超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定青貯飼料中草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸

張雨萌 邊海濤 勇艷華

（大連市食品檢驗所，遼寧大連116000）

有害物質(zhì)可以通過污染的飼料進入肉、奶等畜產(chǎn)品，進而通過食物鏈進入人體，危害人的健康。因此，飼料的質(zhì)量安全越來越受到重視。草甘膦（glyphosate,GLY），是全球第一大除草劑品種，占據(jù)全球除草劑市場份額的30%[1]。草甘膦及其主要代謝物氨甲基膦酸（aminomethylphosphonic acid,AMPA）能引起人體紅細胞活性氧增加和乙酰膽堿酯酶活性降低[2-3]，草甘膦能導(dǎo)致大鼠肝損傷[4]和干擾牛的卵巢功能[5]。2017年國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）將草甘膦歸為2A類致癌物[6]，可能引起淋巴腺癌，由此引發(fā)的草甘膦是否致癌之爭受到廣泛關(guān)注。國際食品法典委員會規(guī)定飼料中草甘膦的最大殘留量為50～500 mg/kg，美國規(guī)定飼料中草甘膦的最大殘留量為100～300 mg/kg。青貯飼料由含水分多的植物性飼料經(jīng)過密封、發(fā)酵而成，可以長久儲存，解決了我國牧場秋冬季飼料不足的問題，使其成為食草畜牧業(yè)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。草甘膦廣泛應(yīng)用于玉米、大豆、牧草等青貯飼料原料作物，不合理的使用可能導(dǎo)致青貯飼料草甘膦殘留污染，并通過食物鏈危害肉、奶等食品安全和人體健康。

草甘膦和氨甲基膦酸的檢測方法有離子色譜法[7]、液相色譜法[8]、氣相色譜-質(zhì)譜法[9]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10-13]等。其中，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是目前最受關(guān)注和普遍采用的方法，已被廣泛用于食品、環(huán)境樣品和生物樣品中草甘膦及氨甲基膦酸的測定[10-15]。但其在青貯飼料中草甘膦及氨甲基膦酸測定方面的研究鮮見報道。

青貯飼料基質(zhì)復(fù)雜，草甘膦和氨甲基膦酸極性大，在反相柱上無保留。針對這些問題，本研究采用0.05%KOH溶液提取樣品，C18固相萃取柱凈化，柱前9-芴基甲基氯仿（FMOC-Cl）衍生，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。旨在建立一種靈敏、準確、高效的青貯飼料中草甘膦和氨甲基膦酸檢測方法，為監(jiān)控青貯飼料質(zhì)量和保障食品安全、消費者健康提供有效技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草甘膦（農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所）；氨甲基膦酸（純度≥99.0%，德國Dr.Ehrenstorfer公司）；甲醇、乙腈（色譜純，美國MREDA公司）；甲酸、無水乙酸銨（色譜純，北京迪科馬科技有限公司）；丙酮、鹽酸、硼酸鈉、氫氧化鉀（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；FMOC-Cl（純度≥98.0%，美國Sigma公司）；試驗用水為超純水。

固相萃取柱 Plexa（6 ml/200 mg，Agilent Bond Elut Plexa）、C18（6 ml/200 mg，Agilent Bond Elut-C18）和HLB（6 cc/200 mg，Waters Oasis HLB）。

青貯飼料樣品來源于內(nèi)蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1290/G6495超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；超聲清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；超純水系統(tǒng)（德國Star?torius公司）；XW-80A渦旋混合器（上海精科實業(yè)有限公司）；HNY-303恒溫培養(yǎng)振蕩器（天津市歐諾儀器儀表有限公司）；CF16RN離心機（日本Hitachi公司）。

1.3 混合標準基質(zhì)工作液

準確稱取10 mg（精確到0.01 mg）草甘膦、氨甲基膦酸標準品分別用水定容至10 ml，配制成濃度為1 mg/ml的標準儲備液。分別移取100μl的草甘膦和氨甲基膦酸儲備液于10 ml容量瓶中，用水定容配制成10 mg/l的混合標準溶液。采用相應(yīng)種類的空白青貯飼料，經(jīng)提?。ㄒ?.4.1.1節(jié)）、凈化（見1.4.1.2節(jié)）后將上述混合標準溶液逐級稀釋成五個不同濃度的（5～500μg/l）的混合標準基質(zhì)工作液。

