基于生物信息學(xué)分析的卵巢癌微小RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的初步構(gòu)建

李丹丹，丁世家，陳維賢△

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 400010;2.重慶醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016)

卵巢癌是婦科最常見腫瘤之一，病死率極高、預(yù)后差，是女性健康的嚴(yán)重威脅之一[1]。由于卵巢癌沒有特殊的預(yù)防措施，同時(shí)多數(shù)患者早期表現(xiàn)隱匿，不易引起重視，診斷明確往往已屬晚期，失去治療及手術(shù)最佳時(shí)期，臨床提倡早發(fā)現(xiàn)、早治療，因此，疾病發(fā)病機(jī)制的研究對(duì)早期診斷及防控具有重要的臨床意義[2]。大量研究顯示，卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展受到多種基因的調(diào)控，微小RNA(miRNA)及長鏈非編碼RNA(lncRNA)是兩類重要的RNA，參與細(xì)胞生長的一系列重要進(jìn)程，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡及死亡等過程，其在基因轉(zhuǎn)錄及翻譯過程中調(diào)控具有極為重要的作用，在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中，miRNA表達(dá)失調(diào)將導(dǎo)致細(xì)胞的過度增殖、過度分化，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。由于miRNA介導(dǎo)的基因調(diào)控在卵巢癌中發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全闡明。鑒于將循證生物學(xué)信息分析和實(shí)驗(yàn)論證相結(jié)合，有利于從循證研究角度為miRNA、lncRNA及靶基因關(guān)聯(lián)的進(jìn)一步研究提供研究證據(jù)。本研究采用現(xiàn)代分析軟件，在生物信息學(xué)分析基礎(chǔ)上初步構(gòu)建卵巢癌miRNA及匹配lncRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，探討miRNA在卵巢癌細(xì)胞中的分子調(diào)控機(jī)制，為卵巢癌的早期診斷、早期治療提供有力的參考依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1資料來源 基因分析中常用的miRNA及l(fā)ncRNA分析數(shù)據(jù)庫：miRwalk 2.0數(shù)據(jù)庫(網(wǎng)址：http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/index.html)[3]；HMDD v2.0數(shù)據(jù)庫(網(wǎng)址：http://www.cuilab.cn/hmdd)[4]；starBase v2.0(網(wǎng)址：http://starbase.sysu.edu.cn/)[5]；lncRNA 疾病數(shù)據(jù)庫(網(wǎng)址：http://www.cuilab.cn/lncrnadisease)[6]。

1.2研究方法 以“ovarian cancer”為關(guān)鍵詞，通過miRwalk 2.0軟件及HMDD v2.0查詢已證實(shí)與卵巢癌相關(guān)的miRNA，根據(jù)相應(yīng)miRNA在miRwalk 2.0軟件文獻(xiàn)鏈接出現(xiàn)頻次進(jìn)行篩選，明確出現(xiàn)研究頻次大于7的相對(duì)高頻miRNA 7個(gè)，通過miRwalk 2.0明確其對(duì)應(yīng)靶基因表達(dá)情況。在lncRNA疾病數(shù)據(jù)庫查詢與卵巢癌相關(guān)的lncRNA，并運(yùn)用 starBase v2.0 對(duì)所得到的miRNA和lncRNA進(jìn)行綜合分析，得到與上述miRNA相互作用的且與卵巢癌相關(guān)的lncRNA，最終繪制miRNA在卵巢癌中的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.3分析方法 將卵巢癌相關(guān)miRNA、lncRNA及靶基因均錄入Excel 2007，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述分析，miRNA在卵巢癌中的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)采用Cytoscape軟件制圖[7]。

2 結(jié) 果

2.1卵巢癌相關(guān)miRNA及靶基因 通過對(duì)miRwalk 2.0數(shù)據(jù)庫及HMDD v2.0數(shù)據(jù)庫同時(shí)查詢并進(jìn)行整理后，初步發(fā)現(xiàn)卵巢癌相關(guān)的 miRNA共172個(gè)，其中有8篇以上文獻(xiàn)報(bào)道的miRNA有hsa-let-7a、hsa-mir-21、hsa-miR-16、hsa-mir-17、hsa-mir-19b、hsa-mir-29a、hsa-mir-92a。運(yùn)用 miRwalk 2.0 分析上述7個(gè)miRNA的靶基因，基因查找及靶基因篩選結(jié)果見表1。

表1 HMDD v2.0及miRwalk 2.0數(shù)據(jù)庫中與卵巢癌相關(guān)的miRNA

2.2與卵巢癌密切相關(guān)的miRNA的lncRNA 通過lncRNA數(shù)據(jù)庫查閱卵巢癌相關(guān)lncRNA條目，共查詢到38條結(jié)果，將lncRNA通過miRwalk 2.0軟件，通過 lncRNA Gene Symbol及miRNA進(jìn)行關(guān)聯(lián)，明確lncRNA Gene與7個(gè)高頻基因，見表2。

