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      電針足三里-環(huán)跳穴對(duì)不同狀態(tài)大鼠血清外泌體表達(dá)的影響*

      2019-01-25 08:45:38李牧洋王婷婷李檸岑卓雪茂邢立瑩陳澤林
      陜西中醫(yī) 2019年2期
      關(guān)鍵詞:泌體外泌體電針

      李牧洋,王婷婷,2,陳 波△,李檸岑,卓雪茂,邢立瑩,陳澤林

      1.天津中醫(yī)藥大學(xué)(天津301617);2.遼寧省大連市婦幼保健院(大連 116033)

      外泌體(Exosomes)是一種由細(xì)胞內(nèi)多囊泡體(Multivesicular body,MVB)與細(xì)胞膜融合后釋放到細(xì)胞外環(huán)境中的脂質(zhì)雙分子膜包裹的小囊泡,最早發(fā)現(xiàn)于體外培養(yǎng)的綿陽(yáng)紅細(xì)胞上清液中[1],隨后,在血液[2]、尿液[3]、乳汁[4]、羊水[5]中陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。外泌體可攜帶蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNA及microRNA等大量細(xì)胞內(nèi)生物信息,是生物體細(xì)胞間通訊的重要方式,是神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫不同細(xì)胞及系統(tǒng)之間信息交互的重要載體[6]。 “信息傳遞新方式——細(xì)胞囊泡運(yùn)輸”的發(fā)現(xiàn)2013年被授予諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng),使得囊泡研究成為醫(yī)學(xué)及生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)。

      最新研究表明,過(guò)往發(fā)現(xiàn)的與針刺鎮(zhèn)痛密切相關(guān)的內(nèi)源性活性物質(zhì)也存在Exosomes運(yùn)輸形式。如Schuler等[7]人發(fā)現(xiàn)外泌體可作為阿片受體(MOR) siRNA的載體,透過(guò)血腦屏障治療嗎啡成癮。Arslan等[8]人發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的Exosomes可以釋放ATP,減弱氧化應(yīng)激,激活PI3K/Akt通路起到心肌保護(hù)作用。Clayton等[9]人發(fā)現(xiàn)外泌體所含酶的活性決定了細(xì)胞外腺苷的含量,外泌體是腺苷轉(zhuǎn)運(yùn)的重要方式。以上實(shí)驗(yàn)都提示,與針刺鎮(zhèn)痛密切相關(guān)的諸多活性物質(zhì)可能存在共通的運(yùn)輸載體——Exosomes。本實(shí)驗(yàn)探討針刺對(duì)不同狀態(tài)(正常、佐劑性關(guān)節(jié)炎)大鼠血清中外泌體表達(dá)的影響。

      材料與方法

      1 材 料

      1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:實(shí)驗(yàn)選用清潔級(jí)雄性健康Wistar大鼠60只,體重(220±10)g,購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào):SCXK(軍)2014-0001]。

      1.2 主要儀器與試劑:全自動(dòng)凝膠成像儀(美國(guó)BIORAD公司),化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Scientific公司),0.22μm一次性濾膜(PALL,美國(guó)),ExoQuick Precipitation試劑盒(美國(guó)SBI公司),BCA蛋白定量試劑盒(武漢博士德公司),鼠抗人CD63一抗(Abcam,英國(guó)),羊抗鼠二抗(Affinity,中國(guó)),CD63試劑盒(美國(guó)SBI公司)。

      2 方 法

      2.1 動(dòng)物分組:針刺正常大鼠,將大鼠分為空白對(duì)照組(Control組)、正常+電針1 d組(EA1day)、正常+電針5 d組(EA5day),每組4只,共12只。

      針刺模型大鼠,將大鼠分為鹽水組、模型、模型針刺組,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組4只,共48只。

      2.2 模型制備:將正常Wistar大鼠右后足足底注射完全弗式佐劑0.1 ml/只復(fù)制大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型。

