胰酶稀釋法提取乳鼠原代海馬神經(jīng)元*

康楊婷， 王麗琨， 伍國鋒***

(1.貴州醫(yī)科大學， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學附院 急診神經(jīng)科， 貴州 貴陽 550004)

海馬區(qū)域在學習、記憶、認知等高級神經(jīng)功能活動中有著至關重要的作用[1-5]，疾病累及海馬組織?？蓪е掳d癇、阿爾茨海默病等相關疾病。文獻報道，海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)多采用多聚賴氨酸提前24 h包被、胰蛋白酶消化、含血清培養(yǎng)和阿糖胞苷處理的方法[6-8]，既往相關實驗方法均有神經(jīng)元細胞難以存活、雜質(zhì)細胞多等缺點[9]，本研究采用胰酶稀釋法分離海馬神經(jīng)元，以含有1% B27的Neubasal培養(yǎng)基進行無血清培養(yǎng)，對比未稀釋胰酶的培養(yǎng)方法，該法獲得了生長良好、純度較高、數(shù)量更多的海馬神經(jīng)元，為神經(jīng)、精神系統(tǒng)疾病的研究提供了足夠和高質(zhì)量的細胞模型，報告如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

出生24 h內(nèi)SD乳鼠，雌雄不限，體質(zhì)量為3～6 g，普通(SPF)級，由貴州醫(yī)科大學動物實驗中心提供。

1.2 主要試劑與儀器

胎牛血清(美國SCIENCELL 公司)、多聚賴氨酸(美國Sigma 公司)、0.25%胰酶消化液(美國HyClone 公司)、DMEM/ F12(美國 Hyclone 公司)；Neurobasal 培養(yǎng)基(美國 Gibco 公司)、L-Glutamine(美國索萊寶公司)、B27(美國Gibco 公司)、封閉山羊血清(美國索萊寶公司)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體(NSE抗體，上海博奧森公司)、Alexa fluor 488標記的山羊抗兔 IgG(上海博奧森公司)、DAPI染色液(上海博奧森公司)、4%多聚甲醛(美國索萊寶公司)、聚乙二醇辛基苯基醚(美國索萊寶公司)、PBS緩沖液(美國HyClone 公司)、青霉素/鏈霉素(美國HyClone 公司)及D-Hanks液(美國索萊寶公司)。主要儀器有二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱、生物安全柜、倒置相差顯微鏡及熒光倒置顯微鏡。

1.3 方法

1.3.1多聚賴氨酸包被 多聚賴氨酸(×10)與高壓滅菌雙蒸水按1∶9稀釋，用巴氏滴管吸取已稀釋的多聚賴氨酸鋪滿培養(yǎng)板，置入37 ℃培養(yǎng)箱中放置2～4 h后回收多聚賴氨酸，鋪板前用PBS清洗3次備用。

1.3.2溶液配制 種植液：DMEM/F12 42 mL，胎牛血清 7 mL，L-Glutamine 0.5 mL，青霉素/鏈霉素 0.5 mL。飼養(yǎng)液：Neurobasal 培養(yǎng)基 48 mL，B-27 1 mL，L-Glutamine 0.5 mL，青霉素/鏈霉素 0.5 mL。0.125%的胰酶消化液：用0.25%的胰酶消化液，加入等體積PBS緩沖液配制0.125%胰酶消化液。

1.3.3海馬組織提取 參考文獻[10-12]方法提取海馬組織，將實驗乳鼠用75%的酒精浸泡消毒3～5 min，斷頭后暴露左右大腦半球、去除表層腦組織后，分離兩側(cè)月牙狀的海馬并置入盛有預冷的D-Hank’s平衡鹽溶液中；20倍放大鏡下剔除海馬的血管及腦膜，再將海馬置于冰上裝有4 mL種植液的離心管中。

1.3.4分組及處理 實驗分為胰酶稀釋組和胰酶未稀釋組，分別用0.125%及0.25%的胰酶提取海馬神經(jīng)元。胰酶稀釋組：提取的海馬組織靜置2 min后棄掉上清液，用PBS清洗2次，機械吹打20～40次，予1 000 r/min離心 5 min，去掉上清液，加入0.125%胰酶消化，胰酶的量為海馬組織的10倍，機械吹打20次，將制備好的細胞懸液加入培養(yǎng)皿中，放入37 ℃孵育箱消化15 min，消化期間每隔5 min搖晃1次培養(yǎng)皿，使組織充分消化。胰酶未稀釋組: 將海馬組織用PBS清洗2次，去掉上清液，加入0.25%胰酶消化液，其余操作步驟相同。兩組均以胎牛血清終止消化，用200目的篩網(wǎng)過濾后離心棄掉上清液制成細胞懸液，按細胞密度為1×109個/L接種，置入37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。先予以種植液培養(yǎng)4～5 h后，更換為飼養(yǎng)液，每3 d半量或1/3量換液，同時觀察獲得的細胞數(shù)量。

