GSDMD調(diào)控非酒精性脂肪肝中細(xì)胞焦亡的研究進(jìn)展

范祺，郭翼寧，張衛(wèi)光

（北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)系，北京 100191）

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD）是最常見(jiàn)的慢性肝病之一，在美國(guó)，NAFLD的患病率高達(dá)25%[1]。亞太地區(qū)的患病率為20%[2]，近幾年隨著人們飲食結(jié)構(gòu)及生活方式的改變，NAFLD的發(fā)病逐漸有著年輕化的趨勢(shì)，已成為全世界公共衛(wèi)生領(lǐng)域的重大負(fù)擔(dān)。如果缺乏有效的干預(yù)措施，會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞逐漸被破壞，使得NAFLD轉(zhuǎn)化為非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis, NASH），最終進(jìn)展至肝纖維化、肝硬化和肝癌[3]。而目前人們對(duì)于NAFLD病理機(jī)制認(rèn)識(shí)尚淺，治療措施以生活方式干預(yù)和降血脂治療為主，缺乏有效的對(duì)策。如何能延緩NAFLD進(jìn)展甚至逆轉(zhuǎn)這一過(guò)程一直是人們關(guān)注的熱門(mén)話題。

細(xì)胞焦亡是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞程序性死亡方式，和細(xì)胞凋亡不同，焦亡的發(fā)生常常伴隨著細(xì)胞的脹破，內(nèi)容物的外泄，進(jìn)而引發(fā)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。它的執(zhí)行分子是一種稱為gasdermin D (GSDMD)的打孔蛋白。GSDMD被活化后會(huì)形成聚合物并與細(xì)胞膜上的脂質(zhì)分子形成孔道。隨著研究的不斷深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)在NAFLD發(fā)展成為NASH的過(guò)程中，細(xì)胞焦亡起著十分重要的作用[4]，不僅發(fā)生在肝細(xì)胞中，在肝庫(kù)普弗細(xì)胞中也有存在。研究表明這一過(guò)程可能與脂質(zhì)的沉積有關(guān)，且會(huì)加重肝臟的炎癥反應(yīng)和纖維化的進(jìn)程。針對(duì)焦亡設(shè)計(jì)NAFLD的新型治療藥物會(huì)是一個(gè)前景廣闊的研究領(lǐng)域。本文將具體介紹細(xì)胞焦亡這一細(xì)胞程序性死亡方式的分子機(jī)制，并關(guān)注其執(zhí)行分子GSDMD在NAFLD中的作用。

1 Gasdermin家族成員與GSDMD

Gasdermin蛋白最早被發(fā)現(xiàn)位于胃腸道（gastrointestinal tract）上皮和皮膚真皮層（dermis），因此被命名為Gas-dermin[5,6]。在人體內(nèi)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)6種gasdermin家族的成員，gasdermin A～E（GSDM A～E）和pejvakin（PJVK）[5,7]。Gasdermin蛋白具有介導(dǎo)細(xì)胞死亡和炎癥反應(yīng)的作用，它可以與細(xì)胞膜上的脂質(zhì)結(jié)合并在細(xì)胞膜上打孔，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物外泄。其中GSDMD的活化涉及到炎性小體的激活，與細(xì)胞焦亡密切相關(guān)。

除PJVK外，其余的gasdermin蛋白均包含2個(gè)結(jié)構(gòu)域：C端結(jié)構(gòu)域（GSDM-CT）和N端結(jié)構(gòu)域（GSDM-NT）[8]。具有打孔功能的并非完整的gasdermin蛋白，而是被切割后獨(dú)立出來(lái)的GSDMNT。正常情況下，GSDM-CT可以抑制GSDM-NT的打孔作用，唯有當(dāng)GSDM-NT從GSDM-CT解脫開(kāi)來(lái)后才能發(fā)揮功能，這一現(xiàn)象也稱作gasdermin蛋白的自我抑制（auto-inhibitory）[8,9]。目前被證實(shí)能夠切割GSDMD的僅有caspase-1/4/5/11。Caspase-1的激活需要炎性小體的活化，屬于經(jīng)典的焦亡途徑；caspase4/5/11的活化需要LPS的激活，屬于非經(jīng)典的焦亡途徑。盡管其他gasdermin家族成員的N端結(jié)構(gòu)域也有打孔功能，但尚無(wú)研究表明它們與細(xì)胞焦亡相關(guān)[7]。

