不同分子量松花肽增強小鼠免疫力的功能研究

尹利端，王桐，宋文山，劉楚怡，3，*，仲米存，杜芬，李八方，3

（1.煙臺新時代健康產業(yè)有限公司，山東煙臺264006；2.青島海洋生物醫(yī)藥研究院，山東青島266001；3.中國海洋大學，山東青島266073）

松花粉是指經(jīng)人工采集得到的干燥松樹花粉，作為生命的遺傳物質，含有豐富的蛋白質、微量元素、黃酮及必需脂肪酸等營養(yǎng)成分[1]及生物活性物質[2]，具有抗衰老、抗氧化、抗疲勞、促進生長發(fā)育、調整機體代謝等多種功效[3]。目前松花粉水提物的制備技術已相對成熟，并形成了國珍松花粉等一系列在售產品。但在松花粉水提物的制備過程中，卻產生了大量的松花粉粕殘渣，這些殘渣中還存在著大量優(yōu)質的蛋白質資源尚未得到充分利用。一般認為松花粉中蛋白質勝于酪蛋白，且質量高于牛肉、雞蛋蛋白[4]。簡單的丟棄松花粉粕不僅會帶來環(huán)境的壓力，也造成了大量營養(yǎng)物質的浪費。因此，安全高效的從松花粉粕中制備具有生物活性的松花肽，成了亟待解決的問題。目前國內關于從松花粉粕中制備活性松花肽的研究未見報道，利用松花粉粕開發(fā)具有生物活性的松花肽，具有重要的理論意義和應用價值。

生物活性肽就是指一類相對分子質量小于6 kDa，介于氨基酸與蛋白質之間的分子聚合物[5]，具有增強機體防御功能、調節(jié)生命節(jié)律、預防疾病和促進康復等多種生物學功能的多肽[6]。具有增強免疫功能的活性肽稱作免疫活性肽[7]。近年來，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些天然免疫活性膚如胸腺膚等，可誘導淋巴細胞分化、增殖與成熟，增強巨噬細胞的吞噬能力[8]，提高機體對外界病原物質的抵抗能力，提高免疫低下小鼠的免疫活性[9]。部分免疫活性肽已經(jīng)作為一種免疫因子應用于醫(yī)學臨床抗感染、免疫缺乏癥的治療上，并且起到了良好的治療效果[10]。

本研究從松花粉粕中制備1 kDa～3 kDa和小于1 kDa兩種分子量的松花肽，并按照《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》（2003版）[11]要求，對兩種平均分子量松花肽的增強免疫力功能進行了研究。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

松花粉粕：山東煙臺新時代健康產業(yè)有限公司；胰蛋白酶（10 000 U/g）：南寧龐博生物工程有限公司；無水乙醇（分析純）、氫氧化鈉（分析純）、三氯乙酸（分析純）、三氟乙酸（分析純）、硫化鈉（分析純）、乙腈（色譜純）：北京化學試劑公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽 [3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]、牛血清蛋白、維生素B12、谷胱甘肽及膠原蛋白：Sigma公司；Giemsa液：索萊寶公司。

Agilent 1260高效液相色譜儀、Agilent 1100型氨基酸自動分析儀：美國安捷倫公司；MSM2013實驗室用膜分離設備：上海摩速科學器材有限公司；UV-2010PC紫外可見分光光度計：尤尼克（上海）儀器有限公司；Versamax Tunable Microplate Reade光柵式恒溫酶標儀：Versamax Tunable公司；BX43熒光顯微鏡：Olympus公司。

SPF級昆明小鼠：山東朋悅實驗動物繁育有限公司。

1.2 不同分子量松花肽的制備

將松花粉粕粉碎后配成溶液，調節(jié)pH值到12，在水浴中攪拌提取1 h后，4000 r/min轉速下離心20 min，收集上清，調節(jié)pH值至4.5，離心，收集沉淀，加水復溶為2.5%的松花蛋白溶液，加入4 000 U/g胰蛋白酶，在pH8.5，50℃的條件下分別酶解60 min和240 min后，進一步將制備得到的各酶解產物分別利用實驗室用膜分離設備通過管式超濾膜1 kDa～3 kDa和小于1 kDa兩個分子量段超濾，進行樣品的分離制備，并通過高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）驗證其平均分子量，得到1 kDa～3 kDa和＜1 kDa的2組松花肽。

1.3 分子量分布的測定

使用TSK GEL G2000SWXL色譜柱，通過高效液相色譜測定2種松花肽的分子量分布。檢測條件為：以體積比1∶1的乙腈與0.2%三氟乙酸混合溶液為流動相，按0.5 mL/min的流速過柱，紫外檢測波長為225 nm。取牛血清蛋白、維生素B12、谷胱甘肽及膠原蛋白樣品各1 mg，分別溶于1 mL的純水中，用0.45 μm微孔濾膜過濾后進樣。結果通過GPC軟件進行分析。

