LC-MS/MS法快速篩查辣椒制品中8種禁用蘇丹染料

李貞，陳科

（1.內(nèi)蒙古商貿(mào)職業(yè)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010070；2.廣東省食品檢驗所，廣東廣州510663）

蘇丹染料是一類化工染色劑，主要用于石油、機(jī)油和其他的一些工業(yè)溶劑中，目的是使其增色，也用于油、臘、鞋油和地板等的增光。但蘇丹染料并非食品添加劑，因具有偶氮結(jié)構(gòu)而決定其具有致突變性和致癌性，對肝腎器官具有毒性作用，已被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為三級致癌物[1-3]。歐盟、日本、中國均不容許食品中添加蘇丹染料，但由于用蘇丹染色后的食品顏色非常鮮艷且不易褪色，易引起人們食欲，一些不法企業(yè)把蘇丹染料添加到食品中。為此，有必要建立高靈敏、準(zhǔn)確、快速的篩查蘇丹染料的檢測方法。

目前關(guān)于蘇丹染料的檢測方法主要有液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[4-10]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS）[11]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[12-16]，但HPLC法和LC-MS法對于辣椒制品（辣椒粉、辣椒油、辣椒醬等）復(fù)雜基質(zhì)樣品中蘇丹染料測定缺少二級質(zhì)譜確證，準(zhǔn)確性和靈敏度較差，而LC-MS/MS法具有準(zhǔn)確度和靈敏度高、選擇性強(qiáng)等優(yōu)點，但采用LC-MS/MS法快速篩查辣椒制品中蘇丹染料的報道較少[4，9，11]。本文選擇 8 種蘇丹染料（蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ、蘇丹紅Ⅳ、蘇丹紅7B、蘇丹紅G、蘇丹藍(lán)Ⅱ、蘇丹黃）作為分析對象，辣椒制品經(jīng)正己烷萃取，氧化鋁柱凈化，建立了辣椒制品中8種禁用蘇丹染料的LC-MS/MS快速篩查方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LCMS-8030型液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀、UW6200H電子分析天平：日本島津公司；KQ-250B超聲清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；Milli-Q超純水器：美國Millipore公司；BYDCY-12Y型氮吹儀：上海秉越電子儀器有限公司。

蘇丹染料標(biāo)準(zhǔn)品：蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ、蘇丹紅Ⅳ、蘇丹紅7B、蘇丹紅G、蘇丹藍(lán)Ⅱ、蘇丹黃，純度均≥98%：購自中國計量科學(xué)研究院；正己烷、石油醚、環(huán)己烷、乙酸乙酯、氯仿、丙酮、乙腈、甲醇、乙酸銨（均為色譜純）：購自德國Merck公司；其余試劑均為分析純，購自西隴化工股份有限公司；試驗用水為超純水。辣椒制品（辣椒粉、辣椒油、辣椒醬等）：當(dāng)?shù)爻泻娃r(nóng)貿(mào)市場。

蘇丹染料標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取適量的蘇丹染料標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶液配制成濃度為1 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，4℃以下保存，有效期6個月。

蘇丹染料標(biāo)準(zhǔn)工作液：用乙腈將蘇丹染料標(biāo)準(zhǔn)儲備液逐級稀釋至濃度為 2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0、500.0 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，臨用時配制。

1.2 LC-MS/MS條件

液相色譜條件：色譜柱為XR-ODS（4.6mm×100mm，2.2 μm）；流動相A為乙腈；流動相B為0.1%甲酸水溶液；流速為0.5 mL/min；柱溫為30℃；進(jìn)樣體積為10 μL；流動相梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution process of the mobile phase

質(zhì)譜條件：ESI+電離模式；多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）；加熱模塊溫度為400℃；脫溶（desolvation，DL）管溫度為250℃；干燥氣為氬氣，流速為15 L/h；碰撞氣壓力為230 kPa。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取樣品5 g（精度至0.1 mg）于50 mL離心管中，加入25 mL正己烷，渦旋混勻，超聲萃取10 min，10 000 r/min離心5 min，取上清液；殘渣再加入10 mL正己烷，重復(fù)提取1次，合并上清液，加入5 g無水硫酸鈉脫水，45℃氮吹濃縮至3 mL，經(jīng)中性氧化鋁SPE柱凈化，10 mL正己烷淋洗，5 mL含5%丙酮的正己烷溶液洗脫，氮氣吹干后用乙腈溶解定容至1 mL，供LC-MS/MS測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別對1.0 mg/mL蘇丹染料標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行一級ESI+、ESI-電離模式分析，結(jié)果顯示8種蘇丹染料在ESI+模式下響應(yīng)較好，且均形成[M+H]+離子。在ESI+電離模式下進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，并優(yōu)化質(zhì)譜條件，選取響應(yīng)強(qiáng)度相對最高的離子對作為定量離子對，選擇響應(yīng)強(qiáng)度相對最穩(wěn)定的離子對作為定性離子對，8種蘇丹染料的相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)見表2。

