疊氮溴化丙錠結(jié)合實時熒光定量PCR技術(shù)檢測發(fā)酵乳中植物乳桿菌P-8活菌數(shù)

韓之皓，郭帥，黃天，鄭巖，王月嬌，白梅，王記成，張和平

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室,農(nóng)業(yè)部奶制品加工重點實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特，010018)

植物乳桿菌是一類革蘭氏陽性、厭氧或兼性厭氧菌，屬于同型發(fā)酵乳酸菌，是我國衛(wèi)生部頒布的可用于食品的益生菌之一[1]。該菌主要應(yīng)用于發(fā)酵食品，其良好的益生特性及保健功能已被大眾廣泛接受和認可，是近年來研究較多的一種益生乳酸菌。植物乳桿菌P-8(LactobacillusplantarumP-8)是張和平教授2005年從內(nèi)蒙古巴彥淖爾市烏拉特中旗草原上牧民家庭自然發(fā)酵牛乳樣品中分離篩選出的1株性能優(yōu)良的益生菌，研究表明，該菌株具有改善脂質(zhì)代謝、降低血脂、保護肝臟、提高機體免疫力，改善腸道菌群等益生特性[2-3]。在益生菌發(fā)酵乳制品方面，只有產(chǎn)品中的活菌數(shù)達到106～107CFU/mL才能充分發(fā)揮其益生作用[4]，因此，發(fā)酵乳中的活菌數(shù)直接影響相關(guān)產(chǎn)品品質(zhì)。然而傳統(tǒng)的平板計數(shù)法存在操作繁瑣，檢測周期長，檢測結(jié)果滯后等缺點[5]，開發(fā)一種能夠快速準(zhǔn)確的檢測益生菌活菌數(shù)的方法顯得尤為重要。疊氮溴化丙錠(propidiummonoazide, PMA)是一種對核酸具有高度親和力的光敏染料，能夠滲透進入具有不完整細胞膜的死菌細胞，在光誘導(dǎo)下交聯(lián)死菌DNA，產(chǎn)生穩(wěn)定的共價交聯(lián)沉淀物，使DNA分子永久修飾，從而抑制DNA擴增[6]，同時反應(yīng)體系中未結(jié)合的PMA在光照下與水分子相互作用生成羥胺化合物，失去交聯(lián)活性。利用PMA選擇性交聯(lián)樣品中死菌和活菌細胞的機理，與熒光定量PCR檢測技術(shù)相結(jié)合，可快速檢測發(fā)酵乳中益生菌活菌數(shù)[7]。

本研究利用PMA-qPCR檢測方法，以L.plantarumP-8為例，通過熱滅活方式獲得膜損傷細胞，對影響PMA作用的濃度、曝光時間和暗孵育時間進行優(yōu)化，進一步完善發(fā)酵乳產(chǎn)品中L.plantarumP-8活菌數(shù)的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株

L.plantarumP-8分離自牧民家庭自然發(fā)酵牛乳樣品，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室乳酸菌菌種庫提供。

YF-L904由嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophiles)和保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)組成，購自科·漢森(中國)有限公司。

1.1.2 試劑

PMA(1mg，上海吉逸生物科技有限公司)：溶解于1 000 μL ddH2O，得到1 mg/mL儲備液，于-20 ℃避光保存。MRS培養(yǎng)基(廣州環(huán)凱微生物科技有限公司)、LB培養(yǎng)基(廣州環(huán)凱微生物科技有限公司)，無水乙醇(上海滬宇生物科技有限公司)，TE緩沖液、5×TBE電泳緩沖液貯液、TaqDNA聚合酶、10×EasyTaq Buffer、dNTPs、電泳緩沖液、瓊脂糖、核酸染料GELVIEW、6×DNA Loading Buffer、DL2000 DNA Marker(天根生化科技有限公司)。

1.1.3 實驗主要試劑盒(表1)

表1 實驗主要的試劑盒

載體：pEASY?-Blunt Simple Cloning Kit

1.1.4 主要儀器設(shè)備(表2)

表2 實驗主要的儀器

1.2 方法

1.2.1L.plantarumP-8活菌懸液的制備

取L.plantarumP-8菌液接種于5 mL MRS液體培養(yǎng)基(121 ℃滅菌15 min)，置37 ℃培養(yǎng)24 h，按2%的接種量接入MRS培養(yǎng)液中活化至3代，在37 ℃下培養(yǎng)達到指數(shù)生長期，采用平板計數(shù)法確定活菌數(shù)，用0.85%的生理鹽水重懸3次，得到濃度約為1×108CFU/mL的菌懸液。