表1 GLY和AMPA的質(zhì)譜條件參數(shù)

1.4 試驗方法

1.4.1 樣品前處理

1.4.1.1 提取

稱取2 g（精確到0.01 g）粉碎均勻的樣品于100 ml聚乙烯離心管中，加20 ml濃度為0.05 mol/l KOH溶液，超聲20 min，10 000 r/min離心3 min；將上清液轉(zhuǎn)移至另一100 ml離心管中，殘渣用20 ml濃度為0.05 mol/l KOH溶液重復(fù)提取一次，合并提取液，用5 mol/l HCl將提取液調(diào)至pH值為7，待凈化。

1.4.1.2 凈化

取1 ml提取液淋洗經(jīng)預(yù)先活化的C18固相萃取小柱（C18小柱活化：先加5 ml甲醇，再加5 ml水活化），棄去；待流干后再加1.5 ml提取液通過C18小柱，收集流出液。

1.4.1.3 衍生

取經(jīng)凈化的流出液及混合標準基質(zhì)工作液（見1.3節(jié)）各1.0 ml分別于10 ml試管中，各加入5%硼酸鈉溶液200μl及10 g/l FMOC-Cl丙酮溶液200μl，渦旋混勻，于50℃恒溫培養(yǎng)振蕩器內(nèi)進行振蕩衍生化反應(yīng)0.5 h，取出靜置至室溫后通過0.22μm濾膜，供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.4.2 色譜條件

色譜柱：Agilent poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×50 mm，2.7μm）；流速0.3 ml/min；柱溫40 ℃；進樣量5 μl；流動相A：1 mmol/l乙酸銨水溶液（0.1%甲酸），流動相B：乙腈（0.1%甲酸）；梯度洗脫程序：0～0.5 min，80%A；0.5～5 min，80%A～5%A；5～6.5 min，5%A；6.5～6.6 min，5%A～80%A；6.6～9 min，80%A。

1.4.3 質(zhì)譜條件

電噴霧電離源（ESI），正離子掃描模式；毛細管電壓3 000 V；霧化氣壓力20 psi；脫溶劑氣溫度250℃，脫溶劑氣流速11 L/min；鞘氣溫度200℃，鞘氣流速14 L/min；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜、質(zhì)譜條件的優(yōu)化

選擇水-乙腈、0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈、0.1%甲酸水（1～5 mmol/l乙酸銨）-0.1%甲酸乙腈進行流動相條件優(yōu)化。結(jié)果顯示，在酸性流動相條件下，目標化合物的離子化效率得到提高，響應(yīng)增大。不含乙酸銨的流動相中，氨甲基膦酸的色譜峰出現(xiàn)拖尾，對定量分析造成影響；乙酸銨的加入能良好的改善峰形，但隨著乙酸銨濃度的升高兩種目標化合物響應(yīng)減小。綜合考慮，實驗選擇1 mmol/l乙酸銨水溶液（0.1%甲酸）-乙腈（0.1%甲酸）作為流動相。

分別取1 mg/l草甘膦和氨甲基膦酸標準溶液進行衍生，在ESI+模式下，選擇各準分子離子[M+H]+作為母離子，進行二級質(zhì)譜優(yōu)化。草甘膦和氨甲基膦酸的保留時間、定量和定性離子、碰撞能量見表1。

2.2 前處理的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑

草甘膦和氨甲基膦酸都是強極性化合物，難溶于有機溶劑，常用純水[10]、氫氧化鉀溶液[13]作為提取溶劑。本文考察了0～0.5 mol/l氫氧化鉀溶液的提取效率，結(jié)果如圖1所示。氫氧化鉀濃度為0.05 mol/l時，草甘膦和氨甲基膦酸均具有較高的回收率，故選擇0.05 mol/l的氫氧化鉀作為提取溶劑。