1.4 氨基酸組成的分析

松花肽的氨基酸組成通過氨基酸自動分析儀進行檢測?？偘被岬慕M成分析：采用OPA柱前衍生反相高效液相色譜法測定。將松花肽置于水解管中，加入6 mol/L的HCl溶液，真空封口，在110℃下水解24 h，OPA柱前衍生（脯氨酸、羥脯氨酸是與氯甲基芴甲酯反應）后注入Agilent 1100型氨基酸自動分析儀測定氨基酸組成。游離氨基酸的組成分析：樣品用等體積三氯乙酸沉淀，經(jīng)過濾、離心后，取上清液注入Agilent 1100型氨基酸自動分析儀測定氨基酸組成。

1.5 動物分組與計量選擇

選用6～8周齡，體重18g～22g的SPF級昆明種雌性小鼠進行試驗。試驗中兩組松花肽各設3個劑量組，試驗樣品的推薦用量為每人每日6.0g，按60kg體重計，相當于0.1g/（d·kg·BW），按人體推薦量的5、10、20倍確定小鼠的低、中、高劑量，即各組小鼠每日劑量分別為0.5、1.0、2.0g/（kg·BW）。以人體推薦量的10倍為中劑量組，另設兩個劑量組，分別為人體推薦劑量的5倍和20倍，另有一個空白對照組，以大豆肽為陽性對照組。即將試驗動物分成8組，每組30只，分別為：陽性對照，1kDa松花肽低劑量，1 kDa松花肽中劑量，1 kDa松花肽高劑量，1 kDa～3kDa松花肽低劑量，1kDa～3kDa松花肽中劑量，1 kDa～3kDa松花肽高劑量和陰性對照。

1.6 刀豆蛋白A（concanavalin，ConA）誘導小鼠脾淋巴細胞轉化試驗

按照《保健食品評價與檢驗技術規(guī)范》中的試驗方法進行試驗，各劑量組動物每組10只，連續(xù)灌胃一個月后頸椎脫臼法處死動物，無菌取脾，置于盛有適量無菌Hanks液的小平皿中，研磨脾臟，制成當個細胞懸液，經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，用Hanks液洗2次，每次1 000 r/min離心10 min后懸浮細胞于RPMI1640完全培養(yǎng)液中，調整細胞濃度為3×106個/mL。將細胞懸液分兩孔，每孔1mL，加入24孔培養(yǎng)板中，再加75 μL ConA 液（100 μg/mL），另一孔作為對照，置 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結束前4 h，每孔輕輕吸去上清液0.7 mL，加入0.7 mL不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，同時加入 50 μLMTT（5 mg/mL），持續(xù)培養(yǎng) 4 h。培養(yǎng)結束后，每孔加入1 mL酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結晶完全溶解。將溶解液移入96孔培養(yǎng)皿中，每孔做3個平行孔，用酶標儀在570 nm測定吸光值。

淋巴細胞增殖能力=加Con A的光密度值-不加Con A的光密度值

1.7 血清溶血素的測定

按照《保健食品評價與檢驗技術規(guī)范》中的試驗方法進行試驗，各劑量組動物每組10只，連續(xù)灌胃一個月后，每鼠腹腔注射20%壓積綿羊紅細胞（sheep red blood cells，SRBC）生理鹽水細胞混懸液 0.2 mL，連續(xù)給藥5 d，于最后一次給藥后1 h，從小鼠眼眶靜脈叢取血，離心分離血清，取血清用生理鹽水稀釋500倍，取稀釋血清1 mL置試管中，加10%SRBC混懸液0.5 mL，置于冰浴中，再加入以生理鹽水1∶10稀釋的豚鼠血清1 mL混合，另設不加血清的空白對照。移置37℃恒溫水浴保溫10 min后，冰浴中終止反應。用2 000 r/min離心10 min后取上清1 mL，加入都氏試劑3 mL，混勻放置10min，取上清液于540 nm測吸光度值。另取10%SRBC混懸液0.25 mL與3.75 mL都氏試劑混合，540 nm測定OD值，作半數(shù)溶血值。

血清溶血素含量以半數(shù)溶血值（HC50）表示。按下式計算：

1.8 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗

八組試驗動物分別連續(xù)灌胃一個月后，每只鼠腹腔注射20%雞紅細胞懸液1 mL，間隔30 min，頸椎脫臼處死動物，將其仰位固定于鼠板上，正中剪開腹壁皮膚，經(jīng)腹腔注入生理鹽水2 mL，轉動鼠板1 min，然后吸出腹腔洗液1 mL，平均分滴于2片載玻上，放入墊有濕沙布的搪瓷盒內，移置37℃孵育30 min后，除去未貼片細胞，晾干，以1∶1（體積比）丙酮甲醇溶液固定，4%（體積分數(shù)）Giemsa液染色3 min，再用蒸餾水漂洗晾干，油鏡下計數(shù)巨噬細胞，按下式計算吞噬百分率和吞噬指數(shù)：

