一次離心法制備大、小鼠富血小板血漿實驗條件的優(yōu)化

孫振威，倉寶成，寧 群，趙敬湘，李鵬龍

(1.解放軍第153中心醫(yī)院臨檢中心,河南鄭州 450042；2.解放軍第153中心醫(yī)院神經內科,河南鄭州 450042；3.軍事科學院軍事醫(yī)學研究院衛(wèi)生勤務與血液研究所,北京 100850)

研究表明，富血小板血漿(PRP)因含有多種生長因子，如血小板源生長因子(PDGF)、轉化生長因子(TGF-β)、血管內皮生長因子(VEGF)、胰島素樣生長因子(IGF-1)、成纖維細胞生長因子(bFGF)等，在參與止血的同時，具有調控細胞增殖與分化，刺激血管和周圍神經再生，促進傷口愈合等功能[1-3]。人們開展了大量的動物實驗探索PRP在醫(yī)療領域的應用前景。然而，由于PRP的制備方法各不相同，產品質量參差不齊，研究者在相似的實驗中往往得到不同甚至相反的實驗結果[4-5]，嚴重影響了血小板相關研究的可靠性。

大、小鼠作為實驗動物在PRP的研究中具有很多優(yōu)點，如與人的基因同源性高，便于基因修飾，適于分子機制研究；有大量的鼠源抗體，便于進行免疫學研究；藥品用量少，適于體內輸注實驗等[6-8]。大、小鼠血小板的提取方法也有很多種，既有白膜法，也有富血小板血漿法；既有二次離心法，也有一次離心法[9-15]。研究表明，小動物血小板提取過程中，由于血量較少，采用白膜法第一次離心后形成的血小板堆積層很薄，手工分離難度較大，故推薦采用富血小板血漿法[16]。同時，一次離心法的血小板提取率雖不及二次離心法，但其獲得的血小板活性明顯高于二次離心法，更適于血小板功能試驗[17]。本研究旨在優(yōu)化一次離心法制備大、小鼠PRP的實驗條件，篩選出一種穩(wěn)定可靠的血小板提取方法，為血小板相關研究提供參考。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級雄性Wistar大鼠(270～340 g)購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[動物合格證號：SCXK(京)2012-0001]；SPF級雄性BALB/C小鼠(11～13周齡，24～28 g)購自軍事科學院軍事醫(yī)學研究院動物中心[動物合格證號：SCXK-(軍)]。常規(guī)飼養(yǎng)，實驗當天從動物房取出。

1.2實驗器材 小動物呼吸機(D79232 March，德國HSE)，無紡布濾器(X30，江蘇東潤)，高速離心機(Z-16PK，德國SIGMA)，動物血液分析儀(950FS，英國HEMAVET)，F(xiàn)S-PAK鞘液(英國Drew Scientific，批號：570265249)，戊巴比妥鈉(北京化學試劑公司，化學純)，肝素鈉(國藥集團，批號：20131016)，CPDA-1血液保養(yǎng)液(美國SIGMA-ALDRICH，貨號：C4431)，0.9%氯化鈉注射液(石家莊四藥有限公司)。

1.3實驗方法

1.3.1麻醉 配制2.5%(g/mL)戊巴比妥鈉溶液，分別腹腔注射0.23%、0.35%(容積/大、小鼠的體質量)的戊巴比妥鈉溶液麻醉大、小鼠。

1.3.2取血 配制0.3%(g/mL)肝素鈉溶液，濕潤管壁后進行大鼠左側股動脈插管放血，每只大鼠放血10 mL，加入14% CPDA-1抗凝，實驗一次取血30 mL。對小鼠行氣管插管通氣，以吸入0.14 mL CPDA-1的注射器心臟穿刺取血1 mL，實驗一次取血18 mL，貼壁緩慢注入50 mL離心管中，混勻[18]。

1.3.3濾白 超凈工作臺中，取出無菌濾器(濾過直徑5～10 μm)，上端連接拔除針頭和內芯的10 mL注射器，下端緊貼另一離心管管壁，將全血緩慢注入上端注射器管內，依靠重力作用使血液自然濾過。

1.3.4離心 將濾除白細胞的血樣每份1.5 mL分裝入無菌的5 mL EP管中，封口膜封口，22 ℃條件下離心。血樣分成兩層，上層為PRP層，下層為紅細胞層。超凈工作臺中用移液器轉移上層PRP于另一無菌EP管中。離心過程中以離心力和離心時間為考察因素，進行正交設計。大鼠血樣離心過程中離心力分別取300×g、400×g、500×g、600×g 4個水平，小鼠血樣離心過程中離心力分別取300×g、400×g 2個水平，離心時間均取4、6、8、10、12 min 5個水平，每個試驗點重復3次，見圖1。

