模式識(shí)別受體NOD2在髓樣分化蛋白88缺陷小鼠抗分枝桿菌感染中的作用機(jī)制

梁錦屏 ， 陳少紅 ， 張 倩 ， 湯業(yè)珍 ， 韓懷欽 ， 魏 軍

結(jié)核病（Tuberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）感染引起的慢性傳染病。據(jù)世界衛(wèi)生組織最新統(tǒng)計(jì)，全球有17億人感染結(jié)核分枝桿菌，占全世界人口的23%[1]。我國(guó)作為全球30個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，年發(fā)病人數(shù)約為130萬(wàn)，居全球第二位。寧夏作為全國(guó)及西部地區(qū)結(jié)核病高發(fā)重點(diǎn)省區(qū)之一，疫情長(zhǎng)期處于傳染病報(bào)告前列。加之近年來(lái)耐多藥結(jié)核分枝桿菌的流行和廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌/HIV共感染患者持續(xù)增加以及流動(dòng)人口的增多等因素，給公共衛(wèi)生帶來(lái)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。

近年來(lái)隨著天然免疫識(shí)別機(jī)制研究的突破性進(jìn)展，對(duì)結(jié)核分枝桿菌的致病機(jī)制有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。機(jī)體多種細(xì)胞通過(guò)不同的模式識(shí)別受體識(shí)別結(jié)核分枝桿菌的結(jié)構(gòu)成分，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。其中Toll樣受體（TLR）通路中髓樣分化蛋白88（MyD88）依賴途徑，通過(guò)激活MyD88及相應(yīng)的下游效應(yīng)因子活化 NF-κB，啟動(dòng)相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮抗炎作用[2-3]。但目前研究中對(duì)肺組織TLR與NOD2信號(hào)通路的關(guān)系，以及兩條通路在結(jié)核分枝桿菌感染時(shí)，是否存在相互影響、共同調(diào)節(jié)的免疫機(jī)制仍不清。因此本研究以髓樣分化蛋白88缺陷（MyD88-/-）小鼠（C57BL為遺傳背景）感染分枝桿菌為切入點(diǎn)，探討TLR通路中的MyD88依賴途徑受阻時(shí)，肺組織中NOD2信號(hào)在抗分枝桿菌感染中發(fā)揮的作用，為進(jìn)一步闡明NOD2信號(hào)與TLR信號(hào)通路在呼吸道相互作用機(jī)制，揭示結(jié)核分枝桿菌致病機(jī)制、尋求臨床免疫治療或設(shè)計(jì)新型疫苗提供新的思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 MyD88-/-小鼠購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，野生型C57BL/6小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，6～8周齡，18～22 g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心在SPF條件下飼養(yǎng)繁殖，動(dòng)物飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用和管理原則。MyD88-/-小鼠均經(jīng)PCR重復(fù)鑒定無(wú)誤。

1.1.2 試劑 NOD2抗體（ABclonal公司，美國(guó)）、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔 IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）、ECL化學(xué)發(fā)光液（Amersham，美國(guó)）、RNA提取試劑盒（天根生化科技公司）、全蛋白提取試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）、蛋白定量試劑盒（江蘇凱基生物科技發(fā)展有限公司）、PVDF膜（Millipore，美國(guó)）、β-肌動(dòng)蛋白（SANTA CRUZ）、小鼠白介素6（IL-6）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（深圳達(dá)科為生物技術(shù)股份有限公司）、RT-PCR試劑盒（TransGen Biotech），引物由Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組及模型建立 將實(shí)驗(yàn)分為MyD88-/-和野生型C57BL/6兩大組，每大組再各分為分枝桿菌減毒株（卡介苗，BCG）組和磷酸緩沖鹽溶液（PBS）組，共4組，每組小鼠6只。每只小鼠腹腔注射4%水合氯醛進(jìn)行麻醉，5 min后麻醉生效，采用非暴露式氣管滴注方法，BCG組經(jīng)氣管滴注50 μL BCG菌液（1×106cfu/mL），PBS組經(jīng)氣管滴注50 μL無(wú)菌PBS。而后用細(xì)棉線掛住小鼠上齒，將其直立，垂直旋轉(zhuǎn)，使液體在肺內(nèi)均勻分布，建立小鼠肺部感染和對(duì)照模型，24 h后取材。

