重組人源肺孢菌主要表面糖蛋白C共有抗原在肺孢菌肺炎診斷中的價值

王建成， 何之星

肺孢菌肺炎（Pneumocystispenumonia，PCP），是由耶氏肺孢菌（Pneumocystis jirovecii）引起的致死性呼吸系統(tǒng)機會性感染。即使引入高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療（HAART），PCP仍為HIV感染患者主要的并發(fā)疾病[1]，隨著癌癥患者、器官移植者等PCP高危人群的擴大，非HIV感染PCP患者日趨增多[2-3]。在世界范圍內(nèi)，PCP處于侵襲性真菌感染的第2位[4]，未經(jīng)干預(yù)的PCP患者病死率接近100%。PCP臨床癥狀、體征無特異性，致病機制尚不明確，缺乏無創(chuàng)、敏感的早期診斷方法。痰液和支氣管肺泡灌洗液（BALF）標(biāo)本病原體染色鏡檢為診斷PCP的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但痰液標(biāo)本檢出率低，支氣管肺泡灌洗屬于有創(chuàng)操作，兒童患者或呼吸道功能衰竭患者難以耐受。近年來，無創(chuàng)、方便的侵襲性真菌感染檢測血清學(xué)指標(biāo)，如乳酸脫氫酶（LDH）、(1，3)-β-D 葡聚糖等被用于PCP輔助診斷，并取得一定效果[5-6]。主要表面糖蛋白（Msg）是肺孢菌胞壁主要成分，具有高度免疫原性及保護性B細胞和T細胞表位。Msg包括Msg A、Msg B和Msg C。Msg C 由MSG基因更為保守的C-末端編碼，抗原性最強，目前多采用重組Msg C抗原進行PCP血清學(xué)研究[7]。MSG基因?qū)儆诙嗫截惢颍看伪磉_的Msg抗原不盡相同，且MSG基因拷貝間通過重組導(dǎo)致變異，這些機制導(dǎo)致耶氏肺孢菌 Msg抗原的多樣性，以利于其逃避宿主免疫攻擊[8]。不同地區(qū)的PCP患者血清對耶氏肺孢菌 Msg C亞型識別能力存在很大差異[9]。因此，合成能夠與不同地區(qū)PCP患者血清抗體結(jié)合的共有抗原可能具有重要臨床意義。本實驗采用真核表達的Msg C共有抗原對PCP高危人群進行血清IgM檢測，評價其臨床意 義。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本

血清標(biāo)本來自2017年1－12月我院48例行支氣管肺泡灌洗檢查的非HIV感染PCP高危人群（高危組）和51例健康體檢者（對照組）。高危組中男21例，女27例，平均年齡（56.5±15.9）歲；其中實體腫瘤化療患者17例，白血病化療患者15例，器官移植患者6例，自身免疫性疾?。愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫性肝炎等）患者10例；對照組男23例，女28例，平均年齡（52.0±16.9）歲。

1.2 血清抗Msg C共有抗原IgM酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）方法

1.2.1 陰性標(biāo)準(zhǔn)血清制備 將復(fù)溶后的重組耶氏肺孢菌 Msg C 共有抗原（在美國杜克大學(xué)人類疫苗研究所完成設(shè)計、生產(chǎn)和純化）按100 μg/cm2的量滴加在硝酸纖維（nitrocellulose，NC）膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h后用PBS洗膜，將重組抗原標(biāo)記的NC膜放入20例隨機血清中，作用1 h后棄NC膜，按上述方法重復(fù)1次，制備陰性標(biāo)準(zhǔn)血 清。

1.2.2 血清抗Msg C共有抗原 IgM ELISA檢測 重組耶氏肺孢菌 Msg C 共有抗原按200 ng（濃度為2 mg/L）包被量包被96 孔板，2～8℃過夜，洗板2次，拍干后5%脫脂牛奶的PBS 封閉4 h后，拍干、過夜干燥后密封，2～8℃保存。將臨床樣本和陰性標(biāo)準(zhǔn)血清用PBS液按1∶10稀釋，設(shè)空白對照，加樣后2～8℃過夜， 每孔加入100 μL 1/750羊抗人IgG-HRP酶工作液，37℃，孵育60 min。充分洗板后加入A和B顯色液各50 μL，37℃，孵育5 min，2 mol/L H2SO4終止后用酶標(biāo)儀（450 nm/630 nm雙波長）檢測。每一塊酶標(biāo)板都帶上20例陰性標(biāo)準(zhǔn)血清盤和4孔空白對照。用陰性標(biāo)準(zhǔn)血清盤的結(jié)果定義每塊酶標(biāo)板檢測的cutoff值。樣本D值=樣本（D450～D630）- [空白（D450～D630）]，計算20 例陰性標(biāo)準(zhǔn)血清D值的95百分位數(shù)（Percentile 95，P95），如果陰性血清標(biāo)本出現(xiàn)離群值后刪除該值重新計算P95。樣本D值大于陰性標(biāo)準(zhǔn)血清P95D值的2.1倍定義為陽性。

