脂質(zhì)氫過(guò)氧化物氧化對(duì)核桃分離蛋白結(jié)構(gòu)的影響

王丹丹，孫領(lǐng)鴿，毛曉英

(石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子，832000)

脂肪氧合酶(lipoxygenase，LOX)廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)，它可以通過(guò)分子內(nèi)加氧的方式催化多不飽和脂肪酸氧化產(chǎn)生脂質(zhì)氫過(guò)氧化衍生物[1]，脂質(zhì)氫過(guò)氧化衍生物能夠攻擊食品中的蛋白質(zhì)組分，引起蛋白質(zhì)發(fā)生氧化，降低食品品質(zhì)[2-3]。蛋白質(zhì)氧化使得蛋白主鏈發(fā)生斷裂、氨基酸殘基側(cè)鏈發(fā)生改變以及形成蛋白質(zhì)交聯(lián)物[4]。目前研究發(fā)現(xiàn)，LOX催化多不飽和脂肪酸發(fā)生氧化，產(chǎn)生具有破壞活性的自由基，使得蛋白質(zhì)之間相互作用，最終形成聚集體[5-6]；LOX誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的風(fēng)味和某些功能性質(zhì)發(fā)生不期望的變化[7-8]；HUANG的研究結(jié)果也表明，LOX催化亞油酸的產(chǎn)物能夠改變大豆蛋白的結(jié)構(gòu)[9]。

核桃仁含有豐富的脂肪和蛋白質(zhì)，桃仁油中不飽和脂肪酸含量很高，占總脂肪含量的 88.54%，其中不飽和脂肪酸中亞油酸含量為30.43%[10]。核桃中含有的不飽和脂肪酸極易氧化酸敗，從而誘導(dǎo)核桃蛋白發(fā)生氧化變質(zhì)，最終影響核桃蛋白產(chǎn)品的色澤、風(fēng)味及品質(zhì)，降低核桃蛋白產(chǎn)品的商品價(jià)值[11]。核桃氧化酸敗根本原因是脂質(zhì)發(fā)生自動(dòng)氧化，產(chǎn)生過(guò)氧化物，從而氧化變質(zhì)[12]。目前，LOX在核桃蛋白氧化酸敗中的作用及其調(diào)控機(jī)理還不清楚，因此本研究以脂肪氧合酶、亞油酸和核桃分離蛋白構(gòu)建模擬氧化體系，研究脂肪氧合酶催化亞油酸氧化對(duì)核桃分離蛋白結(jié)構(gòu)特性的影響。

本研究以LOX催化亞油酸產(chǎn)生的脂質(zhì)氫過(guò)氧化物(hydrogen peroxide lipid content, HPODE)對(duì)核桃分離蛋白進(jìn)行不同程度的氧化，通過(guò)測(cè)定核桃蛋白樣品的溶解度、羰基含量、表面疏水性、圓二結(jié)構(gòu)、內(nèi)源熒光、相對(duì)分子質(zhì)量分布等指標(biāo)，研究脂質(zhì)氫過(guò)氧化物所誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)氧化對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及理化特性的影響，探究核桃蛋白中脂質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的機(jī)理，從而為核桃蛋白加工過(guò)程提高蛋白產(chǎn)品的質(zhì)量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新疆薄皮核桃：石河子市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；脂肪氧合酶(LOX I-B)(98 005 units/mg)：東京化成工業(yè)株式會(huì)社；亞油酸：色譜純；2,4-二硝基苯肼，1-苯氨基萘-8-磺酸等分析試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LGJ-18S 冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技有限公司；PHS-3C雷磁pH計(jì)，上海精科儀；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，力康發(fā)展有限公司；HH-42快速恒溫?cái)?shù)顯水箱，上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司；F-7000熒光光譜儀，日本日立公司；MOS-450圓二色光譜儀，法國(guó)Biologic公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 核桃分離蛋白的制備

參照毛曉英的方法[13]，以新產(chǎn)薄皮核桃為原料，堿液浸泡核桃仁，手動(dòng)去皮、粉碎，正己烷脫脂后得到核桃蛋白脫脂粉。核桃蛋白脫脂粉用乙醇醇洗，將醇洗后的殘?jiān)萌ルx子水溶解，經(jīng)堿溶酸沉法制備核桃分離蛋白。收集沉淀，用去離子水調(diào)節(jié)沉淀pH 7.0，最后冷凍干燥得到核桃分離蛋白粉末(walnut protein isolate, WPI)，裝瓶置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 氧化核桃蛋白的制備

