中蒙藥材藜蘆質(zhì)量標準研究＊

杜曉鸝，馬 嵐，王 敏，格根塔娜，劉曉平，郭麗穎，那生桑

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學 呼和浩特 010110）

藜蘆（學名：Erratum Grumman L.）是百合科植物藜蘆的干燥根及根莖，多年生草本植物；蒙藥名阿格西日嘎，別名都日吉德、黑藜蘆。味苦且辛，性平。效銳、糙、重、浮、稀，有毒。具有催吐，瀉下、祛痰、殺蟲的功效。主治中風痰壅、癲癇、喉痹等；外用治疥癬、惡瘡、殺蟲蛆[1]。藜蘆整顆皆有毒性，尤其根和根莖的毒性最強。藜蘆的毒素主要為其所含有的生物堿類，總稱為藜蘆總堿。其中原藜蘆堿毒性最強，介藜蘆胺次之[2，3]。藜蘆生于海拔1200-3300米的山坡林下或草叢中。主產(chǎn)于中國東北、河北、山東、河南、山西、陜西、內(nèi)蒙古、甘肅、湖北、四川和貴州等地。同時亞洲北部和歐洲中部也有其分布?！督鸸庾⑨尲穂4]中提及采收季節(jié)不同，導致其功效差異：“都日吉德的氣味隨季節(jié)變化，氣味在催吐或瀉下功效上起到主導的作用，用于催吐則于嫩苗時采集，用于瀉下則于8-9月份果期采集”。

藜蘆為蒙古族習用藥材，是藏醫(yī)藥古籍中“都日吉德”的蒙古地區(qū)替代品。近代蒙醫(yī)大師羅布桑教授在其學術(shù)著作《蒙藥學羅布桑學術(shù)著作大成》㈦中記載有：“杜日吉德和京大戟相近，具有瀉下和催吐功能”，并對其進行原植物考證，認為都日吉德的原植物為大戟科植物中尼大戟（黑.都日吉德，上品）和喜馬拉雅大戟（白.都日吉德，下品）。羅布桑教授在藜蘆藥材描述中記載道：“藜蘆為百合科多年草本黑藜蘆及同屬植物的根和根莖，5-6月抽花莖前采收，除去莖葉，曬干。蒙醫(yī)臨床上用藜蘆替代都日吉德”。吳香杰教授主編的《蒙藥炮制學》陌中介紹“都日吉德的原植物中尼大戟，產(chǎn)于西藏，來源稀少，尚無商品藥材，內(nèi)蒙地區(qū)將藜蘆用作都日吉德”。

蒙藥藜蘆炮制方法的記載有“用于催吐，則無需炮制直接入藥；用于瀉下則同大麥共炒后入藥”。蒙醫(yī)催吐法用應用范圍較廣，用于食積不化、食痞、中毒癥、痧癥等。臨床上用腎葉橐吾、刺參、藜蘆為主藥，與菖蒲、光明鹽、蓽拔各等量配伍，并根據(jù)病癥辯證加味治療，急催用丸劑，緩催用湯劑，服用時間以黎明為宜。蒙藥中藜蘆屬瀉下藥，《晶珠本草》[5]中記載有：“都日吉德是寒熱癥總瀉藥”；藜蘆在蒙醫(yī)臨床中用于瀉下、脈瀉、鼻瀉、導瀉和催吐療法。藜蘆多載于蒙藥復方，經(jīng)炮制后入藥，用于治療各種“希拉”病、蟲癥、不消化癥、黃水癥等。近年來，對藜蘆屬植物中的甾體生物堿類研究較多，目前從國產(chǎn)藜蘆中已分離出70余種甾體生物堿。最新的化學和藥理研究表明，藜蘆甾體生物堿也是合成環(huán)巴胺（cyclopedia）類抗腫瘤藥物的有效先導物[6]。藜蘆藥材在《中華人民共和國衛(wèi)生部藥材標準·蒙藥分冊》中載有藜蘆十二味丸[7]，其中藜蘆藥材質(zhì)量標準尚未完善，因此藜蘆為部頒倒掛品種，亟待制定藥材質(zhì)量標準。本品作為中藥材收載于湖南、山東、江西、貴州、吉林、新疆、四川?。ㄗ灾螀^(qū)）中藥材標準中，載有性狀鑒別、顯微鑒別、理化鑒別、薄層鑒別、水分檢測項，未有含量測定項；其TLC鑒別項中對照品有原藜蘆堿A（《山東省中藥材標準2002》）和白藜蘆醇（《湖南省中藥材標準2009》）。本品主含甾體生物堿，生物堿是其有效成分也是其毒性成分。我國有二十余種藜蘆屬植物，經(jīng)研究比較發(fā)現(xiàn)，不同品種的藜蘆屬植物其生物堿的種類和含量差異較大[8，9]，因此，對生物堿成分制定含量限度，對藜蘆藥材合理應用具有重要意義。