1.2.2 熒光定量PCR法檢測(cè) 肺組織中NOD2基因表達(dá) NOD2的引物序列：F 5'GCTTCGAGGGAACACATTCT 3'，R 5'CCCTACAGTCCACTCACAAAC 3'。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件 ：42℃孵育 30 min，85℃加熱 5 min反轉(zhuǎn)錄為cDNA。在熒光定量PCR儀上按照熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.2.2 Western Blot法檢測(cè)小鼠肺組織中NOD2的蛋白表達(dá) 按照全蛋白提取試劑盒說(shuō)明提取小鼠肺組織中的全蛋白，并參考BCA 蛋白定量檢測(cè)試劑盒對(duì)其進(jìn)行定量。然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，半干轉(zhuǎn)至PVDF膜，濃度5%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h，加入特異性一抗于4℃過(guò)夜孵育，次日平衡到室溫，PBST漂洗3次后，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗，室溫孵育2 h，PBST漂洗3次后用ECL底物顯色，蛋白成像系統(tǒng)曝光檢測(cè)。

1.2.3 ELISA法檢測(cè)外周血中的IL-6含量 摘眼球取血，靜置2 h，離心后收集血清，每管150 μL分裝保存于-80℃，待測(cè)。按照小鼠IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出IL-6的含 量。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)間比較采用One-Way ANOVA檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織中NOD2基因的表達(dá)

MyD88-/-和野生型小鼠經(jīng)氣管滴入BCG 24 h后，取肺組織提取RNA，利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)兩組NOD2基因的表達(dá)。MyD88-/-小鼠肺組織中NOD2表達(dá)顯著高于野生型小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 MyD88-/-與野生型小鼠肺組織中NOD2基因表達(dá)Figure 1 The expression of NOD2 gene in lung tissues of MyD88-/- mice and wild type mice

2.2 肺組織中NOD2的蛋白表達(dá)

經(jīng)Western Blot對(duì)各組小鼠肺組織中NOD2蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，BCG感染組相比PBS對(duì)照組NOD2蛋白表達(dá)量顯著升高；而MyD88-/-小鼠相比野生型小鼠NOD2蛋白表達(dá)量更高；兩種小鼠中BCG感染組均比PBS對(duì)照組NOD2蛋白表達(dá)量更高。見(jiàn)圖2。

圖2 MyD88-/-與野生型小鼠不同處理后肺組織NOD2蛋白表達(dá)Figure 2 The expression of NOD2 protein in lung tissues of MyD88-/- mice and wild type mice

2.3 外周血IL-6的水平

氣管滴注P B S后，M y D 8 8-/-小鼠I L-6[（69.37±30.63）pg/mL]與野生型小鼠IL-6[（56.21±26.42）pg/mL]水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。BCG感染后，MyD88-/-小鼠IL-6水平顯著增高[（331.84±22.59）pg/mL]，與野生型小鼠[（297.79±49.34）pg/mL]間無(wú)顯著差異，但均比同型小鼠的PBS對(duì)照組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 ELISA法檢測(cè)各組小鼠血清中IL-6含量Figure 3 Serum IL-6 level in MyD88-/- mice and wild type mice determined by ELISA