      2.3 干預(yù)方法:正常+電針組是在正常大鼠基礎(chǔ)上單純給予足三里-環(huán)跳穴電針刺激分別為1 d和5 d。給予模型針刺組1 d、5 d、10 d、20 d四個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的治療,鹽水組大鼠則于右后足同部位注射等量生理鹽水。

      2.4 針刺操作:取雙側(cè)足三里穴(腓骨小頭前下5 mm處)、環(huán)跳穴(股骨大轉(zhuǎn)子和最后骶椎連線的外1/3處),采用華佗牌一次性不銹鋼針灸針(0.25×13 mm)。進(jìn)針并后連接華佗牌SDZ-V型電子針療儀(上海寰熙醫(yī)療器械有限公司)刺激雙側(cè)穴位,足三里穴接正極,環(huán)跳穴接負(fù)極。參數(shù)為:疏密波,頻率2/10Hz,強(qiáng)度5/10/15(0.76/1.53/2.3 mA),各10 min,共30 min。

      2.5 外泌體提取:正常+電針組于針刺后取腹主動(dòng)脈血液,離心取血清(4℃,2000 g×10 min)。鹽水組、模型、模型針刺組在造模/鹽水注射后1 d、5 d、10 d、20 d分別取大鼠腹主動(dòng)脈血,靜置2 h后置于離心機(jī)上,4℃,2000 g×10 min,提取上層血清約2 ml,分裝于EP管中,每管500 μl,于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

      從-80℃冰箱中取出血清500 μl,以3000×g,4℃,離心15 min,棄沉淀,保留上清;將上清液過(guò)0.22 μm一次性濾器,收集濾液,約300 μl。參照實(shí)驗(yàn)說(shuō)明書(shū),加入沉淀劑(ExoQuick Precipitation),血清∶沉淀劑=4∶1,蓋緊管蓋,顛倒混勻3次。置于4℃冰箱過(guò)夜反應(yīng),至少12 h,將孵育好的樣品以1500×g,4℃,再次離心30 min,去除上清后留取沉淀,此時(shí)的沉淀即為Exosomes小顆粒(含有部分細(xì)胞碎片),將沉淀用100 μl 1×PBS重懸。

      2.6 Western blot檢測(cè)外泌體特異性標(biāo)志蛋白:SDS-PAGE凝膠電泳及圖像分析:將提取的外泌體加入1/4體積的RIPA蛋白裂解液,使用BCA法測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)BCA蛋白定量結(jié)果調(diào)整蛋白濃度,加入5×loading buffer,97 ℃煮沸5 min,上樣。4%濃縮膠低電壓80V電泳30 min,隨后轉(zhuǎn)120V電壓,電泳80 min,室溫下以0.25%考馬斯亮藍(lán)染液染色2 h,烤染脫色液脫色2 h,Bio-Rad凝膠成像儀掃描并分析圖像。

      Western blot檢測(cè)外泌體表面CD63:如前所述進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,蛋白分離后將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜。以5% BCA(1×TBST,含0.05%Tween-20)室溫封閉2 h。室溫避光加入一抗(孵育鼠抗人CD63抗體,1∶2500),4℃過(guò)夜。1×TBST洗膜后(5 min×6),室溫避光加入二抗(HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG1∶5000),室溫孵育1 h,洗膜,滴加預(yù)混化學(xué)發(fā)光底物于PVDF膜,暗室曝光。

      2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,多組(≥3)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。使用LSD檢驗(yàn)法,正態(tài)分布的各項(xiàng)統(tǒng)計(jì)指標(biāo)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      結(jié)果

      1 電針對(duì)正常大鼠血清外泌體表達(dá)水平的影響 對(duì)正常大鼠持續(xù)電針發(fā)現(xiàn):針刺1 d后,血清中外泌體水平顯著升高。針刺5 d后,外泌體繼續(xù)升高,說(shuō)明電針可能促進(jìn)了正常大鼠血清外泌體釋放(圖1)。