在GSDMD介導(dǎo)細(xì)胞膜溶破和細(xì)胞焦亡發(fā)生的同時(shí)，會(huì)伴隨IL-18和IL-1β的外泄，且這一過(guò)程常常在細(xì)胞焦亡發(fā)生之前就已完成。GSDMD介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡并非是一個(gè)瞬間過(guò)程，在焦亡最終發(fā)生之前，GSDMD所造成的孔道的數(shù)量需要達(dá)到一定閾值，而外泄的炎性因子也已經(jīng)有所積累。這導(dǎo)致細(xì)胞焦亡這一程序性死亡方式伴隨的炎性反應(yīng)尤其嚴(yán)重[10,11]。事實(shí)上，GSDMD在膜上打孔的直徑為12～14nm，而炎性介質(zhì)IL-1β和IL-18的分子直徑只有約4nm，足以從孔道中自由通過(guò)[12-14]。然而研究發(fā)現(xiàn)分子直徑為10nm的乳酸脫氫酶四聚體卻不能通過(guò)GSDMD打孔的孔道[15]，其對(duì)透過(guò)分子的選擇機(jī)制目前還不得而知。

2 細(xì)胞焦亡的分子機(jī)制

細(xì)胞焦亡是一種可溶性的細(xì)胞程序性死亡形式，這一概念最早于1992年由Zychlinsky等[16]提出。其主要特點(diǎn)是細(xì)胞質(zhì)的迅速崩解和胞內(nèi)促炎物質(zhì)的釋放。焦亡的發(fā)生依賴于一種半胱天冬酶——caspase-1。Caspase-1是介導(dǎo)焦亡發(fā)生的啟動(dòng)因子，研究表明caspase-1敲除的小鼠的細(xì)胞凋亡不會(huì)受到影響，且可以正常存活[17,18]。而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的caspase-3，6和8則不會(huì)引起細(xì)胞焦亡的發(fā)生[19-21]。

可以引起細(xì)胞焦亡的因素包括細(xì)菌、病毒感染所釋放的病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns, PAMPs）和過(guò)度沉積的脂質(zhì)等損傷相關(guān)分子模式（damage associated molecular patterns, DAMPs）。這些分子模式和細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors, PRRs）結(jié)合后，會(huì)招募細(xì)胞內(nèi)的炎性小體（主要是NLRP3）。NLRP3會(huì)激活下游的ASC（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD），ASC作為信號(hào)放大的中間接頭蛋白，會(huì)大量激活caspase-1[22]?；罨腸aspase-1一方面會(huì)切割proIL-1β和proIL-18形成有活性的炎性介質(zhì)，另一方面會(huì)切割細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵效應(yīng)分子—GSDMD（gasdermin D）。被切割后，GSDMD的N末端（GSDMD-NT）會(huì)作為焦亡的執(zhí)行分子，形成聚合體后在細(xì)胞膜上打孔，導(dǎo)致細(xì)胞的溶解破裂，細(xì)胞內(nèi)容物的外泄，包括IL-1β、IL-18在內(nèi)的大量促炎因子釋放到組織間隙中，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生[23,24]。最新的研究結(jié)果表明，在LPS誘導(dǎo)的焦亡中，除caspase-1外，caspase-4/5/11的活化也參與了這一進(jìn)程[25,26]。

GSDMD是細(xì)胞焦亡發(fā)生過(guò)程中至關(guān)重要的一環(huán)。人體內(nèi)的GSDMD廣泛表達(dá)在各個(gè)器官和各類細(xì)胞中，其中以胃腸道上皮細(xì)胞的表達(dá)量最為顯著[8]?；罨腸aspase蛋白會(huì)切割GSDMD，釋放出有功能的GSDMD-NT結(jié)構(gòu)域。GSDMD-NT聚集后與細(xì)胞膜上的磷酸肌醇和心磷脂結(jié)合，從而對(duì)細(xì)胞膜溶破打孔。GSDMD孔一般為直徑12～14nm的正十六邊形結(jié)構(gòu)，孔道形成后，細(xì)胞內(nèi)外的滲透率遭到改變，導(dǎo)致細(xì)胞的腫脹溶破[8,27]。有研究表明，GSDMD缺乏的細(xì)胞將不會(huì)發(fā)生細(xì)胞焦亡，此時(shí)活化的caspase-1將激活caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白酶，引起細(xì)胞凋亡[28]。如果對(duì)GSDMD基因進(jìn)行編輯，使其序列中包含caspase-3識(shí)別的切割位點(diǎn)，原本發(fā)生凋亡的細(xì)胞則會(huì)切割GSDMD產(chǎn)生有活性的GSDMD-NT，進(jìn)而產(chǎn)生細(xì)胞焦亡[29]。這些現(xiàn)象說(shuō)明GSDMD可能是細(xì)胞焦亡發(fā)生的充要條件，有人也因此將細(xì)胞焦亡定義成“由GSDMD執(zhí)行的細(xì)胞溶破性死亡”。

