艾灸對克羅恩病大鼠結(jié)腸c-Jun氨基末端激酶信號通路的影響＊

張 霽，吳麗潔，李志元，吳煥淦,，楊延婷,，李茜瑩，吳丹艷，智方圓，洪 玨，劉 婕，張 丹,＊＊，馬曉芃,＊＊

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué) 上海 201203；2.上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所 上海 200030；3.浙江省中醫(yī)院 杭州 310006）

克羅恩?。–rohn's Disease，CD）是消化科常見疑難病，以結(jié)腸局灶性、非特異性的炎癥損傷和肉芽腫為主要病變特征，在世界范圍內(nèi)其發(fā)病率逐年升高[1，2]。CD患者反復(fù)經(jīng)歷腹痛、腹瀉、便血等癥狀，生活質(zhì)量降低，其腸外表現(xiàn)多樣，且并發(fā)癥多嚴重兇險[3，4]。誘導(dǎo)并維持臨床緩解以及黏膜愈合，防治并發(fā)癥，改善患者生命質(zhì)量是國內(nèi)較為公認的炎癥性腸?。ò肆_恩病和潰瘍性結(jié)腸炎）的治療目標(biāo)[5]。因此，防治早中期CD、促使臨床緩解、延緩疾病進展具有十分重要的意義。

近年來，研究證實艾灸雙側(cè)天樞、氣海穴等對CD患者臨床癥狀、生活質(zhì)量有良好的改善作用[6；7]。艾灸具有促進結(jié)腸血液循環(huán)、增強腸道蠕動、修復(fù)結(jié)腸損傷黏膜、調(diào)節(jié)結(jié)腸免疫反應(yīng)、提高患者自愈率以及減少病變復(fù)發(fā)等作用，有療效溫和、治療感受度好等特點，尤其在改善結(jié)腸炎患者腹痛、腹瀉等各種癥狀方面有著較好的效果[8；9]。盡管艾灸治療CD的短期療效和長期療效已被普遍認可，但其作用機制依舊不十分明確。深入揭示艾灸治療CD的作用機制有助于促進艾灸在CD治療中的應(yīng)用與推廣。慢性、非特異性、透壁性炎癥反應(yīng)是CD的根本病變，CD患者局部結(jié)腸存在大量炎性細胞浸潤和各種細胞因子的異常表達[5，10]。有研究證實，絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）參與了CD結(jié)腸的炎癥反應(yīng)和組織損傷，該通路的靶向抑制有助于結(jié)腸炎的緩解[11，12]。艾灸對CD有較好的抗炎及促進黏膜愈合的作用[13-15]，是否與MAPK信號通路調(diào)節(jié)有關(guān)？目前尚未見相關(guān)研究。因此，本課題采用三硝基苯磺酸（2，4，6 Trinitrobenzene-sulfonic acid，TNBS）合乙醇溶液灌腸建立CD大鼠模型，觀察艾灸對CD大鼠結(jié)腸單核細胞趨化因子1（Monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1）、環(huán)氧合酶2（Cyclooxygenase 2，COX2）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、核轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的影響，從JNK信號通路調(diào)節(jié)角度，探討艾灸治療CD及其抗炎效應(yīng)的可能免疫學(xué)機制，為艾灸治療CD療效機制的闡明提供科學(xué)實驗資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性清潔級SD（S prague-Dawley）大鼠36只，體質(zhì)量（150±20）g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，合格證號：SCXK（滬）2013-0016，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心。飼養(yǎng)條件：清潔級，8∶00-20∶00光照、20∶00-8∶00黑暗，溫度（20±1）℃，濕度50%左右，自由飲水、攝食。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，大鼠飲食、活動正常后開始實驗。SD大鼠隨機分為正常組、模型組、艾灸組和假灸組，每組9只。本實驗經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器

5%TNBS（Sigma公司）；Trizol（Invitrogen公司）；DEPC水（基爾頓生物公司）；SYBR Green PCR試劑盒（Thermo公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas公司）；MCP-1、COX2、JNK、c-Jun ELISA檢測試劑盒（武漢基因美生物公司）；蘇木素染色液（南京建成生物公司）；伊紅染色液（南京建成生物公司）；戊巴比妥鈉（國藥集團有限公司）；異丙醇、無水乙醇、氯仿、二甲苯、中性樹膠（國藥集團有限公司）。

