白細(xì)胞介素16對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的影響及其機(jī)制研究

戈 旺，王 博，閆風(fēng)連，徐國梅，靳 峰，張青青，馬 群，司傳平△

(1.青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，山東青島 266071；2.濟(jì)寧市婦幼保健計(jì)劃生育服務(wù)中心，山東濟(jì)寧 272000；3.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與分子醫(yī)學(xué)研究所，山東濟(jì)寧 272067；4.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科，山東濟(jì)寧 272029；5.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，山東濟(jì)寧272029)

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是由血管壁中脂質(zhì)滯留及其觸發(fā)的免疫反應(yīng)引起的一種慢性炎癥性疾病。巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞，以及多種細(xì)胞因子參與AS斑塊形成及其穩(wěn)定性下降[1-3]。白細(xì)胞介素16(IL-16)可由T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等分泌產(chǎn)生[4-5]。已有研究表明，IL-16能夠促進(jìn) CD4+T細(xì)胞、單核細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞的遷移，尤其對(duì)CD4+T淋巴細(xì)胞具有強(qiáng)烈的趨化作用[6]。但是，也有研究發(fā)現(xiàn)IL-16具有抗炎作用，可增加人外周血單個(gè)核細(xì)胞中FoxP3的表達(dá)，并降低T細(xì)胞對(duì)活化信號(hào)的反應(yīng)，從而發(fā)揮潛在的免疫負(fù)向調(diào)節(jié)作用[7]。IL-16在AS相關(guān)疾病中的作用尚存在分歧。一方面，有研究提示IL-16可加劇AS進(jìn)程使斑塊趨向不穩(wěn)定，從而引發(fā)卒中和心肌梗死等[8]；另一方面，IL-16在斑塊中的水平與卒中、心肌梗死等疾病呈負(fù)相關(guān)，提示IL-16可能具有維持斑塊穩(wěn)定性的作用[9]。目前，尚缺乏IL-16對(duì)于AS影響的直接證據(jù)，且IL-16影響AS的具體機(jī)制也不明確。本研究擬通過分析AS外周血IL-16水平和AS小鼠模型IL-16水平干預(yù)，初步探討IL-16在AS患者和小鼠外周血和AS斑塊中的表達(dá)水平，以及IL-16在AS發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2015年8月至2016年8月在濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院就診并行冠狀動(dòng)脈造影檢查確定為AS的患者30例作為病例組，其中男13例，女17例，年齡42～83歲，平均64歲。全部病例均為新發(fā)病例。選取同期體檢健康者29例作為健康對(duì)照組，其中男12例，女17例，年齡36～75歲，平均62歲。每位受試者空腹抽取靜脈血3 mL入凝血管，另抽取2 mL入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝血管備用。凝血管2 000 r/min，離心10 min分離得到血清，-80 ℃保存?zhèn)溆?。本研究?jīng)過濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有調(diào)查者簽署知情同意書。濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科獲取具有代表性2例AS患者頸總動(dòng)脈斑塊剝脫術(shù)后斑塊標(biāo)本備用。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用無特定病原體(SPF)級(jí)ApoE-/-小鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，養(yǎng)于12 h光照周期、恒溫恒濕SPF環(huán)境。相關(guān)飼養(yǎng)及處置遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利原則及濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的要求。

1.2儀器與試劑 Cytation5細(xì)胞成像酶標(biāo)儀購自美國BioTek公司，Heraeus Multifuge X1R高速冷凍離心機(jī)及TRIzol和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自美國Thermo Fisher公司。FTC-200 PCR儀購自英國Fedbio公司。顯微鏡型號(hào)為日本OLYMPUS IX-ILL30。IL-16酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司。脂多糖(LPS)購自美國Sigma公司，SYBR Green Master Mix購自Vazyme公司。兔抗人IL-16一抗、羊抗兔二抗及CD3抗體均購自英國Abcam公司。

1.3方法

1.3.1ELISA檢測(cè)血清IL-16表達(dá)水平 采用ELISA檢測(cè)血清IL-16表達(dá)水平，參照ELISA檢測(cè)試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)說明進(jìn)行操作，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出IL-16血清水平。

1.3.2外周血單個(gè)核細(xì)胞IL-16的mRNA水平測(cè)定 密度梯度法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞。Trizol法提取標(biāo)本中單個(gè)核細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)(RT-qPCR)?？傮w系10 μL：SYBR Green Master Mix 5 μL，Primer-Reverse 0.5 μL，Primer-Forward 0.5 μL，DDW 3 μL，cDNA 1 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品均設(shè)置復(fù)孔并至少檢測(cè)3次。結(jié)果分析采用2-ΔΔCt法，其中ΔΔCt=(樣本的Ct值-內(nèi)參的Ct值)-(對(duì)照組Ct值-內(nèi)參的Ct值)。