表1 供試品水份含量試驗測定結(jié)果

1 薄層鑒別

1.1 藜蘆中介芬胺、藜蘆胺、白藜蘆醇的薄層鑒別

1.1.1 試劑及藥材

丙酮（分析純）、冰乙酸（分析純）、藜蘆胺標準品由成都瑞芬思生物科技有限公司提供（批號：L-100-170622）、介芬胺標準品由成都瑞芬思生物科技有限公司提供（批號：S-143-170926）、白藜蘆醇標準品由國家食品藥品研究院提供（批號：111535-201703）藜蘆藥材分別為安徽亳州河北安國四川成都（所有藥材均由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學生藥教研室渠弼教授鑒定為百合科植物藜蘆的干燥根及根莖）

1.1.2 對照品溶液的制備

取介芬胺，藜蘆胺，白藜蘆醇對照品，加甲醇制成1 mg·L-1的溶液，作為對照品溶液。

1.1.3 供試品溶液的制備

分別取不同產(chǎn)地7批次藜蘆樣品粉末2 g，加甲醇20 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘留物加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。

1.1.4 展開

吸取對照品溶液5 μL、供試品溶液10 μL，分別點于三塊硅膠G薄層板上，以石油醚（60-90℃）—乙酸乙酯—甲酸（4∶3∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視，結(jié)果供試品與介芬胺、藜蘆胺、白藜蘆醇對照品溶液在薄層板相應的位置上顯相同顏色的熒光斑點。

2 一般檢查項研究

2.1 水分測定

照《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄IXH水分測定法第一法（烘干法）測定七批樣品水分。

步驟：精密稱取供試品2 g，研細，平鋪于干燥至恒重的扁形稱量瓶中，厚度不超過5 mm，疏松供試品不得超過1 mm，精密稱定，打開瓶蓋在100-l05℃干燥5小時，將瓶蓋蓋好，移置干燥器中，冷卻30分鐘，精密稱定，再在上述溫度干燥1小時，冷卻，稱重，至連續(xù)兩次稱重的差異不超過5 mg為止。根據(jù)減失的重量，計算供試品中含水量（%）在（0.0133%-0.1800%）范圍之內(nèi)，未發(fā)生霉變。（2010年版《藥典》（一部）規(guī)定中藥根、根莖類用藥含水量在（9.0%-15.0%）為霉變（表1）。

2.2 酸不溶性灰分測定

照（《中國藥典》2010年版一部附錄IXK酸不溶性灰分測定法）測定七批樣品酸不溶性灰分。

步驟：精密稱取藥材3 g于坩堝中，將坩堝放入馬弗爐烘六小時取出，及時放入干燥器待冷卻稱重，再放入馬弗爐1 h，取出于干燥器冷卻稱重，兩次差值小于0.0003恒重完以后。既上相所得灰分，取上項所得灰分，在坩堝中小心加入稀鹽酸約10 mL，用表面皿覆蓋坩堝，置水浴上加熱10分鐘，表面皿用5 mL熱水沖洗，洗液并入坩堝中，用無灰濾紙濾過，坩堝內(nèi)的殘渣用水洗于濾紙上，并洗滌至洗液不顯氯化物反應為止。濾渣連同濾紙移置同一坩堝中，干燥，熾灼至恒重。根據(jù)殘渣重量，計算供試品中酸不溶性灰分的含量（%）在（11.5196%—89.4963%）范圍內(nèi)（表2）。

2.3 浸出物測定

照《中華人民共和國藥典》一部附錄XA醇溶性浸出物熱浸法測定法測定。

步驟：精密稱取供試品2 g，研細，精密稱定，置100 mL的錐形瓶中，精密加70%乙醇溶液50 mL，密塞，稱定重量，靜置1小時后，連接回流冷凝管，加熱至沸騰，并保持微沸1小時。放冷后，取下錐形瓶，密塞，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，用干燥濾器過濾，精密量取濾液25 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105°C干燥3小時，置干燥器中冷卻30分鐘，迅速精密稱定重量。除另有規(guī)定外，以干燥品計算供試品中醇溶性浸出物的含量（%）在（6.1742%-16.3767%）范圍內(nèi)（表3）。

3 含量測定

3.1 實驗器材設(shè)備、試劑及藥材

儀器：高效液相色譜儀（島津LC-20A）

3.1.1 試劑

色譜乙腈，色譜甲醇，超純水；其他試劑均為分析純。

3.2 溶液的制備

3.2.1 對照品溶液的制備

取介芬胺對照品適量，精密稱定，加甲醇制成毎1 mL含0.95 mg的介芬胺溶液，作為對照品溶液。

3.2.2 供試品溶液的制備

取藜蘆藥材粉末（過篩）約2.0000 g，稱量，至具塞錐形瓶中，加入26%的濃氨試液5 mL，浸潤1小時，加三氯甲烷-甲醇（體積4∶1）混合溶液40 mL，稱重，混勻。在80℃水浴上加熱回流2小時，放冷，再稱量，用三氯甲烷-甲醇（體積4∶1）混合溶劑補減失的重量，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，蒸干，殘渣加甲醇溶解并定量轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，即得供試品溶液。