2.2 色譜柱的選擇

分析了ZORBAX SB-C18（4.6 mm×100 mm，5 μm）、ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm×100 mm，5 μm）、XR-ODS（4.6 mm×100 mm，2.2 μm）、CORTECSTM C18（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）不同型號規(guī)格色譜柱對8種蘇丹染料的色譜分離效果。結(jié)果表明，采用ZORBAX SB-C18和CORTECSTM C18色譜柱，部分蘇丹染料色譜峰拖尾嚴(yán)重，而采用ZORBAX Eclipse Plus C18和XR-ODS色譜柱，蘇丹染料色譜峰峰型基本良好，尤其是采用XR-ODS色譜柱，8種蘇丹染料色譜峰峰型對稱、尖銳（圖 1），故選擇 XR-ODS（4.6 mm×100 mm，2.2 μm）作為色譜分析柱。

表2 8種蘇丹染料質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrometry parameters of 8 kinds of Sudan dyes

2.3 流動相的選擇

分析了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、10 mmol/L乙酸銨-甲醇、10 mmol/L乙酸銨-乙腈等不同流動相對蘇丹染料的色譜分離效果。結(jié)果表明：0.1%甲酸加入流動相可有效促進(jìn)蘇丹染料形成[M+H]+峰，提高其質(zhì)譜響應(yīng)，當(dāng)采用乙腈-0.1%甲酸水作為流動相時，各目標(biāo)物色譜響應(yīng)較高，且經(jīng)流動相梯度洗脫后，8種蘇丹染料可有效分離（見圖1）。故選擇乙腈-0.1%甲酸水作為流動相。

圖1 8種蘇丹染料的總離子流色譜圖（50.0 ng/mL）Fig.1 Total ion chromatogram of 8 kinds of Sudan dyes（50.0 ng/mL）

2.4 萃取溶劑的選擇

分析了正己烷、環(huán)己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、氯仿等不同極性溶劑對蘇丹染料的萃取率影響（見圖2）。結(jié)果表明：按照8種蘇丹染料平均萃取率高低順序依次為：正己烷（96.1%）＞環(huán)己烷（91.2%）＞二氯甲烷（87.6%）＞乙酸乙酯（82.9%）＞氯仿（73.6%），其中正己烷對8種蘇丹染料的萃取率在91.6%～101.3%之間，平均萃取率為96.1%，故選擇正己烷作為萃取溶劑。

2.5 固相萃取柱的選擇

圖2 不同提取試劑對8種蘇丹類色素提取效率的影響Fig.2 Effect of different reagents on extraction efficiencies of 8 kinds of Sudan dyes

分析了 C18、C8、CN、NH2、Florisil、Alumina-N、Alumina-A、Alumina-B、MCX、SCX、WCX 等不同填料的固相萃取柱對蘇丹染料的凈化回收率影響。結(jié)果表明：采用Alumina-N固相萃取柱時，8種蘇丹染料的平均凈化回收率最高達(dá)95.3%，這可能是由于Alumina-N固相萃取柱的表面處理呈中性，通過與鋁金屬中心相互作用，與表面硅醇基團(tuán)形成氫鍵或點電荷的表面進(jìn)行離子交換吸附8種蘇丹染料，且對其保留能力較強(qiáng)，從而具有較高的凈化回收率，故選擇Alumina-N作為固相萃取柱。