亞油酸溶液、酶液的制備以及模擬反應(yīng)的建立參照葉林的方法[14]。

1.3.3 WPI溶解度的測(cè)定

取0.05 g核桃蛋白樣品溶于10 mL去離子水中，室溫下磁力攪拌2 h，5 000 r/min離心30 min，取上清液，釆用微量凱氏定氮法測(cè)定其蛋白含量。

(1)

式中：P為可溶蛋白的量；W為樣品蛋白的量。

1.3.4 WPI羰基含量的測(cè)定

參照HUANG等的方法[15]進(jìn)行測(cè)定，采用2,4-二硝基苯肼在367 nm處進(jìn)行比色。

1.3.5 WPI游離巰基含量的測(cè)定

參照HUANG的方法[15]，采用DNTB比色法。

1.3.6 表面疏水性的測(cè)定

采用ANS熒光探針?lè)?。稱取0.05 g核桃蛋白樣品溶于10 mL 0.01 mol/L(pH 8.0)磷酸鹽緩沖液，采用BCA法測(cè)定離心后上清液中蛋白濃度。用0.01 mol/L(pH 8.0)磷酸鹽緩沖液稀釋核桃蛋白質(zhì)量濃度在 0.005～0.5 mg/mL之間，加入50 μL 8 mmol/L ANS溶液，激發(fā)波長(zhǎng)為395 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為473 nm。以蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為X軸，熒光強(qiáng)度值為Y軸，得到的斜率即為蛋白質(zhì)表面疏水性指數(shù)。

1.3.7 WPI二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定

將0.05 g核桃分離蛋白分散于10 mL去離子水中，以雙縮脲法測(cè)定離心(8 000×g，30 min)后上清液中的蛋白質(zhì)量濃度，并通過(guò)稀釋使得上清液中核桃蛋白質(zhì)量濃度為 50 μg/mL。采用MOS-450 圓二色光譜儀測(cè)定190～250 nm之間的遠(yuǎn)紫外CD光譜，最后以平均摩爾橢圓率[θ](deg cm2/dmol)表示。

1.3.8 WPI內(nèi)源熒光測(cè)定

稱取0.05 g核桃蛋白樣品溶解于10 mL 0.01 mol/L (pH 8.0) 磷酸鹽緩沖溶液中，以雙縮脲法測(cè)定離心(8 000×g，30 min)后上清液的蛋白質(zhì)量濃度，并通過(guò)稀釋使其質(zhì)量濃度達(dá)到 0.1 mg/mL。采用熒光分光光度計(jì)以290 nm處為激發(fā)波長(zhǎng)，掃描300～400 nm處的發(fā)散光譜，測(cè)定氧化WPI樣品的熒光光譜。其兩者的狹縫寬設(shè)置均為5 nm。

1.3.9 WPI相對(duì)分子量分布的測(cè)定

根據(jù)HUANG的方法[15]略改。將WPI樣品用去離子水配制為1 mg/mL的溶液，采用Water 2690型液相色譜系統(tǒng)檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

所有數(shù)據(jù)均測(cè)定3次，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差SD。采用SPSS 23.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，使用Origin 8.5對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 WPI溶解度的分析

蛋白質(zhì)的溶解度是蛋白質(zhì)與水之間相互作用的綜合結(jié)果，蛋白質(zhì)的氨基酸組成，親/疏水性，所帶電荷等內(nèi)部因素都會(huì)影響蛋白質(zhì)的溶解度[16]。LOX催化亞油酸氧化對(duì)核桃蛋白溶解度的影響如表1所示。

表1 亞油酸不同添加量制備核桃蛋白溶解度、羰基、游離巰基和表面疏水性

注：樣品各指標(biāo)為3次測(cè)定值的平均；數(shù)值表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差；同一列中的不同字母表示在P<0.05 水平上有顯著差異。