熒光顯微鏡及senscell分析軟件（Olympus公司）；PCR檢測儀（ABI公司）；酶標(biāo)儀（Labsystems Multiskan公司）；洗板機（Thermo Labsystems公司）；組織脫水機、包埋機、切片機、攤片機（Leica公司）。

1.3 CD模型制備

采用TNBS合乙醇溶液灌腸制備CD模型[16]。開始前大鼠禁食、不禁水24 h，將無水乙醇加雙蒸水配成50%乙醇，然后將TNBS與50%乙醇按照體積比2∶1混合成TNBS灌腸液；稱重后以生理鹽水配置的2%戊巴比妥鈉（30 mL?kg-1）行腹腔注射麻醉，造模大鼠以TNBS灌腸液3 mL?kg-1灌腸。具體操作：大鼠體位為頭下尾上，將灌腸針緩緩插入大鼠肛門6-8 cm，注入灌腸液，拔出灌腸針以后再將大鼠倒立1-2 min，以防灌腸液溢出。每7 d重復(fù)灌腸1次，共4次。造模結(jié)束后，每組隨機抽取1只大鼠，進行結(jié)腸蘇木素-伊紅染色（Hematoxylin-eosin staining，HE），以確定模型制備是否成功。在確定模型制備成功的基礎(chǔ)上，開始干預(yù)治療。

1.4 分組與處理

艾灸組，采用隔藥灸治療，選取天樞（雙側(cè)）、氣海穴，每次每穴各灸2壯（約10 min），每日1次，共7次。藥餅主藥為附子粉，灸前用黃酒調(diào)和，并用動物專用模具制成藥餅。用模具將艾絨壓實制成錐形艾炷，艾炷重量為90 mg，置于藥餅上，點燃艾炷施灸。假灸組取穴、藥餅、艾炷操作均同艾灸組，但不點燃艾炷，每次留置10 min，每日1次，共7次。模型組與正常組不進行任何治療，只作與艾灸組相同的抓取與固定。

1.5 樣本處理

各組大鼠禁食、不禁水24 h，腹腔注射戊巴比妥鈉進行麻醉。沿大鼠腹正中線剪開腹部皮膚，充分暴露直腸、結(jié)腸部分，自恥骨聯(lián)合處-盲腸取下結(jié)腸，沿腸系膜縱軸剖開，取自上而下的3 cm結(jié)腸組織，用4℃冷生理鹽水沖洗，分成3段，1段放入4%多聚甲醛溶液內(nèi)固定；2段放入凍存管置于液氮內(nèi)，后移入-80℃冰箱保存。

1.6 指標(biāo)檢測方法

1.6.1 結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)觀察

采用HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)變化。主要步驟：結(jié)腸組織脫水、包埋、切片、烤片處理，二甲苯、梯度酒精中脫蠟脫水，蘇木素染色，1%鹽酸酒精分化，溫水返藍，0.5%伊紅染色，再依次經(jīng)梯度酒精至水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察并進行結(jié)腸組織學(xué)評分。

表1 JNK、c-Jun mRNA實時熒光定量PCR引物設(shè)計

1.6.2 結(jié)腸MCP-1、COX2、JNK、c-Jun蛋白濃度的檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（Enzyme Linked Immunoserbent Assay，ELISA）測定。按照ELISA檢測試劑盒說明書，按適當(dāng)比例稀釋待測樣本，于96孔板中依次加入待測樣本、親和素、酶標(biāo)試劑，充分混勻，37℃孵育。去除以上液體，再依次加入顯色劑A、顯色劑B，充分混合，37℃避光顯色。最后，加入終止液終止顯色反應(yīng)。酶標(biāo)儀450 nm波長下測定OD值，蛋白含量與OD值之間呈正線性關(guān)系，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出標(biāo)本中目的蛋白的濃度。