1.3.3重組小鼠IL-16的表達(dá)與鑒定 構(gòu)建IL-16和谷胱甘肽融合蛋白原核高表達(dá)載體pGEX-IL16-GST，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后鑒定并挑選成功轉(zhuǎn)化菌落于30 ℃，空氣浴搖床80 r/min培養(yǎng)過夜。待細(xì)菌濃度吸光度值達(dá)到0.5時(shí)，加入終濃度為0.1 mmol/L IPTG，37 ℃ 150 r/min繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h。離心收獲細(xì)菌，提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)GST吸附柱富集IL-16+GST融合蛋白，進(jìn)一步經(jīng)Western blot鑒定。

1.3.4免疫組化檢測(cè)斑塊中IL-16的表達(dá) 從濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科收集患者頸總動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫術(shù)后AS斑塊石蠟切片；頸椎脫臼處死AS模型小鼠后，沿腹中線剪開皮膚和胸骨后取腹主動(dòng)脈根部，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗去血凝塊后迅速放于4%多聚甲醛中固定48 h，然后常規(guī)石蠟包埋切片。分別對(duì)切片進(jìn)行HE染色和免疫組化染色，然后在顯微鏡(OLYMPUS IX-ILL30)下觀察拍照。

1.3.5IL-16對(duì)AS小鼠斑塊形成的影響 采用ApoE-/-雄性小鼠20只,雌雄各半，將其隨機(jī)分為兩組，每組10只。兩組均給予0.25%膽固醇和15%可可油喂食8周。實(shí)驗(yàn)組高脂喂養(yǎng)小鼠于第4周每周1次腹腔注射重組IL-16(每只2 μg)，連續(xù)注射4周；對(duì)照組小鼠同時(shí)給予腹腔注射同等劑量PBS。兩組均在4周后處死小鼠，取小鼠主動(dòng)脈根部制備連續(xù)石蠟切片。

2 結(jié) 果

2.1病例組與健康對(duì)照組外周血IL-16水平比較 應(yīng)用ELISA檢測(cè)研究對(duì)象外周血IL-16水平，病例組IL-16水平明顯高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1A。病例組患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中IL-16 mRNA水平明顯高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1B。

注：A為ELISA檢測(cè)外周血IL-16水平；B為RT-qPCR檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞中IL-16的mRNA水平;與健康對(duì)照組比較，*P<0.05

圖1病例組和對(duì)照組外周血IL-16水平及單個(gè)核細(xì)胞中IL-16的mRNA水平比較

2.2IL-16在人和ApoE-/-小鼠AS斑塊中高表達(dá) 通過免疫組化檢測(cè)AS患者頸總動(dòng)脈剝脫術(shù)后斑塊中IL-16水平，發(fā)現(xiàn)AS患者AS斑塊局部IL-16表達(dá)水平高于其周圍非斑塊區(qū)，見圖2A。免疫組化染色顯示非高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠IL-16表達(dá)明顯比高脂喂養(yǎng)AS ApoE-/-小鼠IL-16表達(dá)水平低，見圖2B、2C。

注：A為AS斑塊局部IL-16表達(dá)水平；B為非高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠IL-16表達(dá)水平；C為高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠IL-16表達(dá)水平

圖2人頸總動(dòng)脈剝脫術(shù)斑塊應(yīng)小鼠斑塊IL-16免疫組化染色(200×)

2.3腹腔注射IL-16可減小高脂喂養(yǎng)AS ApoE-/-小鼠斑塊面積，提高斑塊穩(wěn)定性 HE染色顯示，與對(duì)照組高脂喂養(yǎng)AS ApoE-/-小鼠腹腔注射PBS的相比，注射重組IL-16可減小小鼠AS斑塊的總面積，而且注射PBS對(duì)照組小鼠斑塊中CD3+細(xì)胞數(shù)量明顯多于注射IL-16小鼠主動(dòng)脈斑塊中CD3+細(xì)胞數(shù)量，見圖3。此外，與腹腔注射PBS的小鼠對(duì)照組AS斑塊相比，腹腔注射IL-16的小鼠斑塊相對(duì)穩(wěn)定，并未破裂，見圖3C、3D。

注：A為腹腔注射PBS的高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠斑塊HE染色(200×)；B為腹腔注射IL-16的高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠斑塊HE染色(200×)；C為腹腔注射PBS的高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠斑塊CD3+免疫組化染色(400×)；D為腹腔注射IL-16的高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠斑塊CD3+免疫組化染色(400×)