隨著亞油酸添加量的增加，核桃蛋白溶解度從8.94%下降到6.89%。但是亞油酸添加量≤4.5 mL時(shí)，核桃蛋白溶解度變化不顯著；亞油酸添加量≥7.5 mL，核桃蛋白溶解度顯著性下降(P<0.05)。核桃蛋白樣品溶解度下降是因?yàn)榈蜐舛鹊臍溥^(guò)氧化物氧化使得核桃蛋白形成了可溶性聚集體，而高濃度的氫過(guò)氧化物氧化導(dǎo)致的共價(jià)交聯(lián)使得產(chǎn)生的可溶性聚集體進(jìn)一步發(fā)生聚集形成不可溶性聚集體[17]。孫領(lǐng)鴿等[18]指出，丙烯醛氧化濃度逐漸增加，核桃蛋白溶解度顯著性下降。吳偉等[19]在研究過(guò)氧自由基氧化大米蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)，大米蛋白共價(jià)交聯(lián)形成不可溶性聚集體，使得大米蛋白溶解性降低。蛋白質(zhì)與脂質(zhì)氫過(guò)氧化物相結(jié)合之后，使得蛋白質(zhì)的能態(tài)發(fā)生變化，引起蛋白質(zhì)變性是導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低的內(nèi)在原因。

2.2 WPI羰基含量的分析

蛋白質(zhì)羰基含量是目前用于表征蛋白質(zhì)氧化程度最為廣泛的指標(biāo)。當(dāng)亞油酸添加量為4.5 mL時(shí)，氧化核桃分離蛋白羰基從2.32 nmol/mg顯著增加到3.14 nmol/mg (P<0.05)，亞油酸添加量為9 mL時(shí)，蛋白質(zhì)羰基值達(dá)到最高水平(4.23 nmol/mg)(表1)。ZIRLIN[20]研究了亞油酸甲酯對(duì)明膠的氧化，蛋白質(zhì)和脂質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)生的自由基作用，可以形成蛋白質(zhì)自由基，蛋白質(zhì)自由基容易被氧分子襲擊，導(dǎo)致蛋白質(zhì)過(guò)氧化，而蛋白質(zhì)羰基含量增加主要是由于α-碳原子或者側(cè)鏈氨基酸殘基的其他碳原子形成了蛋白質(zhì)過(guò)氧化物。黃友如[21]在研究脂肪氧合酶催化亞油酸誘導(dǎo)大豆蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)，LOX -大豆分離蛋白、亞油酸-大豆分離蛋白氧化體系中，羰基含量無(wú)變化，LOX-亞油酸-大豆分離蛋白模擬體系中，羰基含量在反應(yīng)1.0 h時(shí)明顯增加，這說(shuō)明同時(shí)添加LOX和亞油酸致使大豆分離蛋白氧化。ZAMORA等[22]的研究發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)氫過(guò)氧化物與蛋白質(zhì)的氨基酸殘基反應(yīng)后，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的羰基含量增加。以上結(jié)果顯示，脂質(zhì)氫過(guò)氧化物氧化使核桃蛋白羰基含量增加，核桃蛋白的構(gòu)象發(fā)生改變。

2.3 WPI巰基含量的分析

巰基氧化可以轉(zhuǎn)換形成二硫鍵，二硫鍵的形成引起蛋白質(zhì)分子間發(fā)生交叉、聯(lián)結(jié)和聚合，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[16,23]。不同添加量亞油酸對(duì)核桃分離蛋白游離巰基結(jié)果如表1所示，核桃分離蛋白游離巰基含量隨著亞油酸添加量的增加發(fā)生顯著下降，其分別從未氧化的巰基值2.82 μmol SH/g下降到1.92 μmol SH/g (P<0.05)。巰基含量的降低在一定程度上反映蛋白質(zhì)的變性，可能是多肽形成分子間分子內(nèi)二硫鍵，也可能是因?yàn)榘l(fā)生氧化形成其他氧化產(chǎn)物[21]。OBATA研究大豆豆?jié){時(shí)發(fā)現(xiàn)，大豆豆?jié){中巰基基團(tuán)含量降低，可能與LOX氧化大豆蛋白密切相關(guān)[24]。GARDNER研究半胱氨酸和脂質(zhì)過(guò)氧化氫反應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，HPODE可與蛋白質(zhì)中半胱氨酸殘基形成穩(wěn)定的加合物[25]，從而使得蛋白質(zhì)中游離巰基含量下降。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，較高的亞油酸添加量，核桃分離蛋白發(fā)生較充分的氧化作用，致使分子內(nèi)部的游離巰基群含量下降。