      圖1 電針正常大鼠足三里-環(huán)跳穴對(duì)血清e(cuò)xosome表達(dá)的影響

      2 電針對(duì)CFA大鼠血清外泌體表達(dá)水平的影響 造模后(急性炎性狀態(tài)下),大鼠血清中外泌體較鹽水組升高,針刺1 d后,外泌體降低。針刺5 d后,模型組與電針組仍高于對(duì)照組,電針組略高于模型組。針刺10 d后,大鼠踝關(guān)節(jié)局部轉(zhuǎn)為慢性炎癥,模型組與電針組血清中外泌體較對(duì)照組降低,且二者比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。針刺20 d后,模型組與電針組仍低于對(duì)照組,但電針組明顯高于模型組,且接近于對(duì)照組。CFA致炎后,炎癥急性發(fā)展期,大鼠血清中與炎癥密切關(guān)聯(lián)的外泌體可能大量釋放,電針在此過(guò)程中可能抑制在炎癥初期與病理模型密切相關(guān)的外泌體的釋放。在炎癥后期,電針?biāo)碌牧夹匝装Y反應(yīng)可能釋放與電針抗炎相關(guān)的外泌體,以抑制模型炎癥過(guò)程(圖2)。

      圖2 電針佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠足三里-環(huán)跳穴對(duì)血清外泌體表達(dá)的影響

      討 論

      類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種以侵蝕性關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的自身免疫病,基本病理表現(xiàn)為滑膜炎、血管翳形成,并逐漸出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨和骨破壞,最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失,可并發(fā)肺部疾病、心血管疾病、惡性腫瘤及抑郁癥等[10-11]歷代文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn),類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎屬于中醫(yī)“骨痹”范疇,或成為“膝痹”,其致病之本為肝、脾、腎虧虛,加之外感風(fēng)寒濕邪,氣血瘀滯,痰濕阻絡(luò),不通則痛,發(fā)為本病。

      本研究選取足三里穴和環(huán)跳穴予以相應(yīng)治療,足三里為強(qiáng)身健體之要穴,具有調(diào)理脾胃、通經(jīng)活絡(luò)、補(bǔ)中益氣、扶正祛邪的作用。針刺足三里補(bǔ)益氣血,可有效延緩膝關(guān)節(jié)炎的癥狀加重?!鹅`樞》:“著痹不去,久寒不已,卒取其三里骨為干?!睆?qiáng)調(diào)足三里對(duì)著痹,即關(guān)節(jié)炎類疾病有獨(dú)特療效?!夺樉募滓医?jīng)》:“脛痛不可屈伸,痹不仁,環(huán)跳主之?!薄断胭x》:“冷風(fēng)冷痹疾難愈,環(huán)跳腰間針與燒。”說(shuō)明針灸對(duì)痹癥所致的麻痹不仁、纏綿難愈具有一定作用[12]。

      本研究以外泌體特有的標(biāo)記蛋白 CD63為標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)電針可促進(jìn)正常大鼠血清外泌體釋放,且在D1-D5范圍內(nèi),外泌體表達(dá)隨著針刺次數(shù)增加而升高;在佐劑性關(guān)節(jié)炎炎癥急性發(fā)展期,電針可抑制與炎癥密切相關(guān)的外泌體釋放,在炎癥后期,電針刺激可能釋放與電針抗炎有關(guān)的外泌體,起到抑制炎癥的作用[13-15]。