1.2.2L.plantarumP-8熱致死菌懸液的制備

為建立死菌對照組，設(shè)計熱致死實驗進行L.plantarumP-8死菌懸液的制備。吸取稀釋后的1 mL菌懸液于1.5 mL離心管中，采用80 ℃水浴處理0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 s后，立即置于冰上冷卻，利用平板計數(shù)法測定各管中活菌數(shù)，每組設(shè)置3個平行，通過該處理，使細胞壁與細胞膜有不同程度損傷而得到L.plantarumP-8的熱致死菌懸液。

1.2.3 PMA質(zhì)量濃度的優(yōu)化

分別取500 μL活菌懸液及熱致死菌懸液于1.5 mL離心管中，加入PMA(初始質(zhì)量濃度1 mg/mL)液，使PMA的終質(zhì)量濃度分別為0、10、20、30、40、50、60、70 μg/mL(每個濃度n=3)，將樣本放置于LED光敏反應(yīng)儀(V-MIX)中，開啟混勻功能，黑暗混勻孵育10 min，使得PMA透過受損的細胞膜進入細胞內(nèi)。開啟LED光敏反應(yīng)儀的光源，同時開啟混勻功能，曝光 20 min，以完成PMA與細菌DNA的結(jié)合，同時完全鈍化游離的PMA分子以避免“假陰性”結(jié)果。10 000 r/min離心10 min，取沉淀，使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，離心取上清進行qPCR分析，確定PMA影響活菌DNA擴增的工作濃度以及抑制死菌DNA擴增的最低工作濃度。

1.2.4 PMA暗孵育時間的優(yōu)化

分別取500 μL活菌懸液及熱致死菌懸液于1.5 mL離心管中，以1.2.3確定的PMA工作濃度處理，將樣本放置于LED光敏反應(yīng)儀(V-MIX)中，開啟混勻功能，暗孵育0、5、10、15、20 min(每個時間段n=3)。開啟LED光敏反應(yīng)儀的光源，同時開啟混勻功能，曝光 20 min，10 000 r/min離心10 min，取沉淀，使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取樣品基因組DNA，離心取上清進行qPCR分析。

1.2.5 PMA曝光時間的優(yōu)化

分別取500 μL活菌懸液及熱致死菌懸液于1.5 mL離心管中，以1.2.3確定的PMA工作濃度處理，將樣本放置于LED光敏反應(yīng)儀(V-MIX)中，開啟混勻功能，以1.2.4確定的時間暗孵育處理，將離心管蓋打開，管口朝上，開啟LED光敏反應(yīng)儀的光源，同時開啟混勻功能，曝光0、5、10、15、20、25、30 min(每個時間段n=3)，10 000 r/min離心10 min，取沉淀，使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，離心取上清進行qPCR分析。對照組為未經(jīng)PMA處理的活菌懸液及熱致死懸液。

1.2.6 PMA對活細胞/熱致死細胞混合樣品的影響

取2份濃度約為1×108CFU/mL的活菌懸液，1份按照1.2.2確定的方法得到熱致死菌懸液，在含有500 μL熱致死菌懸液的1.5 mL離心管中分別加入濃度為1×108、1×107、1×106、1×105、1×104CFU/mL的500 μL活菌懸液，用1.2.3、1.2.4、1.2.5確定的PMA條件處理懸浮液。實驗對照組如下：(1)取1 mL上述5種濃度的活菌懸液，用1.2.3、1.2.4、1.2.5確定的PMA條件處理活菌懸液；(2)取1 mL濃度為1×108CFU/mL活菌懸液，不使用PMA相關(guān)條件處理；(3)取1 mL濃度為1×108CFU/mL的熱致死菌懸液，不使用或使用PMA相關(guān)條件處理。此外，采用相同的實驗條件將不同濃度的熱致死菌懸液(1×108、1×107、1×106、1×105、1×104CFU/mL)添加至活菌懸液中，并采用最佳PMA條件處理，設(shè)計對照組為：(1)取1 mL上述5種濃度的熱致死菌懸液，用最佳PMA條件處理；(2)取1 mL濃度為1×108CFU/mL活菌懸液，用最佳PMA條件處理；(3)取1 mL濃度為1×108CFU/mL的活菌懸液或熱致死菌懸液，不使用PMA相關(guān)條件處理。提取DNA進行熒光定量PCR檢測。