3 討論

NOD2和TLR作為重要的固有免疫模式受體，是機(jī)體抵御病原微生物入侵的第一道屏障，既是固有免疫的始動(dòng)因素，同時(shí)又是獲得性免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)因素。其中NOD樣受體（nucleotidebinding oligomerization domain-like receptor，NLR）是胞內(nèi)模式識(shí)別受體，最初認(rèn)為NOD2識(shí)別脂多糖 （LPS）可不通過(guò) TLR4受體直接激活 NF-κB 從而介導(dǎo)免疫炎性反應(yīng)?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)NOD2能夠識(shí)別的配體是廣泛存在于革蘭陰性菌、革蘭陽(yáng)性菌細(xì)胞壁中的胞壁酰二肽（muramyl dipeptide，MDP）。NOD2由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，當(dāng)C末端富含亮氨酸重復(fù)序列LRR探測(cè)識(shí)別配體后，會(huì)引起自身構(gòu)象發(fā)生變化，暴露出位于受體分子中央的NOD結(jié)構(gòu)域，觸發(fā)寡聚體化與活化，繼而暴露具有caspase活化募集的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（CARD）——絲氨酸/蘇氨酸激酶RICK（又稱RIP2或RIPK2），活化的受體作用蛋白2（receptor-interacting protein 2，RIP2）介導(dǎo)IKKγ泛素化，誘導(dǎo)NF-κB的轉(zhuǎn)錄。此外NOD2還能活化MAPK激酶通路中的p38與ERK。有研究發(fā)現(xiàn)NOD2-/-小鼠中肺泡巨噬細(xì)胞分泌抗炎因子減少，難以控制胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的增殖，表明NOD2有助于巨噬細(xì)胞控制結(jié)核分枝桿菌的慢性感染。研究顯示，NOD2與TLR在機(jī)體抵抗病原體的反應(yīng)中具有協(xié)同作用[4]。TLR耐受會(huì)增加機(jī)體重復(fù)感染的風(fēng)險(xiǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，在耐受的小鼠巨噬細(xì)胞中，NOD2基因的表達(dá)及活化明顯增加；NOD2基因敲除后，小鼠對(duì)病原菌的易感性明顯增加[5]。而本實(shí)驗(yàn)利用MyD88-/-小鼠建立BCG感染肺部模型，檢測(cè)NOD2基因及蛋白的表達(dá)。結(jié)果提示，小鼠在MyD88依賴途徑功能缺失時(shí)，NOD2信號(hào)可補(bǔ)充發(fā)揮免疫作用。這與Khan等[5]、Krishnaswamy等[6]、Compan等[7]的研究中如果缺乏TLR，細(xì)菌的識(shí)別依靠NOD1和 NOD2相一致。該結(jié)論體現(xiàn)了機(jī)體固有免疫系統(tǒng)中模式識(shí)別受體間的互作調(diào)控作用，即TLR信號(hào)介導(dǎo)的MyD88依賴途徑受阻時(shí)，機(jī)體可利用另一種模式識(shí)別受體NOD2發(fā)揮抗感染免疫。

IL-6是一種重要的參與機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子，參與肺部炎癥的病理發(fā)展過(guò)程，在維持機(jī)體免疫防御與免疫自穩(wěn)中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中BCG感染后，MyD88-/-小鼠與野生型小鼠IL-6水平較PBS組顯著增高，但MyD88-/-小鼠與野生型小鼠IL-6的水平并無(wú)顯著差異。機(jī)體感染分枝桿菌后，可通過(guò)激活其他通路，如TLR介導(dǎo)的MyD88非依賴途徑、NLR、甘露糖受體、C型凝集素受體（C-type lectin receptor）及表面活性物質(zhì)蛋白A受體（surfactant protein A receptors）等，以識(shí)別結(jié)核分枝桿菌的組成成分，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)特異性基因表達(dá)，分泌細(xì)胞因子和趨化因子發(fā)揮作用[8]。這也進(jìn)一步暗示機(jī)體的免疫調(diào)控是復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)體系，各信號(hào)通路之間往往存在相互作用與聯(lián)系。本研究中MyD88-/-小鼠IL-6水平顯著增高，是否有NOD2參與，課題組將后續(xù)利用NOD2-/-小鼠進(jìn)行更深入的研究。