1.2.3 (1，3)-β-D葡聚糖檢測 將-20℃冷凍保存的高危組和對照組血清學(xué)標(biāo)本復(fù)融后，使用北京金山川科技發(fā)展公司的(1，3)-β-D 真菌檢測試劑盒，嚴格按照說明書進行操作，反應(yīng)結(jié)束后系統(tǒng)由標(biāo)準(zhǔn)曲線自動計算出待測血漿中葡聚糖含量，(1，3)-β-D葡聚糖值＞60 ng/L，即判定為陽 性。

1.2.4 呼吸道標(biāo)本肺孢菌PCR檢測 高危組48份支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本按常規(guī)PCR方法擴增肺孢菌線粒體大亞基rRNA編碼基因，具體步驟見文獻 [10]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理，正態(tài)分布采用K-S檢驗（Kolmogorov-Smirnov），非正態(tài)分布計量資料采用配對資料的Wilcoxon符號秩和檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗Msg C 共有抗原IgM 抗體ELISA檢測結(jié)果

2.1.1 陰性標(biāo)準(zhǔn)血清制備 20例對照血清重組抗原吸附前后，抗Msg C共有抗原 IgM抗體檢測D均為非正態(tài)分布，吸附前后D中位值分別為0.18和0.13，經(jīng)配對資料的Wilcoxon符號秩和檢驗顯示差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

2.1.2 高危組和對照組兩種血清學(xué)檢測結(jié)果 99例標(biāo)本中Msg C 共有抗原IgM抗體檢測陽性率為28.3%（28例），(1，3)-β-D 葡聚糖檢測陽性率25.3%（25例），兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義；在高危組48例標(biāo)本中兩者陽性率差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義（35.4%和33.3%）。見表1。兩種檢測方法總體一致性和高危組一致性分別為67.7%和52.1%。

表1 高危組和對照組Msg C共有抗原 IgM 抗體和(1，3)-β-D 葡聚糖檢測結(jié)果Table 1 IgM antibody against Msg C consensus antigen and (1，3)-β-D glucan test in patients at high risk of Pneumocystis pneumonia and healthy control group[n ( % ) ]

2.1.3 高危組Msg C共有抗原 IgM 抗體檢測與PCR檢測結(jié)果比較 48例支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本PCR檢測15例陽性，陽性率為31.2%（15/48），與Msg C共有抗原 IgM抗體檢測差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.665）；高危組Msg C共有抗原 IgM抗體檢測與PCR一致性為58.3%。見表2。在兩種血清學(xué)方法檢驗結(jié)果一致的25例標(biāo)本中，與PCR結(jié)果一致性可提升到84.0%；若以任一種血清學(xué)陽性結(jié)果作為判讀陽性標(biāo)準(zhǔn)，在高危組15例PCR陽性標(biāo)本中的檢出率達86.7%（13/15）。

表2 Msg C 共有抗原IgM 抗體檢測與PCR檢測結(jié)果比較Table 2 Results of IgM antibody against Msg C consensus antigen compared with PCR assay

3 討論

重組Msg抗原在PCP的血清學(xué)診斷和疫苗研制領(lǐng)域均表現(xiàn)出潛在價值，已經(jīng)通過動物實驗初步證實了有效性[11]。野生 Msg抗原高度變異性導(dǎo)致各抗原亞型不能被彼此誘導(dǎo)的抗體識別，依據(jù)某一基因型制備的DNA疫苗/基因工程疫苗，其誘導(dǎo)的抗體不能對表達其他抗原亞型的菌株產(chǎn)生保護作用。共有DNA（consensus DNA）合成技術(shù)是將編碼某一抗原的不同等位基因，通過生物技術(shù)軟件進行編排（align）后，生成一條共有DNA鏈，克隆表達得到共有抗原，該抗原具有不同等位基因所編碼抗原的免疫原共性，更易誘發(fā)適用于不同病毒亞型的廣泛性中和抗體，該技術(shù)在HIV和流感免疫學(xué)診治中發(fā)揮重要的作用[12-13]。我們在早期研究中證實了共有抗原比野生抗原具有更好的檢測陽性率。