1.2.7L.plantarumP-8基因組DNA的提取

使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取L.plantarumP-8基因組DNA。

由3中B可知，3種物質(zhì)的含量均隨著粒度的增加呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，其原因可能是材料破碎后，顆粒尺寸變小，表面能增加，細胞內(nèi)物質(zhì)浸出速度增加。但是，隨著物料粒度的進一步減小，樣品粉末的表面積過大，吸附效果增強，不利于細胞中物質(zhì)的浸出。綜合分析，確定提取辣椒堿、辣椒二氫堿及辣椒紅色素的最佳粒度為100目。

1.2.8L.plantarumP-8標(biāo)準(zhǔn)品的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

取活化后的L.plantarumP-8菌懸液，提取DNA，PCR后根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，選取目標(biāo)條帶清晰的PCR擴增產(chǎn)物，切膠回收，用純化試劑盒純化。將純化的片段連接到pEASY?-Blunt Simple Cloning Vector，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞Trans1-T1，用含氨芐青霉素、X-Gal和IPTG的LB培養(yǎng)基37 ℃、24 h培養(yǎng)，挑選白色菌斑接種于LB/Amp+的液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)，PCR鑒定陽性克隆后，用試劑盒提取質(zhì)粒DNA，確定質(zhì)粒DNA濃度，通過公式換算成基因的拷貝數(shù)，質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)(拷貝/μL)=DNA濃度/(片段大小×660)×NA (NA為阿伏伽德羅常數(shù)：6.02×1023)。將線性質(zhì)粒的8個梯度作為模板進行熒光定量PCR反應(yīng)，根據(jù)熒光值的變化規(guī)律，系統(tǒng)將自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

使用Step One-Plus Real-Time PCR System(Applied Biosystems，Carlsbad，CA)在48孔板中進行qPCR測定。參照張佳超等[8]合成擴增L.plantarumP-8的特異性引物。

L.plantarumP-8正向引物序列:5′-ACTAACGGGAGGAGTGAT 3′；

L.plantarumP-8反向引物序列:5′-ATAGTTCTCAAATCGGGAC-3′，長度為292 bp。qPCR反應(yīng)體系20 μL：模板DNA 2 μL，SYBRRPremix ExTaqTMII 10 μL，上游引物0.4 μL，下游引物 0.4 μL，ROX Reference Dye II 0.4 μL，ddH2O 6.8 μL。qPCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃ 5 min，變性95 ℃ 1 min，低溫退火62 ℃ 1 min，引物延伸72 ℃ 7 min，40個循環(huán)[8]。用無菌超純水代替陰性對照中的DNA，以檢測可能的污染。

1.2.9 實際樣本的檢測

將益生菌L.plantarumP-8以接種量為2×106CFU/g分別與酸乳基礎(chǔ)發(fā)酵劑(YF-L904)復(fù)配發(fā)酵牛乳，發(fā)酵結(jié)束(pH=4.5)于4 ℃冷藏24 h后，采用傳統(tǒng)的平板計數(shù)、qPCR以及PMA-qPCR方法分別檢測發(fā)酵乳貯藏期間(0、7、14、21 d)活菌數(shù)變化。為保證發(fā)酵乳中存在的PCR抑制劑不會影響熒光定量PCR的結(jié)果，取1 mL發(fā)酵乳于無菌離心管中，5 500 r/min離心2 min，去掉發(fā)酵乳鹽離子和雜質(zhì)，菌體用生理鹽水洗滌2次后用1 mL生理鹽水重懸。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2 結(jié)果與分析

2.1 熱致死時間的確定

建立L.plantarumP-8生長曲線，結(jié)果顯示L.plantarumP-8接種于MRS培養(yǎng)基中，在3.5 h后進入指數(shù)生長期，3.5～12 h呈指數(shù)生長特性，12 h后進入穩(wěn)定期，使用培養(yǎng)10 h后的L.plantarumP-8來確定PMA的交聯(lián)條件；針對80 ℃不同熱處理時間的菌懸液梯度稀釋進行平板計數(shù)，37 ℃培養(yǎng)72 h后，計數(shù)結(jié)果如圖1所示。

