TB占86.9%，高于本研究結(jié)果，可能與菌株來源不同及地區(qū)差異有關(guān)。

4 結(jié) 論

Xpert試驗適用于利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌的早期快速檢測，具有較高的敏感度和特異度，可用于MDR-TB的快速篩查，但必要時還需要結(jié)合患者用藥史和表型藥敏情況來綜合判斷。