2.4 WPI表面疏水性的分析

表面疏水性(H0)可以反映蛋白質(zhì)分子與外界極性水環(huán)境相連的表面疏水性基團(tuán)數(shù)量[26]，也可以用它來(lái)衡量蛋白質(zhì)的變性程度，它能夠觀察出蛋白位點(diǎn)在化學(xué)上或物理上的微妙變化，所以可以作為評(píng)價(jià)蛋白變性的一個(gè)重要參數(shù)[16]。通常用ANS熒光探針?lè)y(cè)量H0的變化，用于監(jiān)測(cè)暴露在蛋白質(zhì)表面的疏水位點(diǎn)，表征蛋白質(zhì)的變性程度[27]。不同添加量亞油酸對(duì)核桃分離蛋白H0的影響如表1所示，亞油酸添加量從0 mL增加到9 mL時(shí)，核桃分離蛋白H0從429.66顯著下降到405.24 (P<0.05)，這意味著LOX催化亞油酸氧化體系誘使核桃蛋白表面呈現(xiàn)出親水性。H0下降的原因,一方面是由于氧化造成蛋白質(zhì)分子去折疊，使得蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水集團(tuán)外露，這些疏水基團(tuán)再通過(guò)疏水作用形成了聚集體；另一方面，氧化形成的蛋白質(zhì)共價(jià)交聯(lián)使得聚集反應(yīng)進(jìn)一步發(fā)展，從而形成抗蛋白酶水解的聚集體。H0下降表明氧化后的核桃蛋白構(gòu)象發(fā)生改變。

2.5 WPI二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析

蛋白質(zhì)中二硫鍵、芳香氨基酸殘基等具有光學(xué)性質(zhì)，這些具有光活性的基團(tuán)能夠產(chǎn)生偏振光[28]，在250 nm以下的遠(yuǎn)紫外區(qū)的圓二色光譜(circular dichroism, CD)下，蛋白質(zhì)溶液圓二色性的改變可以反映核桃蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的特征分布[29]。核桃蛋白樣品的CD圖譜見(jiàn)圖1和表2。

圖1 HPODE氧化核桃蛋白樣品的圓二CD圖譜

Fig.1 Circular dichroism spectra of walnut protein samples注：圖例中為亞油酸添加量，下同。

亞油酸添加量為0 mL時(shí)，WPI圓二色光譜圖在192 nm處有一個(gè)正峰，說(shuō)明天然的核桃蛋白具有α-螺旋結(jié)構(gòu)，200 nm處有一個(gè)較強(qiáng)的正譜帶，此處較接近β-轉(zhuǎn)角的譜帶，220～230 nm處出現(xiàn)微弱的正峰，此處可以表征蛋白質(zhì)中存在無(wú)規(guī)則卷曲。在亞油酸添加量達(dá)到9 mL時(shí)，在192 nm處無(wú)正峰，200 nm處出現(xiàn)較強(qiáng)的負(fù)峰間，這一結(jié)果與吳偉等[30]研究蛋白質(zhì)氧化對(duì)大米蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量時(shí)的結(jié)果一致。說(shuō)明脂質(zhì)氫過(guò)氧化物氧化修飾使得核桃蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)減少，無(wú)規(guī)則卷曲含量升高。葉林曾報(bào)道[31]，花生分離蛋白氫鍵和疏水性作用的改變是由于其二級(jí)結(jié)構(gòu)變化而引起的，進(jìn)而形成蛋白聚集體。

2.6 WPI內(nèi)源熒光的分析

含有芳香族氨基酸殘基如色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)殘基的蛋白質(zhì)在一定激發(fā)波長(zhǎng)照射下會(huì)產(chǎn)生熒光，稱為內(nèi)源熒光[32]。來(lái)源于紫外照射、衰老和暴露在過(guò)氧自由基氧化系統(tǒng)的二聚酪氨酸的結(jié)構(gòu)可在320～360 nm的激發(fā)波長(zhǎng)下展現(xiàn)熒光特性[33]。GIULIVI表明，暴露在脂質(zhì)環(huán)境中的蛋白質(zhì)，可以改變氨基酸的序列和蛋白質(zhì)的組成結(jié)構(gòu)，這些與熒光蛋白質(zhì)交聯(lián)有關(guān)[34]。YE[35]研究花生蛋白氧化對(duì)結(jié)構(gòu)影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，花生蛋白熒光強(qiáng)度隨著氧化程度增加而下降且最大熒光峰位藍(lán)移，認(rèn)為是氧化導(dǎo)致蛋白聚集體形成，色氨酸轉(zhuǎn)移到內(nèi)部的非極性環(huán)境中。關(guān)于脂質(zhì)氫過(guò)氧化物氧化核桃分離蛋白內(nèi)源熒光的影響見(jiàn)圖2，結(jié)果表明，隨著亞油酸添加量的增加，核桃分離蛋白內(nèi)源熒光強(qiáng)度逐漸下降，從1 009下降到840，而當(dāng)亞油酸添加量為0～7.5 mL時(shí)，其最大熒光峰紅移，從330 nm移動(dòng)到335 nm。熒光峰位紅移可以說(shuō)明熒光發(fā)射基團(tuán)暴露于極性環(huán)境下，如溶劑(水)[36]，這與蛋白質(zhì)表面疏水性下降結(jié)果一致。上述結(jié)果說(shuō)明，LOX催化亞油酸產(chǎn)生的氫過(guò)氧化物氧化能使色氨酸的微環(huán)境變得親水。進(jìn)而可以得出，氧化可以導(dǎo)致核桃蛋白的構(gòu)象發(fā)生變化。