圖1 熱致死時間的篩選

Fig.1 Screen of heat-killed time

由圖1可知，濃度為1×108CFU/mL的L.plantarumP-8菌懸液，經(jīng)過80 ℃ 60 s水浴處理后，計數(shù)平板中未出現(xiàn)菌落，該實驗組即為L.plantarumP-8的熱損傷死菌。因此，本實驗采用80 ℃、60 s熱處理獲得L.plantarumP-8死菌懸液。

2.2 PMA質(zhì)量濃度的優(yōu)化

應(yīng)用qPCR檢測方法驗證不同PMA濃度對L.plantarumP-8熱致死菌懸液及其活菌懸液作用的變化，結(jié)果如圖2和圖3所示。由圖2可知，在L.plantarumP-8熱致死菌qPCR中，隨著PMA工作濃度增加，L.plantarumP-8的qPCR陽性計數(shù)顯著降低(P<0.05)，當(dāng)PMA質(zhì)量濃度為40 μg/mL時，熱致死菌qPCR陽性計數(shù)結(jié)果為6.5×103CFU/mL(Ct=30.1)，PMA對熱滅活菌qPCR抑制率達到99.9%；當(dāng)PMA質(zhì)量濃度為70 μg/mL時，PMA對熱致死菌qPCR抑制達到最大，但較質(zhì)量濃度為40 μg/mL的PMA相比，差異不顯著(P>0.05)。

圖2 不同質(zhì)量濃度PMA對熱滅活菌的影響

Fig.2 Effect of PMA concentration on dead bacteria

由圖3可知，在L.plantarumP-8活菌qPCR中，當(dāng)PMA質(zhì)量濃度≤40 μg/mL時，其活菌qPCR陽性計數(shù)結(jié)果約為1.1×108CFU/mL(Ct=14.8)，PMA對活菌qPCR抑制率低于0.1%，當(dāng)PMA質(zhì)量濃度高于40 μg/mL時明顯抑制活細胞檢出率，且濃度越高，抑制作用越強。因此，當(dāng)PMA質(zhì)量濃度為40 μg/mL時，既可有效抑制熱致死菌DNA擴增，同時并不影響活菌DNA的PCR擴增。本結(jié)論與王力均等[9]利用PMA處理副干酪乳桿菌抑制其死菌DNA的PCR擴增所得實驗結(jié)果(最佳PMA濃度5 μg/mL)有所偏差，這可能是由于不同種屬微生物之間細胞壁、細胞膜的結(jié)構(gòu)、通透性不同引起的。此外，本實驗中L.plantarumP-8菌懸液與王力均等所用菌懸液相比濃度較高，可能是引起PMA工作濃度較高的原因之一。PMA的工作濃度是影響活菌檢測的重要因素，濃度過低，無法排除死菌DNA的干擾，導(dǎo)致“假陽性”結(jié)果；濃度過高，PMA透過活菌細胞膜與活菌DNA結(jié)合，造成“假陰性”結(jié)果。PMA工作濃度的選擇受到多種因素的制約，包括(1)細菌不同的滅活方式造成其細胞膜損傷程度不同，對PMA的敏感度不同，如紫外照射滅活細菌能夠破壞其核酸結(jié)構(gòu)卻無法使細胞膜完全受損，影響PMA與死菌DNA發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)[10]；(2)不同種屬微生物之間細胞壁、細胞膜的結(jié)構(gòu)、通透性不同，PMA最優(yōu)工作濃度可能不同。因此，實驗過程中必須對PMA的濃度進行優(yōu)化，保證PMA與全部死菌DNA結(jié)合形成穩(wěn)定的共價交聯(lián)沉淀物，抑制死菌DNA擴增。

圖3 不同質(zhì)量濃度PMA對活菌的影響

Fig.3 Effect of PMA concentration on live bacteria

2.3 PMA暗孵育時間的優(yōu)化

應(yīng)用qPCR檢測方法驗證不同暗孵育時間對L.plantarumP-8熱致死菌懸液作用的變化，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，將通過PMA處理后的L.plantarumP-8熱致死菌懸液黑暗混勻孵育，0～10 min，隨著暗孵育時間的增加，該菌的qPCR陽性計數(shù)由1.1×108CFU/mL(Ct=14.8)降至6.1×103CFU/mL(Ct=30.3)，10 min后，各個時間點Ct值差異不顯著(P>0.05)。因此，確定處理L.plantarumP-8熱致死菌懸液的最佳暗孵育時間為10 min。暗處理階段實現(xiàn)PMA進入熱致死死細胞，暗孵育時間決定PMA嵌入DNA雙鏈的多少，合理的暗孵育時間在保證PMA進入全部死菌細胞內(nèi)的基礎(chǔ)上，阻止其滲透活細胞。