1.6.3 結(jié)腸JNK、c-Jun的mRNA表達檢測

采用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）檢測，主要步驟包括：①組織總RNA的抽提；②總RNA中DNA的消除：DNaseⅠ 1 μL；10×DNaseⅠBuffer 1 μL；總RNA≦1 ng；DEPC-H2O nμL。③逆轉(zhuǎn)錄cDNA：RNA-Primer Mix 12 μL；5×RT Reaction Buffer 5 μL；25 mM dNTPs 1 μL；25 U/μL RNase Inhibitor 1 μL；200 U/μL M-MLV Rtase 1 μL；Oligo(dt)181 μL；ddH2O(DNase-free)4 μL。PCR 擴增：SYBR Green Mix 12.5 μL；Primer F 0.5 μL；Primer R 0.5 μL；ddH2O 9.5 μL；cDNA模板2 μL。④Real-time PCR擴增。擴增條件：95℃，10 min(95℃，15 Sec；60℃，45 Sec)×40；95℃，15 Sec；60℃，1 min；95℃，15 Sec；60℃，15 Sec。記錄Ct值，以GAPDH作為內(nèi)參，通過2-△Ct法計算目的蛋白mRNA的相對表達水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析，對各組數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布和方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布或近似正態(tài)分布的資料采用xˉ±s的形式表示；不符合正態(tài)分布的資料采用Median(Q25，Q75)的形式表示。若各組方差齊等，直接采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）進行檢驗，如果檢驗結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義則進一步采用LSD檢驗做兩兩比較。若各組方差不齊，采用非參數(shù)檢驗。結(jié)果以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)觀察

光鏡下觀察，正常組大鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整，黏膜上皮連續(xù)覆蓋，黏膜固有層單層杯狀細胞、腺腔排列整齊，黏膜下層為疏松結(jié)締組織，未見水腫或增生。模型組大鼠結(jié)腸損傷嚴重，主要表現(xiàn)為結(jié)腸局部黏膜上皮層缺失，裂隙性潰瘍形成，黏膜下結(jié)締組織明顯水腫伴大量淋巴細胞浸潤，黏膜下層可見成團單核巨噬細胞聚集，局部杯狀細胞增生明顯，腺腔排列不規(guī)則；與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評分顯著增加（P＜0.01）。艾灸組大鼠結(jié)腸組織損傷明顯改善，表現(xiàn)為黏膜上皮層完整，大量杯狀細胞增生，單層杯狀細胞、腺腔排列尚整齊，黏膜下層結(jié)締組織輕度水腫，可見少量膠原纖維及淋巴細胞浸潤；與模型組、假灸組比較，艾灸組結(jié)腸組織病理學(xué)評分均降低（均P＜0.01，P＜0.05）。與模型組比較，假灸組大鼠結(jié)腸損傷無明顯減輕，評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖1，表2）。

2.2 結(jié)腸MCP-1、COX2蛋白濃度的檢測結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸MCP-1、COX2蛋白濃度明顯增高（均P＜0.01）。與模型組比較，艾灸組大鼠結(jié)腸MCP-1、COX2蛋白濃度明顯降低（P＜0.01，P ＜ 0.05）；假灸組大鼠結(jié)腸MCP-1、COX2蛋白濃度無明顯變化（均P＞0.05）。與假灸組比較，艾灸組大鼠結(jié)腸MCP-1、COX2蛋白濃度顯著降低（P＜0.01，P ＜ 0.05）（表3）。

2.3 結(jié)腸JNK蛋白濃度及mRNA表達的檢測結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸JNK蛋白濃度及mRNA表達均明顯增加（均P＜0.01）。與模型組比較，艾灸組大鼠結(jié)腸JNK蛋白濃度及mRNA表達均減低（均P＜0.01）；假灸組大鼠JNK蛋白濃度及mRNA表達無明顯變化（均P＞0.05）。與假灸組比較，艾灸組大鼠結(jié)腸JNK蛋白濃度及mRNA表達均顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）（表4）。

2.4 結(jié)腸c-Jun蛋白濃度及mRNA表達的檢測結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸c-Jun蛋白濃度及mRNA表達均無顯著變化（均P＞0.05）。與模型組比較，艾灸組、假灸組大鼠結(jié)腸c-Jun蛋白濃度及mRNA表達均無顯著變化（均P＞0.05）（表5）。

3 討論

盡管口服藥物或生物制劑的研發(fā)和應(yīng)用日趨成熟，但諸多報道顯示CD的靶向治療存在療效個體差異性和副反應(yīng)不明確等問題，已有研究提出兩個以上藥物聯(lián)合的多靶點治療或有助于提高臨床療效，但結(jié)果尚待考證[17]。傳統(tǒng)針灸療法對機體的調(diào)節(jié)作用是多系統(tǒng)、多靶點的，能較好地發(fā)揮多向性治療效應(yīng)，在緩解CD患者臨床癥狀和促進黏膜愈合同時，避免了一些不良反應(yīng)，是一種值得關(guān)注和推薦于臨床治療CD的有效手段。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，艾灸對CD大鼠結(jié)腸組織損傷和炎癥反應(yīng)有一定緩解作用，或與其對JNK信號通路調(diào)節(jié)有關(guān)，為艾灸治療IBD機制的闡明提供了科學(xué)實驗資料和研究思路。