3 細(xì)胞焦亡與NAFLD

越來(lái)越多的研究表明，NALFD模型中細(xì)胞焦亡是NAFLD發(fā)病過(guò)程的必經(jīng)之路。大量細(xì)胞發(fā)生焦亡后，細(xì)胞膜溶解破裂，細(xì)胞內(nèi)的大量炎性介質(zhì)得到釋放，加速了肝臟炎癥反應(yīng)和纖維化的進(jìn)程。

一項(xiàng)研究顯示，在用蛋氨酸/膽堿缺乏（methionine/choline de ficient，MCD）飲食飼養(yǎng)小鼠4周后，得到的脂肪肝小鼠中炎性小體NLRP3和炎性介質(zhì)IL-1β的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，同時(shí)伴隨著小葉區(qū)炎癥加重和肝實(shí)質(zhì)的損傷。免疫組織化學(xué)顯示，在肝細(xì)胞和庫(kù)普弗細(xì)胞中均可檢測(cè)到陽(yáng)性NLRP3[30,31]，說(shuō)明細(xì)胞焦亡不僅發(fā)生在肝細(xì)胞中。在同樣是MCD飲食誘導(dǎo)的NAFLD/NASH模型小鼠中，Xu[32]等人的研究結(jié)果顯示，GSDMD及其切割后的活性產(chǎn)物GSDMD-NT的表達(dá)量遠(yuǎn)高于正常對(duì)照組[32]。此外，作者還發(fā)現(xiàn)在同樣的MCD飲食誘導(dǎo)脂肪肝模型中，Gsdmd-/-小鼠相比于野生型小鼠起到了顯著的保護(hù)作用。另有研究表明，Caspase-1-/-小鼠在接受高脂飲食誘導(dǎo)后肝細(xì)胞死亡的情況未有明顯好轉(zhuǎn)[33]；相反，在Nlrp3-/-小鼠的MCD飲食誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)基因編輯的小鼠肝細(xì)胞死亡的數(shù)量及肝損傷的程度遠(yuǎn)小于正常小鼠[34]。這意味著NAFLD發(fā)病過(guò)程中的細(xì)胞焦亡可能并非是caspase-1依賴的，但涉及到炎性小體NLRP3的激活，最終也要依靠GSDMD作為效應(yīng)分子來(lái)執(zhí)行細(xì)胞焦亡。

在細(xì)胞焦亡這一死亡形式被定義之后，另有研究認(rèn)為它或是脂質(zhì)沉積的下游結(jié)果。Cannito[35]等人的實(shí)驗(yàn)表明，具有脂毒性的載脂細(xì)胞釋放的微泡（MVs）可以在肝細(xì)胞和巨噬細(xì)胞當(dāng)中激活炎性小體NLRP3。炎性小體激活需要NF-κB介導(dǎo)的NLRP3、前體caspase-1（pro-caspase-1）和前白細(xì)胞介素-1（pro-Interleukin-1,pro-IL-1）表達(dá)的上調(diào)，隨后炎性小體復(fù)合物形成，細(xì)胞發(fā)生焦亡，最終導(dǎo)致IL-1β和IL-18的釋放增加[36]。

4 GSDMD的調(diào)控與非酒精性脂肪性肝病中的治療

Xu[32]等人的研究發(fā)現(xiàn)，在NAFLD疾病模型的小鼠中，GSDMD的水平與其NAFLD活動(dòng)度評(píng)分（NAFLD activity score, NAS）以及肝纖維化的程度均成正相關(guān)[32]。這項(xiàng)研究表明焦亡的發(fā)生以及GSDMD的過(guò)表達(dá)在脂肪性肝炎的發(fā)生過(guò)程當(dāng)中具有非常重要的作用，對(duì)NAFLD的治療以及病情評(píng)估均提供了一個(gè)潛在的方向。