圖4 不同暗孵育時間對熱滅活菌的影響

Fig.4 Effect of dark incubation time on dead bacteria

2.4 PMA曝光時間的優(yōu)化

應(yīng)用qPCR檢測方法驗證不同曝光時間對L.plantarumP-8熱致死菌懸液作用的變化，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，將暗孵育10 min后的L.plantarumP-8熱致死菌懸液(已加入PMA)暴露于強光下，0～15 min，隨著光照時間的增加，該菌的qPCR陽性計數(shù)顯著降低(P<0.05)，由光照前的1.1×108CFU/mL(Ct=14.8)降至6.9×105CFU/mL(Ct=21.1)，當(dāng)光照時間為20 min時，L.plantarumP-8的qPCR陽性計數(shù)結(jié)果為6.5×103CFU/mL(Ct=30.1)，此后，各個時間點Ct值差異不顯著(P>0.05)。通過上述分析可知，為確保PMA與熱致死菌交聯(lián)反應(yīng)有效，選擇20 min的光照用于隨后的實驗中。該實驗結(jié)論與SHAO等[11]所研究的完全抑制死菌DNA擴增的最佳曝光時間為20 min一致。PMA在暗孵育條件下，進入熱致死菌細胞內(nèi)，曝光時間決定PMA與DNA的結(jié)合程度，從而影響qPCR檢測方法的準(zhǔn)確性。若光照時間過短，無法保證PMA與全部死菌DNA共價交聯(lián)，未結(jié)合的死菌DNA參與后續(xù)PCR擴增，導(dǎo)致“假陽性”結(jié)果；然而光照時間過長，照射產(chǎn)生的高熱量造成活菌的熱致死，導(dǎo)致qPCR檢測結(jié)果偏低。曝光時間的長短受到多種因素的影響，包括實際樣品溶液濃度、光源類型以及光照強度等，此外，由于不同種屬微生物其物理特征及菌落狀態(tài)不同，也會引起最佳曝光時間的差異[12]。因此，為保證PMA與全部死菌DNA結(jié)合，同時未結(jié)合的PMA與水分子反應(yīng)形成羥胺化合物，避免其與裂解后的活菌DNA結(jié)合[13]，實驗過程中須對曝光時間進行優(yōu)化。

圖5 不同曝光時間對熱滅活菌的影響

Fig.5 Effect of light exposure time on dead bacteria

2.5 PMA對活細胞/熱致死細胞混合樣品的影響

應(yīng)用qPCR檢測方法驗證PMA對L.plantarumP-8活細胞/熱致死細胞混合樣品作用的變化，結(jié)果如圖6和圖7所示。由圖6可知，當(dāng)不同濃度的活細胞加入標(biāo)準(zhǔn)濃度的死細胞中時，經(jīng)過PMA處理，隨著活細胞濃度的增加，Ct值呈下降趨勢，與未加死細胞的活菌懸液相比，Ct值差異不顯著(P>0.05)，表明PMA對活菌DNA擴增無影響。當(dāng)樣品中全是死細胞時，不經(jīng)PMA處理的樣品與PMA處理后的樣品Ct值差異性顯著(P<0.05)，ΔCt=16.09，表明PMA能夠滲入膜損傷細胞，抑制其PCR擴增。由圖7可知，當(dāng)不同濃度的死細胞加入標(biāo)準(zhǔn)濃度的活細胞中時，經(jīng)過PMA處理，隨著死細胞濃度的增加，Ct值保持穩(wěn)定，與未加活細胞的熱致死菌懸液相比，Ct值差異性顯著(P<0.05)，當(dāng)樣品中全是活細胞時，不經(jīng)PMA處理的樣品與PMA處理后的樣品相比，Ct值差異不顯著(P>0.05)。以上結(jié)果表明：使用PMA處理活細胞/熱致死細胞混合液，PMA能夠與死菌細胞結(jié)合，產(chǎn)生穩(wěn)定的共價交聯(lián)產(chǎn)物，從而有效抑制其后續(xù)DNA擴增。活細胞中的細胞膜能夠?qū)MA阻隔在外，保證其DNA擴增的順利進行。

圖6 PMA對活細胞/熱致死細胞混合樣品的影響(活細胞濃度依次增加)