注：A為14%CPDA-1抗凝全血；B為白細胞濾除過程；C為濾白全血離心后血液分層

圖1 PRP提取過程

1.3.5計數 測定抗凝全血、濾除白細胞后的血樣和離心后的上層PRP體積，各自混勻后取100 μL用動物血液分析儀進行細胞計數，計算白細胞濾除率和不同離心方法的血小板回收率。白細胞濾除率=1-(濾除白細胞后血樣體積×血樣中白細胞計數)/(抗凝全血體積×全血中白細胞計數)；血小板回收率=(富血小板血漿體積×富血小板血漿中血小板計數)/(濾除白細胞后血樣體積×血樣中血小板計數)。

2 結 果

2.1白細胞濾除率 大、小鼠抗凝全血白細胞濾除率分別為(88.32±4.18)%和(85.16±6.06)%，濾除白細胞前后血樣中紅細胞、血小板計數結果差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2大鼠血小板回收率 在4～12 min的時間段內，隨著離心時間的延長，300×g離心力條件下，血小板回收率逐漸升高；400×g離心力條件下，血小板回收率先升高再降低，并在離心8 min時達到峰值；500×g和600×g離心力條件下，血小板回收率逐漸降低。見表1。

表1 不同離心條件下大鼠血小板回收率(%)

2.3小鼠血小板回收率 在4～12 min時間段內，隨著離心時間的延長，300×g離心力條件下，血小板回收率先升高再降低，并在離心8 min時達到峰值；400×g離心力條件下，血小板回收率逐漸降低。見表2。

表2 不同離心條件下小鼠血小板回收率(%)

3 討 論

全血中各組分的密度不同是離心法提取血小板的基礎。在離心過程中，紅細胞由于密度最大最先沉降于底部，血漿由于密度最小而形成上清層，白細胞和血小板的密度介于紅細胞和血漿之間，隨著離心過程的深入逐漸堆積于兩者之間形成白膜層。本研究選用的無紡布濾器可有效濾除直徑10 μm以上的白細胞，且對直徑5 μm以下的血小板有良好的透過性[19]，提高了一次離心法制備PRP的純度。一次離心法制備PRP實驗條件優(yōu)化的意義在于尋找到形成白膜層前的臨界狀態(tài)，以盡可能簡單并最大量獲取上層血漿中的血小板。

離心法提取血小板過程中影響血小板回收率的因素有很多，如采血過程、抗凝方法、樣本量、離心力、離心加速度、離心時間、離心溫度、離心機類型等，其中以離心力和離心時間影響最為顯著[16]，本研究在固定其余參數的基礎上，重點對這兩項實驗條件進行了優(yōu)化。Kü?üK等[10]、MAMMOTO等[11]和HOSHI等[13]采用一次離心法提取大、小鼠血小板時多把離心力設定在100×g～700×g，離心時間設定在5～15 min。根據預實驗結果，以300×g～600×g的離心力和4～12 min的離心時間為考察因素，進行正交試驗設計，綜合考察了二者對血小板回收率的交互影響作用。

研究表明，離心力相同的情況下，隨著離心時間的延長，PRP的體積逐漸增大，PRP中血小板的計數值逐漸減少。隨著離心力的增加，PRP體積增大的速度和PRP中血小板計數減少速度加快。探尋最佳離心條件的過程即是在PRP體積與PRP血小板計數值此消彼長的過程中獲取二者最大乘積時的離心力和離心時間。本實驗發(fā)現(xiàn)，大、小鼠抗凝全血濾除白細胞后分別以400×g和300×g的離心力離心8 min時，血小板回收率最高。離心力和離心時間應該保持在一定范圍內，不宜過大或過小。如果離心力過小或離心時間過短，則離心后分離出來的PRP體積有限，血小板回收率較低。相反，如果離心力過大或者離心時間過長，則血液中的血小板大部分進入白膜層，PRP中血小板計數值很低，血小板回收率同樣不高。

4 結 論

選擇合適的離心力和離心時間，達到白膜形成前的臨界狀態(tài)，是一次離心法制備PRP的關鍵。本次實驗條件范圍內，大、小鼠抗凝全血濾除白細胞后分別以400×g和300×g的離心力離心8 min時，血小板回收率最高。