1.3.5免疫熒光法鑒定海馬神經(jīng)元及純度 選取第7天的海馬神經(jīng)元，用多聚甲醛、0.5%Tritonx-10和5% BSA固定、透化、封閉神經(jīng)元，然后加入1∶200神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)抗體。次日避光加入1∶200的山羊抗兔IgG標記的二抗，靜置2 h后避光加入DAPI，在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光細胞及細胞核。隨機選取5個視野，計數(shù)其陽性細胞的個數(shù)，并計算陽性神經(jīng)元的百分率，取平均值。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0進行統(tǒng)計學分析，兩組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析前先進行Levene方差齊性檢驗，若方差齊，兩組變量采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 形態(tài)學觀察

海馬神經(jīng)元接種到培養(yǎng)板中，可見細胞呈圓形，有明顯光暈。胰酶稀釋組：接種4～5 h后，約90%以上細胞已經(jīng)貼壁，鏡下細胞呈圓形，少數(shù)細胞已長出細小突起。胰酶未稀釋組：8～10 h細胞70%以上貼壁，有時甚至延長到72 h才能完全貼壁。細胞貼壁后換用無血清飼養(yǎng)液，1 d后大部分神經(jīng)元長出1個細小突起；培養(yǎng)2～3 d，神經(jīng)元的突起變長變粗、突起個數(shù)增多、細胞突起出現(xiàn)稀疏網(wǎng)狀連接；培養(yǎng)4～6 d，神經(jīng)元細胞聚集出現(xiàn)緊密的網(wǎng)狀連接，細胞的突起增長增多；培養(yǎng)7～9 d，神經(jīng)元胞體飽滿，呈圓形或不規(guī)則形，突起分支很多，形成致密細胞網(wǎng)絡。在顯微鏡下對兩組細胞進行計數(shù)，胰酶未稀釋組細胞個數(shù)多于胰酶稀釋組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖1。

(1)與稀釋組比較，P<0.01圖1 胰酶稀釋組與胰酶未稀釋組所獲得的海馬神經(jīng)元數(shù)(200×)Fig.1 The numbers of primary hippocampal neurons in 0.25% trypsin group and 0.125% trypsin group

2.2 海馬神經(jīng)元純度

海馬神經(jīng)元培養(yǎng)第7天時，細胞已經(jīng)成熟，因此本實驗選擇在第7天時對稀釋組細胞進行純度鑒定。胞體和樹突呈現(xiàn)綠色為NSE陽性海馬神經(jīng)元(圖2A)，神經(jīng)膠質(zhì)細胞、成纖維細胞均不染色，同時用DAPI對細胞核進行藍染獲得細胞總數(shù)(圖2B)。經(jīng)鑒定，陽性反應海馬神經(jīng)元的純度為90%以上。

注：A中綠色熒光為表達NSE陽性的海馬神經(jīng)元，B為經(jīng)DAPI法藍染的海馬神經(jīng)細胞核圖2 胰酶稀釋組海馬神經(jīng)元純度鑒定(免疫熒光，×200)Fig.2 Identification of primary hippocampal neurons in 0.25% trypsin group

3 討論

在神經(jīng)精神疾病的研究中已經(jīng)廣泛地應用海馬神經(jīng)元作為細胞模型，尤其是在神經(jīng)系統(tǒng)疾病如AD、癲癇、腦血管疾病研究中尤其重要。但是神經(jīng)元的培養(yǎng)仍然存在雜質(zhì)細胞多、生長狀態(tài)差等問題。由于神經(jīng)元在體外培養(yǎng)存活時間短，而且生長緩慢，如何得到純度高、活力好和體外存活時間長的神經(jīng)元仍然是一個值得探討的難題。神經(jīng)元在海馬組織中聚集，為獲得純度高、雜質(zhì)少的神經(jīng)元常優(yōu)先選擇海馬區(qū)域作為取材部位。