2.6 基質(zhì)干擾的影響

為避免辣椒制品基質(zhì)對蘇丹染料檢測的干擾，在純乙腈和空白辣椒制品中采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，按照公式基質(zhì)效應(yīng)ME/%=|（B/A-1）|×100（式中：A為純乙腈中目標(biāo)物的質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度；B為空白辣椒制品中目標(biāo)物的質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度）評價LC-MS/MS法測定辣椒制品中蘇丹染料的基質(zhì)效應(yīng)，其中當(dāng)B＞A時，為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；當(dāng)B＜A時，為基質(zhì)減弱效應(yīng)。當(dāng)ME＜10%時，表現(xiàn)為不存在基質(zhì)干擾現(xiàn)象；當(dāng)20%＞ME＞10%時，表現(xiàn)為低程度基質(zhì)干擾現(xiàn)象；當(dāng)50%＞ME＞20%時，表明為中程度基質(zhì)干擾；當(dāng)ME＞50%時，表明為高程度基質(zhì)干擾。結(jié)果顯示：在純乙腈和空白辣椒制品兩種不同基質(zhì)中分別加入100.0、500.0、2.5 ng/mL 3種濃度的8種蘇丹染料標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，經(jīng)本文所建LC-MS/MS法測定辣椒制品中蘇丹染料的基質(zhì)效應(yīng)ME值在3.4%～8.7%之間（見表3），這表明不存在明顯的基質(zhì)干擾效應(yīng)。

2.7 線性范圍、方法檢出限和測定下限

將空白辣椒制品基質(zhì)中依次加入質(zhì)量濃度為2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0、500.0 ng/mL 的 8 種蘇丹染料混合標(biāo)準(zhǔn)液，按本文所建LC-MS/MS法測定，以質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度（y）為縱坐標(biāo)，以蘇丹染料的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見表4）。從表4中可知：8種蘇丹染料在2.5 ng/mL～500.0 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r2≥0.999 5。

表3 蘇丹染料在純乙腈和空白辣椒制品中的基質(zhì)效應(yīng)Table 3 Matrix effect of Sudan dyes in pure acetonitrile and white pepper products

用空白辣椒制品基質(zhì)溶液逐級稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液至儀器所能檢出的最低濃度為方法檢出限（method detection limit，MDL），并以4倍檢出限作為測定下限（見表4）。從表4中可知：8種蘇丹染料的檢出限為0.62 ng/mL～6.25 ng/mL，測定下限為 2.5 ng/mL～25.0 ng/mL。

表4 線性范圍、方法檢出限、測定下限、平均回收率和精密度Table 4 Linear range，method detection limit，lower limit of measurement，average recovery and precision

2.8 回收率和精密度

取空白基質(zhì)辣椒制品，分別添加3個濃度水平，按本文所建LC-MS/MS法測定加標(biāo)回收率和精密度，每個濃度水平重復(fù)測定6次（見表4）。從表4中可知：8種蘇丹染料的平均回收率在92.4%～98.6%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）在 1.7%～3.8%之間，均符合方法學(xué)的要求。

2.9 實際樣品的測定

按本文所建LC-MS/MS法對20份實際辣椒制品（8份辣椒粉、6份辣椒油、6份辣椒醬）進(jìn)行8種禁用蘇丹染料種類和含量的快速篩查。結(jié)果表明：20份受檢辣椒制品中，1份辣椒醬檢出含有禁用蘇丹紅G（含量為325.6 ng/mL），其余19份辣椒制品中未檢出蘇丹染料，這表明市場上所銷的辣椒制品中可能存在非法添加禁用蘇丹染料現(xiàn)象，食品行政監(jiān)管部門應(yīng)對其加強(qiáng)日常監(jiān)督檢驗。

2.10 與現(xiàn)有檢測方法的比較

本文所建LC-MS/MS法與文獻(xiàn)報道的檢測方法相比較（見表5），所用儀器較精密、分析對象的基質(zhì)成分較復(fù)雜、同時檢測的蘇丹染料種類較多、回收率高、檢出限低、精密度好，回收率和RSD均符合國家認(rèn)監(jiān)委要求采用認(rèn)證認(rèn)可行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)RB/T 208-2016《化學(xué)實驗室內(nèi)部質(zhì)量控制比對試驗》的要求。

表5 不同檢測方法的比較Table 5 Comparison of different analysis methods

3 結(jié)論

本研究以蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ、蘇丹紅Ⅳ、蘇丹紅7B、蘇丹紅G、蘇丹藍(lán)Ⅱ、蘇丹黃等為研究對象，采用正己烷萃取辣椒制品，經(jīng)氧化鋁柱凈化，建立了辣椒制品中8種禁用蘇丹染料的法LC-MS/MS法快速篩查方法。結(jié)果表明：8種蘇丹染料在2.5 ng/mL～500.0 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù) r2≥0.999 5；檢出限為 0.62 ng/mL～6.25 ng/mL，測定下限為2.5 ng/mL～25.0 ng/mL；平均回收率在92.4%～98.6%之間，RSD在1.7%～3.8%之間。該LCMS/MS法適用于快速篩查復(fù)雜基質(zhì)辣椒制品中8種禁用蘇丹染料，且具有回收率高、檢出限低、精密度好等優(yōu)點。