圖3小鼠主動(dòng)脈根部斑塊HE染色和CD3+免疫組化染色

3 討 論

IL-16在哮喘、過敏及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種自身免疫性疾病中發(fā)揮促炎并加劇病情的作用[10-13]，但其在AS疾病中的作用尚存在分歧。一方面，李秀芹等[8]的研究發(fā)現(xiàn)冠心病患者IL-16水平較健康人群高，并據(jù)此認(rèn)為體內(nèi)升高的IL-16可能增加干擾素γ(IFN-γ)、IL-1β、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-15等促炎細(xì)胞因子以及CD40L的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)AS斑塊的形成，促使斑塊不穩(wěn)定，導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈血栓形成。另一方面，有研究報(bào)道IL-16在斑塊中的水平可能與卒中、心肌梗死等AS相關(guān)疾病的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)[9]。GR?NBERG等[14]的研究發(fā)現(xiàn)頸動(dòng)脈斑塊中高水平的IL-16與斑塊的穩(wěn)定性表型相關(guān)。這種穩(wěn)定性表型以增加的彈性蛋白、膠原蛋白和FoxP3為特征，并在平均21個(gè)月的隨訪期內(nèi)較少發(fā)生術(shù)后心血管事件。這提示IL-16可能具有維持斑塊穩(wěn)定和減輕疾病的作用?？傊壳暗难芯績H局限于觀察IL-16和臨床癥狀之間的關(guān)系，且研究結(jié)果存在分歧，缺乏IL-16影響AS斑塊的直接證據(jù)。

本文在前人研究的基礎(chǔ)上檢測(cè)了臨床患者IL-16的水平，證實(shí)AS患者外周血中IL-16蛋白水平及mRNA水平均明顯高于健康人群，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且在患者頸總動(dòng)脈斑塊局部發(fā)現(xiàn)IL-16高表達(dá)。提示IL-16與AS存在密切關(guān)系。為進(jìn)一步研究IL-16對(duì)AS斑塊的影響，本研究把誘導(dǎo)純化的IL-16腹腔注射到ApoE-/-小鼠模型體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)IL-16可以有效地減小斑塊形成、降低斑塊內(nèi)CD3+細(xì)胞的含量、增加斑塊穩(wěn)定性。這提示IL-16在AS疾病中可能發(fā)揮保護(hù)性的作用。

IL-16是一種具有多種功能的細(xì)胞因子。一般認(rèn)為IL-16主要發(fā)揮促進(jìn)炎癥的作用，但也有研究發(fā)現(xiàn)IL-16具有抵抗炎癥的作用。有研究者發(fā)現(xiàn)，IL-16可增加FoxP3的表達(dá)，并降低T細(xì)胞對(duì)刺激的反應(yīng)，具有潛在的免疫調(diào)節(jié)作用[9]。MCFADDEN等[7]的研究表明IL-16優(yōu)先吸引調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的遷移，且被IL-16吸引的調(diào)節(jié)細(xì)胞表達(dá)更高水平的FoxP3。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-16干預(yù)導(dǎo)致小鼠斑塊局部CD3陽性水平顯著降低，局部炎癥減輕。提示IL-16在小鼠AS模型中可能更多地發(fā)揮抗炎作用，并且可能由此導(dǎo)致AS負(fù)荷的降低。

本研究結(jié)果表明，IL-16可以減小斑塊面積，減輕斑塊局部炎癥水平，發(fā)揮抵抗AS斑塊形成、增加斑塊穩(wěn)定性的作用，提示IL-16在AS中可能發(fā)揮保護(hù)性的作用。AS患者血清和斑塊中IL-16的水平升高可能是由疾病導(dǎo)致的補(bǔ)償性反應(yīng)。本研究結(jié)果提示，IL-16可能作為一種監(jiān)測(cè)AS發(fā)展和預(yù)后的指標(biāo)，也是治療AS的新靶點(diǎn)。但本研究還存在一些不足之處，選取研究對(duì)象數(shù)量較少，后續(xù)研究會(huì)選擇更大量的研究樣本，以期為臨床提供更加可靠的參考。

4 結(jié) 論

本研究通過檢測(cè)AS患者外周血、AS斑塊組織及AS小鼠動(dòng)脈斑塊，證實(shí)IL-16在AS患者外周血和AS小鼠斑塊中均高表達(dá)。通過腹腔注射AS小鼠重組IL-16，發(fā)現(xiàn)IL-16可能具有穩(wěn)定AS斑塊的作用。