表2 供試品酸不溶性灰分測定結(jié)果

表3 供試品浸出物測定結(jié)果

3.2.3 色譜條件

色譜柱：sickroom 100-5-C18色譜柱（5 μL，4.6 mm×250 mm）；流動相：以乙腈為流動相A，以0.1%三乙胺水和0.1%甲酸水的混合溶液為流動相B梯度洗脫；流速1 mL?min-1；進樣量10微升；檢測波長250 nm；柱溫：18℃（表4）。

表4 梯度洗脫程序

3.3 線性關(guān)系考察

精密吸取對照品溶液1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL置10 mL量瓶中，用流動相稀釋并定容至刻度，搖勻。精密吸取上述各濃度對照品溶液10 μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積。結(jié)果峰面積與進樣量之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=1359280x+3125.4，（Y為峰面積積分值，X為進樣量）（圖1）。

圖1 介芬胺標準曲線

3.4 精密度試驗

取對照品溶液10 μL，按上述色譜條件，重復進樣6次，其相對保留時間穩(wěn)定，記錄峰面積，計算RSD%為1.77%，結(jié)果表明：儀器等整個檢測系統(tǒng)的精密度良好。

3.5 穩(wěn)定性試驗

取藜蘆粉末2.0 g，精密稱定，按樣品制備方法操作制備供試品溶液，分別于0，1，2，4，8，12小時進樣，樣品介芬胺峰面積的RSD為2.06%，說明供試品溶液在12小時之內(nèi)較穩(wěn)定（表5）。

表5 供試品溶液穩(wěn)定性試驗結(jié)果

3.6 重復性試驗

取同一批次藜蘆粉末6份，精密稱定，每份取樣量約為2.0 g，按照供試品溶液制備項下方法，連續(xù)制備6份供試品溶液，依次測定，記錄峰面積，計算RSD為2.04%，說明供試品分析的結(jié)果穩(wěn)定，表明該方法的重復性良好（表6）。

表6 重復性試驗結(jié)果

3.7 加樣回收率試驗

取同一批次藜蘆粉末6份，精密稱定，每份取樣量約為1.0 g，精密加入對照品0.0024 mg，按供試品溶液制備方法制備加樣回收試樣，按上述色譜條件測定，計算平均加樣回收率為100.6%，RSD為2.00%，說明方法可行（表7）。

表7 加樣回收試驗結(jié)果

3.8 樣品含量測定

分別取7個不同購買產(chǎn)地批次的藜蘆，按“供試品溶液的制備”項下的方法操作并測定其介芬胺的含量（表8）。

4 小結(jié)

本文分別采用介芬胺，藜蘆胺，白藜蘆醇作為對照品，對7批次樣品進行薄層鑒別，結(jié)果供試品與介芬胺、藜蘆胺、白藜蘆醇對照品溶液在薄層板相應的位置上顯相同顏色的熒光斑點。相比之下，介芬胺斑點顏色更為清晰，含量較大，可作為藜蘆質(zhì)量標準中薄層鑒別項下的檢查項之一。

檢測波長的選擇：參考文獻中對其它植物中介芬胺的提取檢測波長條件，并通過紫外分光光度儀吸光度值來確定藜蘆里介芬胺的含量測定，最佳吸收波長為250 nm。

流動相的選擇：采用乙腈為流動相A，0.1%三乙胺水和0.1%甲酸水的混合溶液為流動相B梯度洗脫，以洗脫時間20-30 min，A-B（30∶70）出峰時間適中，色譜峰峰形理想，分離度較好（圖2）。因此，選此條件作為流動相。

根據(jù)本實驗測定結(jié)果，可以看出不同地區(qū)所購買的藜蘆中介芬胺含量在5.74-6.98%之間，藜蘆質(zhì)量標準正文含量測定項暫定為：本品每1克含介芬胺（C27H39N03）的含量不得少于5.74 mg·g-1。

5 討論

薄層色譜圖可見：供試品與白藜蘆醇對照品相應的位置顯相同顏色的熒光斑點但顏色淺，表明7批藥材里均含有白藜蘆醇，但含量少；供試品與介芬胺對照品相應的位置顯相同顏色的熒光斑點且明顯，表明7批藥材里均含有介芬胺，且含量多；供試品與藜蘆胺對照品相應的位置顯相同顏色的熒光斑點但不明顯，表明7批藥材里均含有藜蘆胺，但含量少。含量的多少可能受到藥材生長年限、采集時間等因素的影響。

本實驗所購買的藜蘆，其中亳州和安國據(jù)經(jīng)銷商表述產(chǎn)地為東北，重慶產(chǎn)地四川。對此7批次樣品進行介芬胺的薄層鑒別、含量測定及比較，初步證實東北、四川產(chǎn)地藜蘆中介芬胺含量差異不顯著，但樣品采集、收集量較局限，尚不能就此得出全國其他地區(qū)所產(chǎn)介芬胺含量情況。

表8 樣品測定結(jié)果（n=2）

圖2