圖1 不同濃度KOH提取溶液對草甘膦和氨甲基膦酸回收率的影響

2.2.2 凈化柱

對比了Plexa、C18和HLB三種固相萃取小柱的凈化效果，結(jié)果如表2所示，C18小柱凈化的回收率明顯高于Plexa和HLB。

表2 不同固相萃取小柱對回收率的影響（%）

2.2.3 衍生條件

從衍生溶液濃度、時間、溫度三個方面對衍生條件進行優(yōu)化。首先以1.0 mg/kg的草甘膦和氨甲基膦酸空白加標青貯飼料作為試樣，在室溫衍生4 h條件下[16]對比了5～30 g/l衍生溶液對衍生效率的影響。如圖2所示，隨著衍生溶液濃度增大，目標化合物的響應(yīng)均逐漸增大。但當濃度大于10 g/l時，增幅很小。因此選擇10 g/l的FMOC-Cl丙酮溶液為衍生溶液。

圖2 衍生溶液濃度對衍生反應(yīng)的影響

圖3 衍生溫度及時間對衍生反應(yīng)的影響

如圖3所示，在0～1 h時間范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，衍生效率逐漸提高而增幅逐漸減小，50℃與60℃兩個溫度下的衍生效率基本持平。兩種物質(zhì)在50℃條件下反應(yīng)0.5 h的衍生效率就已趨于穩(wěn)定，而在室溫、30、40℃條件下，衍生效率雖然隨著時間增加呈增大趨勢，但耗時過長。故選擇50℃條件下反應(yīng)0.5 h為衍生條件，在保證衍生反應(yīng)充分的基礎(chǔ)上大大提高了檢測效率。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

以ME（Matrix effect，ME=B/A×100%）來量化基質(zhì)效應(yīng)，其中A、B分別為目標化合物在純?nèi)軇┖突|(zhì)匹配標準液中的平均響應(yīng)值（n=3）。結(jié)果顯示，氨甲基膦酸衍生物在青貯飼料中基質(zhì)作用不明顯，ME（Matrix effect，ME=B/A×100%）為87.5%；而草甘膦衍生物基質(zhì)抑制效應(yīng)較強，ME為65.5%。為消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，本研究采用相應(yīng)的基質(zhì)匹配標樣進行校準。

2.4 方法的線性范圍、相關(guān)系數(shù)和定量限

將經(jīng)衍生的混合標準基質(zhì)工作液按優(yōu)化的條件上機測定。以目標化合物的峰面積響應(yīng)值（Y）為縱坐標，質(zhì)量濃度（X，μg/l）為橫坐標做標準曲線，得到草甘膦和氨甲基膦酸的線性方程和相關(guān)系數(shù)見表3。結(jié)果顯示，在5～500μg/l濃度范圍內(nèi)目標化合物線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。定量限（LOQ）以S/N≥10時的基質(zhì)標液濃度確定，草甘膦和氨甲基磷酸的LOQ均為0.1 mg/kg。

表3 草甘膦和氨甲基膦酸的線性方程、相關(guān)系數(shù)(R2)、定量限

2.5 加標回收率和精密度

在空白青貯飼料中分別添加0.1、0.2、0.3 mg/kg和1.0 mg/kg的草甘膦和氨甲基膦酸進行回收率試驗，按1.4.1節(jié)進行前處理，每個水平重復(fù)6次，平均回收率和相對標準偏差（RSD）見表4。草甘膦的回收率在92.7%～114.3%之間，氨甲基膦酸的回收率在96.7%～115.9%之間，相對標準偏差均小于10%?？瞻浊噘A飼料及空白青貯飼料添加草甘膦和氨甲基膦酸（0.3 mg/kg）的特征離子質(zhì)量色譜圖見圖4。

表4 草甘膦和氨甲基膦酸的平均回收率和相對標準偏差（n=6）

3 結(jié)論

本文建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定青貯飼料中的草甘膦和氨甲基膦酸殘留的方法。方法簡便高效、回收率高、選擇性好、靈敏度高，適用于青貯飼料中草甘膦和氨甲基膦酸的確證與定量測定。

圖4 草甘膦和氨甲基膦酸特征離子質(zhì)量色譜圖