本研究采用Msg C共有抗原吸附20名健康人血清制備標(biāo)準(zhǔn)陰性血清，結(jié)果顯示吸附后所制備的標(biāo)準(zhǔn)陰性血清IgM抗體D值顯著降低（P＜0.01），保證了陰性血清的可靠性。此外，本課題采取2項改進措施以保證陰性血清D值的科學(xué)性。其一，考慮ELISA反應(yīng)時間、溫度以及不同操作人員可能都會對反應(yīng)結(jié)果產(chǎn)生影響，在每一塊酶標(biāo)板檢測內(nèi)都帶上了20例陰性標(biāo)準(zhǔn)血清盤，用陰性標(biāo)準(zhǔn)血清盤的結(jié)果定義每塊酶標(biāo)板檢測的cutoff值，以此作為本板試驗的臨界值判定依據(jù)；其二，如果陰性血清標(biāo)本出現(xiàn)離群值后刪除該值重新計算P95。本研究PCP高危人群共有抗原IgM抗體陽性率（35.4%）低于文獻所報道的合成抗原IgM抗體陽性率（68.0%）[14]，原因是研究對象、檢驗方法和陽性判定方式不同，如果采用受試者工作特征曲線（ROC）分析確定陽性cuttoff值，共有抗原在PCP高危人群IgM抗體陽性率可以提高到71.2%，該陽性率高于文獻報道，原因是研究對象均為非HIV感染人群，非HIV感染患者Msg IgM抗體水平高于HIV感染患者[15-16]。

(1，3)-β-D 葡聚糖檢測是目前用于深部真菌感染輔助診斷的常用方法[17-18]，(1，3)-β-D 葡聚糖廣泛存在于真菌細胞壁中，真菌被吞噬細胞吞噬處理后，其即可從胞壁中釋放出來，導(dǎo)致血液及其他體液中含量升高。由于肺孢菌經(jīng)18S核糖體鑒定為真菌，故(1，3)-β-D 葡聚糖亦被用于PCP的血清學(xué)診斷[19-20]。本實驗PCP高危人群(1，3)-β-D 葡聚糖檢測陽性率為33.3%，顯著低于國外文獻報道，主要原因是研究對象的差別，國外多入組已確診的PCP患者[21]，本研究納入的對象大部分為尚未明確診斷的高危人群。

本研究結(jié)果顯示，Msg C共有抗原IgM檢測和(1，3)-β-D 葡聚糖檢測在高危組和對照組陽性率均無顯著性差異，進一步分析顯示兩種檢測方法的總體樣本和高危組一致性分別為67.7%和52.1%，均處于較低水平。可能主要原因是兩者檢測靶物質(zhì)不同，且受到的干擾因素亦不相同，如果增加樣本數(shù)則陽性率差異可能會有統(tǒng)計學(xué)差 異。

下呼吸道標(biāo)本PCR檢測是呼吸道肺孢菌存在直接證據(jù)，本研究48例PCP高危人群中15例陽性，陽性率與兩種血清學(xué)方法相近，分析顯示PCR與兩種血清學(xué)方法一致性均處于較低水平（58.3%和72.9%）。在兩種血清學(xué)方法檢驗結(jié)果一致的25例標(biāo)本中，與PCR結(jié)果一致性可提升到84.0%；若以任一種血清學(xué)陽性結(jié)果作為判讀陽性標(biāo)準(zhǔn)，在高危組15例PCR陽性標(biāo)本中只漏檢2例，具有較好的陽性率。因此，在兒童、老年患者等BALF難以獲得的群體中，聯(lián)合應(yīng)用Msg C共有抗原 IgM 抗體檢測、(1，3)-β-D葡聚糖檢測可一定程度上替代PCR方法。

進一步分析(1，3)-β-D 葡聚糖檢測定量結(jié)果與PCR結(jié)果相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，在14例(1，3)-β-D 葡聚糖檢測＞180 ng/L的樣本（陽性判定標(biāo)準(zhǔn)為60 ng/ L），有6例PCR陰性，其中＞600 ng/L的2份標(biāo)本PCR和IgM 抗體均為陰性，與部分文獻報道的PCP患者(1，3)-β-D 葡聚糖檢測具有較好的靈敏度和特異度不相符[19]，原因可能包括：① (1，3)-β-D 葡聚糖特異性偏低，易受到真菌感染的干擾[22]，在研究制定入選標(biāo)準(zhǔn)時文獻排除了真菌感染干擾，而本研究病例則未排除；② 高危組例數(shù)偏少，需要擴大樣本量進一步分析，且所用試劑盒品牌和陽性判定標(biāo)準(zhǔn)均與其他研究不同。結(jié)合臨床資料分析顯示，6例IgM抗體和PCR均陽性患者中4例有PCP臨床癥狀，并且從六亞甲基四胺銀（GMS）染色標(biāo)本中找到肺孢菌，其余9例PCR陽性，而IgM抗體陰性患者只有2例從GMS染色標(biāo)本檢出肺孢 菌。

綜上所述，Msg C共有抗原IgM 抗體聯(lián)合血清學(xué)指標(biāo)(1，3)-β-D葡聚糖檢測對PCP診斷具有一定的價值，兩者均為陽性時應(yīng)進一步進行下呼吸道標(biāo)本PCR和傳統(tǒng)細胞學(xué)染色檢查。