圖2 HPODE氧化核桃分離蛋白內(nèi)源熒光的影響

Fig.2 Effect of oxidation modification by HPODE on the intrinsic fluorescence of walnut protein

2.7 WPI相對(duì)分子量分布的分析

脂質(zhì)氫過(guò)氧化物氧化對(duì)核桃分離蛋白分子量分布的影響如表2所示，核桃蛋白分子量分布圖中大部分都出現(xiàn)4個(gè)峰，保留時(shí)間依次為 5.87、12.3、 13.0和14.4 min，其中保留時(shí)間 5.87 min峰對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)聚集體，保留時(shí)間 12.3 min和13.0 min峰對(duì)應(yīng)核桃蛋白和亞基，保留時(shí)間 14.4 min峰對(duì)應(yīng)核桃蛋白中天然存在的小肽。隨著亞油酸添加量的增加，氧化程度逐漸加大，核桃蛋白保留時(shí)間5.87 min峰面積比例持續(xù)增加，表明核桃蛋白氧化形成聚集體。當(dāng)亞油酸添加量增加時(shí)，其相對(duì)分子質(zhì)量逐漸變大。根據(jù)保留時(shí)間和相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=-1.443x+25.74)得出，亞油酸添加量達(dá)到9 mL，其相對(duì)分子質(zhì)量為6.9 kDa(38.65%)、8.1 kDa(32.54%)，而4.96 kDa的小分子多肽幾乎檢測(cè)不到。從結(jié)果可以看出，亞油酸添加量增大，氫過(guò)氧化物氧化程度增加，誘導(dǎo)WPI形成小的聚集體，聚集體進(jìn)一步聚集，形成較大的顆粒聚集體。黃友如在研究LOX催化亞油酸氧化對(duì)大豆蛋白影響時(shí)也證實(shí)，LOX催化亞油酸氧化反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)，大豆蛋白的聚集程度越大[21]。此結(jié)論與上文闡述的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化相吻合。

表2 脂質(zhì)氫過(guò)氧化物氧化核桃分離蛋白分子量分布

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以核桃分離蛋白為研究對(duì)象，建立LOX-亞油酸-核桃分離蛋白氧化模型，研究脂質(zhì)氫過(guò)氧化物氧化對(duì)核桃分離蛋白結(jié)構(gòu)的影響，研究結(jié)果表明：(1)脂質(zhì)氫過(guò)氧化物氧化可以促進(jìn)蛋白質(zhì)氧化反應(yīng)的發(fā)生，蛋白質(zhì)的氧化程度隨著亞油酸添加量的增加而增加；(2)隨著核桃蛋白氧化程度的增加，蛋白質(zhì)的表面疏水性和內(nèi)源熒光都發(fā)生顯著的變化，蛋白質(zhì)表面疏水性逐漸減小，最大熒光峰位紅移且熒光強(qiáng)度下降；(3)脂質(zhì)氫過(guò)氧化物氧化使核桃蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，有序的α-螺旋和β-折疊含量下降的同時(shí)無(wú)序的β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲含量增加，蛋白質(zhì)穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)遭到破壞；(4)脂質(zhì)氫過(guò)氧化物氧化，致使蛋白質(zhì)小分子多肽含量減少，轉(zhuǎn)化成氧化聚集體。本研究結(jié)果表明，脂質(zhì)氫過(guò)氧化物氧化對(duì)核桃分離蛋白的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定的影響，由于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定其功能性，因此，氧化對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的影響會(huì)進(jìn)一步影響蛋白的功能。在核桃蛋白的加工及貯藏過(guò)程中了解其發(fā)生蛋白質(zhì)氧化的程度，對(duì)提高核桃蛋白產(chǎn)品的品質(zhì)和應(yīng)用具有重要的理論和實(shí)踐意義。