GSDMD作為焦亡的最終執(zhí)行者，通過(guò)控制細(xì)胞因子分泌、激活NF-κB通路、調(diào)節(jié)脂質(zhì)生成，在脂肪性肝病向脂肪性肝炎進(jìn)展的過(guò)程中扮演重要角色[34]。一方面，GSDMD導(dǎo)致細(xì)胞焦亡溶破后，胞內(nèi)的炎性因子IL-1β等直接釋放到組織間隙中，這是直接的促炎過(guò)程。Gsdmd-/-的脂肪肝模型小鼠表現(xiàn)出細(xì)胞因子分泌量的明顯減少[4]。另一方面，GSDMD誘導(dǎo)IL-1β、TNF-α和MCP-1的表達(dá)后，還會(huì)導(dǎo)致NF-κB信號(hào)通路的激活，引起巨噬細(xì)胞的募集，這是間接的促炎過(guò)程。除此之外，GSDMD的表達(dá)還會(huì)促進(jìn)脂質(zhì)的生成，抑制脂質(zhì)的溶解，通過(guò)加重脂質(zhì)的沉積來(lái)加速NAFLD的進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)Gsdmd-/-的小鼠會(huì)有脂肪生成基因Srbp1c的下調(diào)和脂肪抑制基因 Pparα、Aco、Lcad、Cyp4a10和 Cypa14的上調(diào)，從而對(duì)肝脂肪變性具有保護(hù)作用[37]。

研究者們?nèi)諠u意識(shí)到細(xì)胞焦亡在NAFLD中的重要作用，將細(xì)胞焦亡作為治療靶點(diǎn)的研究越來(lái)越多。其中，抗caspase藥物，抗炎性小體藥物等的相關(guān)研究已取得了初步的進(jìn)展。最近的研究則關(guān)注到一些泛caspase抑制物的應(yīng)用，它們不僅能抑制caspase-3、8，還能抑制焦亡相關(guān)的caspase-1、4、11等。包括IDN-6556、VX-166在內(nèi)的多種泛caspase抑制劑均被證實(shí)在小鼠NASH模型中具有緩解肝臟損傷，減輕炎癥和纖維化的作用[38-40]。作為細(xì)胞焦亡過(guò)程中的啟動(dòng)分子，炎性小體NLRP3也可以作為治療的靶點(diǎn)。進(jìn)來(lái)，輝瑞公司發(fā)現(xiàn)的一種小分子細(xì)胞因子釋放抑制物MCC950（曾用名CRID3）被證實(shí)具有選擇性抑制NLRP3活化的功能[41]。MCC950已在小鼠腦膜腦炎、NAFLD等疾病模型中得到應(yīng)用，均可以抑制其中的細(xì)胞焦亡過(guò)程，從而緩解疾病的進(jìn)程[42,43]。

GSDMD是細(xì)胞焦亡最終的執(zhí)行者，也是最關(guān)鍵的一環(huán)。如前所述，Gsdmd-/-的基因編輯小鼠在MCD誘導(dǎo)的NAFLD小鼠模型中具有顯著的保護(hù)作用。Gsdmd-/-的NAFLD模型小鼠相比于野生型小鼠，炎性因子IL-1β、TNF-α等的分泌量顯著減少，且脂溶基因Pparα等的表達(dá)量亦有上調(diào)。因此，我們有理由推測(cè)GSDMD抑制藥物可以在NAFLD的治療中占據(jù)一席之地。然而截至目前尚無(wú)將GSDMD作為靶點(diǎn)的相關(guān)報(bào)道，這將是一個(gè)擁有廣闊前景的研究方向。

5 展望

細(xì)胞焦亡是一種新型的細(xì)胞死亡方式，是一種caspase依賴性的細(xì)胞脹亡，與炎癥反應(yīng)的發(fā)生有著密切的關(guān)系。它與細(xì)胞凋亡、程序性壞死等其他死亡形式共同調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)，決定疾病進(jìn)程。目前已證實(shí)細(xì)胞焦亡在NAFLD發(fā)病及其向NASH進(jìn)展的過(guò)程中起了重要的作用，而GSDMD的表達(dá)與細(xì)胞焦亡的發(fā)生息息相關(guān)，通過(guò)調(diào)控GSDMD的表達(dá)，抑制NAFLD模型中的細(xì)胞焦亡過(guò)程可以保肝抗炎，延緩病情的進(jìn)展。這將為NAFLD的治療開(kāi)辟一個(gè)全新的思路。進(jìn)一步探究細(xì)胞焦亡在NAFLD中的作用，并設(shè)計(jì)針對(duì)細(xì)胞焦亡的靶向藥物，有助于人們對(duì)NAFLD發(fā)病機(jī)制的理解，改善NAFLD患者的預(yù)后。