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS軟件進行試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計和方差分析。

2 結果與分析

2.1 兩種松花肽分子量的驗證

HPLC及GPC軟件分析得到松花肽的平均分子量及分子量分布按照試驗條件酶解60 min時，得到的松花肽平均分子量為1 673 Da，能夠較好的滿足1 kDa～3 kDa松花肽的要求，通過超濾得到1 kDa～3 kDa松花肽；當酶解4 h時，平均分子量為784 Da，能夠滿足小于1 kDa松花肽的要求，通過超濾得到小于1 kDa松花肽。松花肽的分子量分布見表1。

表1 松花肽的分子量分布Table 1 Molecular weight distribution of pine pollen peptides

2.2 松花肽的氨基酸組成分析

對兩種松花肽的氨基酸組成進行分析，各氨基酸具體組成含量如表2所示。

表2 松花肽的氨基酸組成表Table 2 Amino acid composition of pine pollen peptides

兩種松花肽必需氨基酸含量分別為55.2%和57.0%。兩種松花肽的必需氨基酸含量均高于聯(lián)合國糧農組織/世界衛(wèi)生組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations/World Health Organization，F(xiàn)AO/WHO）推薦值。并且與FAO/WHO提出的食物中推薦氨基酸需求相比，所有必需氨基酸的含量均高于FAO/WHO要求，可見其能夠成為人類優(yōu)質的蛋白質來源。

2.3 ConA誘導小鼠脾淋巴細胞轉化試驗

通過ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化試驗探討兩種分子量的松花肽對細胞免疫功能的影響。細胞免疫功能中兩個劑量組的結果為陽性，即可判定細胞免疫功能結果陽性。結果如圖1所示。

圖1 兩種松花肽對小鼠細胞免疫活性的影響Fig.1 Effect of two kinds of pine pollen peptides on the cellular immune activity in mice

通過小鼠脾淋巴細胞轉化試驗探討其對細胞免疫功能的影響發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組相比，陽性對照組、1 kDa低劑量組、1 kDa中劑量組、1 kDa～3 kDa中劑量組和1 kDa～3 kDa高劑量組都存在極顯著差異（P＜0.05）。說明在以上4個不同分子量和劑量組的松花肽樣品具有極顯著的增強ConA誘導的淋巴細胞增殖能力。按照小鼠脾淋巴細胞轉化試驗結果統(tǒng)計要求，說明兩種松花肽均具有增強細胞免疫的活性。

2.4 松花肽對小鼠血清溶血素含量影響

松花肽對小鼠血清溶血素的影響反應了松花肽對小鼠體液免疫功能的影響。體液免疫功能中兩個劑量組結果陽性，可判定體液免疫功能結果陽性，結果見圖2。

圖2顯示，與陰性對照相比，除＜1 kDa松花肽高劑量組差異不顯著外，其他試驗組以及陽性對照的半數(shù)溶血值均極顯著增加，說明兩個分子量松花肽均具有增強體液免疫力活性。

2.5 松花肽對小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力的影響

圖2 松花肽對小鼠血清溶血素含量的影響Fig.2 Effect of pine pollen peptides on blood-serum erythrocytolysin in mice

松花肽對小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力體現(xiàn)了松花肽對小鼠的單核-巨噬細胞免疫功能的影響。若其中兩個劑量組結果陽性，可判定單核-巨噬細胞免疫功能結果陽性。對染色的涂片通過顯微鏡逐一計數(shù)巨噬細胞以及吞噬雞紅細胞數(shù)量，結果如圖3所示。

圖3 松花肽對小鼠單核-巨噬細胞免疫功能的影響Fig.3 Effect of pine pollen peptide on mononuclear-macrophage immune function

與陰性對照組相比，陽性對照組、1 kDa松花肽的3個劑量組和1 kDa～3 kDa 3個劑量組都存在極顯著差異（P＜0.05）。按照巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗結果統(tǒng)計要求，說明兩個不同分子量和劑量組的松花肽樣品具有極顯著的增強巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力，即兩種松花肽均具有增強單核-巨噬細胞免疫活性的功能。

綜合以上試驗結果，兩種分子量的松花肽均具有增強細胞免疫功能、體液免疫功能和單核-巨噬細胞功能的作用。按照《保健食品評價與檢驗技術規(guī)范》要求，對增強免疫力的功能判定要求為，在細胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細胞功能、NK細胞活性4個方面任兩個方面結果陽性，可判定該受試樣品具有增強免疫力功能。因此，1kDa松花肽和1kDa～3 kDa松花肽均具有增強免疫力功能。

3 結論

平均分子量在1 kDa～3 kDa和小于1 kDa的兩種分子量的松花肽均具有增強細胞免疫功能、體液免疫功能和單核-巨噬細胞功能的作用，因此，1 kDa松花肽和1 kDa～3 kDa松花肽均具有增強免疫力功能。