      外泌體是所有細(xì)胞分泌的納米級(jí)微囊泡,細(xì)胞間通訊的重要方式,是神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)的重要載體,過(guò)往發(fā)現(xiàn)的與針刺鎮(zhèn)痛密切相關(guān)的內(nèi)源性活性分子也以外泌體方式傳遞信息。電針激活神經(jīng)系統(tǒng)在健康或者是疼痛的情況下是各不相同的,并且可以同時(shí)減輕痛感覺(jué)和痛反應(yīng)。在生理狀態(tài)下,持續(xù)電針大鼠發(fā)現(xiàn):針刺1 d后,血清中外泌體水平升高顯著。針刺5 d后,外泌體繼續(xù)升高,說(shuō)明電針能有促進(jìn)正常大鼠血清外泌體釋放的趨勢(shì)。在此過(guò)程中,外泌體中攜帶的活性鎮(zhèn)痛物質(zhì)(如阿片肽、ADO、5-HT、SP等)可能參與了大鼠足底熱輻射痛的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。在病理狀態(tài)下,造模后,大鼠血清中外泌體較鹽水組升高顯著,針刺1 d后,外泌體降低。針刺5 d后,電針組持續(xù)升高。針刺10 d后,大鼠踝關(guān)節(jié)局部轉(zhuǎn)為慢性炎癥,模型組與電針組血清中外泌體較對(duì)照組降低,且二者無(wú)顯著差異。針刺20 d后,電針組明顯高于模型組,且接近于鹽水組。由此猜測(cè),CFA致炎后,炎癥急性發(fā)展期,大鼠血清中與炎癥密切關(guān)聯(lián)的外泌體可能大量釋放,電針在此過(guò)程中可能抑制在炎癥初期與病理模型密切相關(guān)的外泌體的釋放。在炎癥后期,電針?biāo)碌牧夹匝装Y反應(yīng)可能釋放與電針抗炎相關(guān)的外泌體,以抑制模型炎癥過(guò)程。

      以往大量研究表明,電針的啟效機(jī)制是通過(guò)神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)模式來(lái)達(dá)到鎮(zhèn)痛、抗炎效應(yīng),而外泌體是神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)細(xì)胞間通訊的重要方式,與炎癥相關(guān)的多種生物分子,如CGRP、NE、IL、TNF-α等化學(xué)物質(zhì),這些信號(hào)分子可以將針刺信息級(jí)聯(lián)放大, 激活人體神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)發(fā)揮針刺網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)效應(yīng)[16-17],故推測(cè)外泌體攜帶多種特定的信息進(jìn)行體內(nèi)長(zhǎng)距離的運(yùn)輸,其內(nèi)含物質(zhì)在針刺傳導(dǎo)的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)中可能發(fā)揮重要作用[18-19]。外泌體內(nèi)含物質(zhì)作為供體和受體細(xì)胞生理調(diào)節(jié)物,參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和功能的許多方面,包括突觸溝通、調(diào)節(jié)突觸的強(qiáng)度、神經(jīng)再生、神經(jīng)退行性疾病、腦腫瘤進(jìn)展等[20]。 同時(shí), 外泌體還可以通過(guò)細(xì)胞間物質(zhì)的運(yùn)輸和交換進(jìn)行內(nèi)分泌及免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)、 擴(kuò)增和/或調(diào)節(jié)[21], 如中性粒細(xì)胞衍生的胞外囊泡的定向運(yùn)輸使血小板介導(dǎo)先天免疫反應(yīng)等[22],針刺的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)是復(fù)雜的,而這種復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)之中相互關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵物質(zhì)啟效時(shí)間必然存在差異。我們前期研究發(fā)現(xiàn)相比于電針鎮(zhèn)痛效應(yīng),抗炎效應(yīng)出現(xiàn)較晚且較為持久,這可能與外泌體攜帶的信息物質(zhì)有關(guān)。為了維持機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡,抑制炎癥早期出現(xiàn)的疼痛反應(yīng),外泌體攜帶的信息以“鎮(zhèn)痛”為主要目標(biāo),隨著炎癥發(fā)展,鎮(zhèn)痛已不能滿足機(jī)體自身對(duì)于穩(wěn)態(tài)失衡的調(diào)節(jié),繼而以“抗炎”為主要任務(wù)。

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