表2 miRwalk 2.0數(shù)據(jù)庫卵巢癌相關(guān)的miRNA對(duì)應(yīng)lncRNA

2.3經(jīng)Cytoscape軟件繪制miRNA在卵巢癌中的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 通過對(duì)卵巢癌相關(guān)高頻miRNA及卵巢癌相關(guān)性文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)相應(yīng)基因在卵巢癌調(diào)控中具有重要作用，如hsa-let-7a高表達(dá)對(duì)卵巢癌具有一定保護(hù)作用，高表達(dá)患者具有相對(duì)更低的死亡風(fēng)險(xiǎn)[8]。hsa-mir-21在卵巢癌患者中具有高表達(dá)的趨勢(shì)[9]，hsa-miR-16通過介導(dǎo)多種基因的表達(dá)從而對(duì)卵巢癌治療預(yù)后產(chǎn)生影響，has-mir-17通過對(duì)ITGA5和ITGB1等靶基因作用于卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移產(chǎn)生作用。各目標(biāo)miRNA與miRwalk 2.0數(shù)據(jù)庫中查閱到高頻作用基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)見圖1。通過lncRNA疾病數(shù)據(jù)庫查詢與卵巢癌相關(guān)lncRNA有17個(gè)，運(yùn)用starBase v2.0對(duì)所得到的miRNA和lncRNA進(jìn)行綜合分析發(fā)現(xiàn)，lncRNA X(染色體)失活特異性轉(zhuǎn)錄物(XIST)、H19、HOXA11-AS、PVT1、TUG、GAS5、HOTAIR、MALAT1的表達(dá)均有一定作用，其中以XIST在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展過程中起到較為中心的作用，上述所有miRNA均對(duì)XIST的表達(dá)及調(diào)控具有一定作用，具體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)見圖2。

圖1 miRNA及相關(guān)基因在卵巢癌中的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

圖2 miRNA及相關(guān)lncRNA在卵巢癌中的

3 討 論

研究分析miRNA與疾病的關(guān)系對(duì)疾病的診斷及治療具有重要意義[10-11]。研究顯示，人類約1/3的基因轉(zhuǎn)錄及翻譯受miRNA調(diào)控。作為長度僅為20～24個(gè)核苷酸的小分子RNA，miRNA不僅維持正常細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能，而且其表達(dá)異常對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展亦具有重要作用。因此，通過miRNA介導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)控是腫瘤防治的重要方向。本研究通過對(duì)miRwalk 2.0等miRNA及基因數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)挖掘，利用其大數(shù)據(jù)分析功能對(duì)卵巢癌相關(guān)miRNA及數(shù)據(jù)庫中靶基因進(jìn)行整合及聚類分析，從而實(shí)現(xiàn)卵巢癌miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的初步構(gòu)建。復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中，單個(gè)miRNA可同時(shí)對(duì)多個(gè)靶基因進(jìn)行調(diào)控，同一基因也可能受到多個(gè)miRNA的調(diào)控，本研究發(fā)現(xiàn)hsa-let-7a、hsa-mir-21、hsa-miR-16、hsa-mir-17、hsa-mir-19b、hsa-mir-29a、hsa-mir-92a等7個(gè)基因均參與了多種基因表達(dá)的調(diào)控，如圖1所示，hsa-let-7a同時(shí)參與了WEE1、KLHL15、MBNL1、ZNF460、AGO1、MYC、DICER1、TNFRSF10B、CCND2、CCND1、BCL2等多基因調(diào)控。而基因WEE1則同時(shí)受到hsa-mir-21、hsa-miR-16、hsa-mir-17、hsa-mir-19、hsa-mir-29a、hsa-mir-92a等多種miRNA調(diào)控，如此多種miRNA與基因的調(diào)控構(gòu)成一個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對(duì)卵巢癌的生長及分化等多過程進(jìn)行調(diào)節(jié)。

lncRNA是一類200 nt的RNA，大量研究顯示其在癌基因表達(dá)調(diào)控中具有轉(zhuǎn)錄激活、修飾、調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能。本研究通過數(shù)據(jù)庫檢索卵巢癌相關(guān)lncRNA條目，共查詢到38條結(jié)果，將lncRNA通過miRwalk 2.0軟件，通過lncRNA Gene Symbol 對(duì)miRNA進(jìn)行關(guān)聯(lián)，明確了lncRNA基因與7個(gè)高頻基因，這與已報(bào)道的卵巢癌相關(guān)lncRNA基因具有一致性[12]。如圖2所示，lncRNA XIST作為核心調(diào)控因子與高頻miRNA相互作用介導(dǎo)卵巢癌基因調(diào)控，lncRNA H19也具有重要作用，這與國外相應(yīng)研究結(jié)論基本一致[3]。lncRNA也可以作為一種競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA(ceRNA)與miRNA相互作用，lncRNA與miRNA之間具有相互調(diào)控關(guān)系，并通過調(diào)控靶基因的表達(dá)，在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

4 結(jié) 論

卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移是多因素作用的結(jié)果，miRNA及l(fā)ncRNA均在上皮性卵巢癌中的侵襲、轉(zhuǎn)移方面有著重要意義。miRwalk、HMDD、starBase等是常用的生物信息學(xué)分析數(shù)據(jù)庫，可有效地用于miRNA與疾病關(guān)系研究[13]。本研究利用生物信息學(xué)分析技術(shù)成功描繪了一張與卵巢癌相關(guān)的miRNA分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為卵巢癌相關(guān)分子機(jī)制研究、早期診斷、早期治療提供了有力的技術(shù)支撐。