MAPK信號通路激活被證實與IBD結(jié)腸炎性損傷關(guān)系密切[11]。MAPK家族的信號通路一般主要包括胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（Extracellular signal regulated kinase，ERK）、c-Jun氨基末端激酶/應(yīng)激激活蛋白激酶（JNK/SAPK）、p38MAPK、ERK5。JNK下游常見的轉(zhuǎn)錄因子有Jun家族（c-Jun、JunB、JunD）、ATF-2、c-Myc、NFAT家族、STAT家族，大部分轉(zhuǎn)錄因子磷酸化主要增加了轉(zhuǎn)錄活性，誘導(dǎo)基因表達[18]。已有研究發(fā)現(xiàn)，靶向抑制p38信號通路可以調(diào)節(jié)CD大鼠結(jié)腸上皮細胞凋亡，促進結(jié)腸損傷修復(fù)，但臨床研究并未有充分證據(jù)證實口服p38蛋白酶抑制劑在CD治療中的療效，其他家族激酶ERK、JNK、ERK5少有研究報道[19，20]。盡管存在爭議，但有12例的小樣本臨床觀察提示聯(lián)合抑制JNK和p38對CD病人疾病指數(shù)（CD Activity Index，CDAI）、結(jié)腸損傷有明顯緩解作用，提示靶向調(diào)節(jié)JNK可能是治療CD的有效機制[21]。本課題從JNK信號通路調(diào)控角度，研究艾灸治療CD、發(fā)揮抗炎效應(yīng)的作用機制，結(jié)果顯示艾灸下調(diào)了結(jié)腸JNK蛋白和mRNA的表達，降低結(jié)腸炎性蛋白MCP-1、COX2的含量，提示艾灸可能通過抑制結(jié)腸JNK信號通路進而減少結(jié)腸MCP-1、COX2等炎性蛋白的含量發(fā)揮緩解腸道炎癥、促進結(jié)腸損傷修復(fù)的作用，這與部分從ERK、NF-κB途徑研究的報道有所不同[15；22]。另外，我們的研究發(fā)現(xiàn)艾灸對結(jié)腸c-Jun蛋白和mRNA表達沒有調(diào)節(jié)作用，是否與本研究未檢測該蛋白的磷酸化活性、抑或是通過JNK通路其他下游轉(zhuǎn)錄因子的激活發(fā)揮作用，需待進一步的研究以進一步證實。

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織HE染色結(jié)果（×200倍）

表2 各組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評分的比較

表3 各組大鼠結(jié)腸MCP-1、COX2蛋白濃度的比較

表4 各組大鼠結(jié)腸JNK蛋白濃度及mRNA表達的比較

表5 各組大鼠結(jié)腸c-Jun蛋白濃度及mRNA表達的比較

研究發(fā)現(xiàn)，JNK的上游激活機制受到諸多因素影響，胞外白介素17（Interleukin 17，IL-17）、IL-1β、腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor α，TNF-α）均可激活胞內(nèi)JNK上游激酶，使信號傳導(dǎo)至JNK，JNK再通過磷酸化一系列底物進一步將信號傳遞至下游核轉(zhuǎn)錄因子，促進IL-1β、TNF-α、誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（Inducible nitric oxide synthase，iNOs）、前列腺素 E2（Prostaglandin E2，PGE2）等炎性因子表達[23]。盡管課題組前期研究工作提示，隔藥灸對CD大鼠結(jié)腸IL-17、IL-1β、TNF-α（JNK上游激活信號）有良好調(diào)節(jié)作用，參與了緩解炎癥、促進結(jié)腸損傷愈合，但依舊缺少與之相關(guān)的信號通路級聯(lián)激活的系統(tǒng)研究[24-26]。因此，本研究深入觀察了這些胞外激活信號下游的JNK信號通路，從調(diào)節(jié)JNK信號通路角度闡釋艾灸治療CD的抗炎機制。由于艾灸對機體的調(diào)節(jié)作用是多靶點、多角度的，因此今后尚需進一步從ERK、p38MAPK通路角度開展艾灸治療克羅恩病機制研究，以期系統(tǒng)全面地揭示艾灸對克羅恩病MAPK信號通路的調(diào)控機制。