神經(jīng)元是高度分化的細胞，一般只作原代貼壁培養(yǎng)，因此神經(jīng)元接種后的貼壁情況對于它的存活有著關鍵作用。由于神經(jīng)元不具有良好的貼壁能力，因此需要提前在培養(yǎng)板表面添加可加強細胞貼壁的物質(zhì)以改變培養(yǎng)板上的電荷，使細胞更易于結合貼附，特別是需要長期培養(yǎng)細胞完成后續(xù)研究的實驗[15-16]。大部分文獻中多采用多聚賴氨酸包被培養(yǎng)板[17-18]。在以往的研究中發(fā)現(xiàn)大部分以采用胰蛋白酶消化海馬組織[19-20]，但是胰蛋白酶消化的濃度及時間影響神經(jīng)元提取質(zhì)量。海馬神經(jīng)元的分離方法有多種，本實驗采用將胰蛋白酶的濃度稀釋一半后消化海馬，所得海馬神經(jīng)元比未稀釋組細胞數(shù)目多，存活率高，生長狀態(tài)良好。本實驗終止消化使用的是4 mL FBS，終止消化后過濾未完全消化的組織碎片。實驗中先用14%胎牛血清的 DMEM/12將細胞制備為細胞懸液，細胞貼壁后4～5 h更換無血清培養(yǎng)基[21]飼養(yǎng)細胞。主要原因：(1)含有血清的培養(yǎng)基在鋪板初期可促進神經(jīng)元快速貼壁[22]，一般接種4～5 h后神經(jīng)元細胞已貼壁牢固，而膠質(zhì)細胞貼壁能力強但貼壁速度緩慢，因此通過貼壁時間差和及時更換無血清培養(yǎng)液可在一定程度上減少雜質(zhì)細胞，使海馬神經(jīng)元的純度更高；(2)Neuralbasal培養(yǎng)基是一種專用于神經(jīng)元生長的特殊培養(yǎng)基，含有抑制膠質(zhì)細胞生長的成分，因此實驗中未使用阿糖胞苷，可減少對神經(jīng)元的損傷作用，有利于海馬神經(jīng)元保存良好的生長狀態(tài)；(3)B27中含有谷酰胺、轉(zhuǎn)鐵蛋白等細胞生長所必需的營養(yǎng)因子[23-24]，尤其是含有多種適宜神經(jīng)元生長的營養(yǎng)因子；(4)飼養(yǎng)液中Neuralbasal培養(yǎng)基、谷氨酰胺與B27配置使用能夠更好地促進神經(jīng)元細胞的生長，抑制雜質(zhì)細胞如膠質(zhì)細胞的生長，從而提高神經(jīng)元的純度和活性。

通過對原代海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)，總結出以下經(jīng)驗： (1)稀釋胰酶法可減少胰酶消化液對神經(jīng)元的損害，細胞純度更高、生長狀態(tài)良好；胰蛋白酶相較木瓜酶、Accutase酶更具有經(jīng)濟效益；(2)全部操作過程應在冰上進行，冰上操作降低腦組織代謝率，減少細胞的損傷，提高神經(jīng)元的存活率，盡量剝離海馬組織表面的腦膜及血管，因為腦膜和血管剝離不干凈可減少神經(jīng)元數(shù)量以及增加雜質(zhì)細胞如膠質(zhì)細胞及成纖維細胞等；(3)雖然膠質(zhì)細胞貼壁能力強，但貼壁速度較緩慢，故在細胞接種后4～5 h更換為無血清培養(yǎng)基，以通過差速貼壁來去除膠質(zhì)細胞，增加神經(jīng)元的純度；(4)稀釋的胰酶消化液的需要量為海馬組織體積的10倍，而且稀釋胰酶法消化海馬組織更加溫和，一般在15 min左右，不宜過長，每5 min搖晃1次，使組織與胰蛋白酶充分接觸，使組織充分消化；(5)神經(jīng)元接種密度應控制在1～10×109個/L，細胞密度低，細胞間隙增大，神經(jīng)元之間缺乏營養(yǎng)支持無法形成網(wǎng)絡正常生長，細胞過密使培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)消耗過快，從而導致神經(jīng)元之間產(chǎn)生接觸抑制。

通過該實驗方法可獲得純度高、狀態(tài)良好的原代海馬神經(jīng)元，而且試劑的配置及操作相對簡單，為以海馬神經(jīng)元為基礎細胞模型的神經(jīng)系統(tǒng)相關疾病提供了實驗基礎。