Fig.6 Effect of PMA on mixed samples of live/dead bacteria (increase of living bacteria concentration)

圖7 PMA對活細胞/熱致死細胞混合樣品的影響(熱致死細胞濃度依次增加)

Fig.7 Effect of PMA on mixed samples of live/dead bacteria(increase of dead bacteria concentration)

2.6 L.plantarum P-8標(biāo)準(zhǔn)品的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

使用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒DNA得到L.plantarumP-8質(zhì)粒DNA，質(zhì)粒DNA質(zhì)量濃度為130.9 ng/μL。將質(zhì)粒DNA經(jīng)10倍梯度稀釋制作標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進行熒光定量PCR擴增，形成以Ct值為縱坐標(biāo)，質(zhì)?？截悢?shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖8所示,圖中表明Ct值與質(zhì)?？截悢?shù)的對數(shù)存在良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=-3.631x+44.021，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.992 9，最低檢測限為103CFU/mL。

圖8 L.plantarum P-8標(biāo)準(zhǔn)曲線

Fig.8 L.plantarum P-8 standard curve

2.7 實際樣品的檢測

采用傳統(tǒng)的平板計數(shù)、qPCR以及PMA-qPCR的方法分別檢測發(fā)酵乳貯藏期間(0、7、14、21 d)L.plantarumP-8活菌數(shù)的變化，結(jié)果如表3所示。

由表3可知，在實際樣品中，經(jīng)過PMA處理的樣品得到的計數(shù)結(jié)果均明顯小于未經(jīng)過PMA處理組，說明使用PMA處理實際樣品后，PMA能夠通過滲透作用進入死菌細胞，抑制死菌細胞PCR擴增，消除了死菌DNA對檢測結(jié)果的影響。采用PMA-qPCR方法檢測活菌數(shù)所得結(jié)果略高于傳統(tǒng)的平板計數(shù)，但無顯著性差異(P>0.05)，可能是因為該方法檢測出的活菌數(shù)包括活的非可培養(yǎng)態(tài)(VBNC)[14]菌體，VBNC菌體雖然使用常規(guī)的培養(yǎng)方法無法檢測出來，但仍然保持代謝活性，在適宜的條件下，可能進行復(fù)蘇。同時，在具體的發(fā)酵乳檢測過程中，受樣品成分如乳蛋白等的影響，檢測結(jié)果存在一定的誤差。

表3 L.plantarum P-8定量檢測結(jié)果

注：NTa表示樣品未經(jīng)PMA處理，Tb表示樣品經(jīng)過PMA處理。

3 結(jié)論

在活菌計數(shù)方面，眾多科研工作者在改進傳統(tǒng)計數(shù)方法的同時，研究出更多精確省時的方法。MASCO等通過qPCR方法(依據(jù)16SrRNA基因序列設(shè)計引物，使用SYBR Green I染料法)檢測發(fā)酵乳中的乳酸菌，包括嗜熱鏈球菌、德氏乳桿菌、雙歧桿菌、鼠李糖乳桿菌以及干酪乳桿菌。結(jié)果表明，熒光定量PCR方法能夠準(zhǔn)確定量發(fā)酵乳中的乳酸菌，最低檢測限為103CFU/mL[15-17]。FALENTIN，SHEU等采用PMA-qPCR、EMA-qPCR方法對發(fā)酵乳中的干酪乳桿菌和雙歧桿菌做定量分析，檢測結(jié)果與傳統(tǒng)的平板計數(shù)無顯著性差異(P<0.05)[18-20]。目前，就國內(nèi)外研究而言，PMA-qPCR方法主要用于食源性致病菌(大腸桿菌、沙門氏菌)的檢測。從益生菌領(lǐng)域來看，qPCR與其他技術(shù)結(jié)合實現(xiàn)對植物乳桿菌活菌數(shù)的檢測在國內(nèi)尚未見報道。

本研究將PMA與熒光定量PCR相結(jié)合，去除死菌DNA對L.plantarumP-8活菌檢測的干擾，降低假陽性結(jié)果出現(xiàn)的可能。在具體的操作過程中，從前期PMA的預(yù)處理，到DNA的提取以及最后利用qPCR的準(zhǔn)確定量，整個過程快速、高效，在最大程度上提高工作效率。該方法在食品領(lǐng)域有巨大的潛在應(yīng)用前景，為發(fā)酵乳產(chǎn)品中的益生菌進行大規(guī)模、多元化、快速檢測提供了新的參考方法。