葛根醇提物對(duì)糖尿病腎病小鼠腎功能改善的研究

龔頻，田東，王丹妮，楊文娟

（陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西西安710021）

葛根在傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論中常用作生津止渴、解肌退熱藥，《圣惠方》中有記載，“葛粉四兩，先以水浸粟米半升，一夜漉出，拌勻，煮粥食之，可去煩躁消熱渴”，而且葛根分布廣泛、易種植、生物產(chǎn)量高[1]，所以，自古以來葛根都以典型的藥食兩用性豆科植物而存在。葛根的活性成分主要分為葛根黃酮和葛根多糖兩大類，葛根異黃酮不僅具有抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)血糖、延緩衰老、預(yù)防心腦血管疾病等生物活性[2-3]，也有研究表明，葛根素在抗炎、抗痛風(fēng)[4]、抗腫瘤[5]、神經(jīng)保護(hù)[6]、預(yù)防骨質(zhì)疏松[7]等方面展現(xiàn)出很強(qiáng)的藥理活性，而葛根多糖則在清除自由基、提高免疫力以及抑菌等方面表現(xiàn)出較好的生物活性[8]。作為藥食同源性植物，葛根不僅毒副作用小，且具有較高的藥用價(jià)值、廣闊食品前景、豐富生物來源等特點(diǎn)，使其作為特殊性膳食食品開發(fā)具有很大的發(fā)展空間。

糖尿病是一種糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂的慢性疾病，隨著人們飲食結(jié)構(gòu)和生活習(xí)慣不斷改變，加上快節(jié)奏生活所帶來的各方面壓力，導(dǎo)致糖尿病的發(fā)病率逐年上升。糖尿病所引起的機(jī)體代謝活動(dòng)失調(diào)在損傷不同組織細(xì)胞的同時(shí)誘發(fā)多種并發(fā)癥，其中以糖尿病腎病最為常見，其發(fā)病率也逐年升高[5]。糖尿病對(duì)腎功能的損害主要表現(xiàn)在糖脂代謝紊亂導(dǎo)致腎小球血管袢的微血管病變，毛細(xì)血管通透性增強(qiáng)；氧化應(yīng)激損傷正常細(xì)胞，濾過屏障受損；炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管重吸收減弱，致使正常腎功能受損[10]。

本次研究以乙醇提取物的形式結(jié)合葛根黃酮和葛根多糖的多種生物活性，旨在以動(dòng)物實(shí)驗(yàn)構(gòu)建糖尿病腎病小鼠模型后喂食葛根提取物，取樣檢測(cè)并分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，研究葛根醇提物對(duì)糖尿病腎病小鼠的保護(hù)作用，進(jìn)而證明葛根的乙醇提取物在特殊膳食食品添加中的廣闊前景，為開發(fā)具有腎保護(hù)功能的特殊膳食食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

SPF級(jí)雄性昆明小鼠30只，購(gòu)買于西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（許可證號(hào)：SCXK（陜）2017-003）；葛根：西安市同仁堂大藥房；氯化鎘（CdCl2）：分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠；0.9%生理鹽水：河北天城藥業(yè)股份有限公司；肝素鈉：高純，西安熱默爾生物技術(shù)有限公司；甲醛、乙醇：分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；固體石蠟：熔點(diǎn)：52℃～59℃，上海華靈康復(fù)器械廠；蘇木精：高純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；署紅：分析純，天津市博迪化工有限公司；肌酐（creatinine，CRE）試劑盒、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）試劑盒、乙酰氨基葡萄糖苷酶（N-acetylβ-glucosaminidase，NAG）試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.1.2 儀器

羅氏血糖儀、羅氏血糖試紙：活力型，德國(guó)羅氏公司；varioskan flash全波長(zhǎng)多功能掃面讀數(shù)儀：賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 葛根的提取及給藥劑量

本次實(shí)驗(yàn)以60%乙醇為溶液、30℃下超聲提取葛根[11]，然后將所得浸膏的水溶液給予模型鼠給藥。

結(jié)合課題組前期造模經(jīng)驗(yàn)，CdCl2的給藥劑量定為每天1 mg/kg[12]，根據(jù)提取物出膏率結(jié)合2015版《中國(guó)藥典》中葛根的安全用藥范圍，葛根乙醇提取物的給藥劑量確定為每天400 mg/kg。

1.2.2 動(dòng)物分組及模型構(gòu)建

30只雄性小鼠，18 g～22 g，自由飲水進(jìn)食適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，隨機(jī)分為3組，即空白組、模型組和保護(hù)組，每組10只?？瞻捉M10只小鼠普通飼料喂養(yǎng)并且每天注射生理鹽水0.01 mL/g；其余20只小鼠高脂高糖飼料喂養(yǎng)，每天注射CdCl2溶液0.01 mL/g（給藥量1 mg/kg），持續(xù)喂養(yǎng)60 d?？瞻捉M小鼠數(shù)量不變，注射CdCl2的小鼠隨機(jī)分為模型組和給藥組，每組10只[12]。第61天開始，保持之前的飼養(yǎng)方式不變的前提下，空白組和模型組小鼠灌胃生理鹽水0.01 mL/g；按0.01mL/g的給藥體積（給藥量400 mg/kg）灌胃給予保護(hù)組小鼠葛根的60%乙醇提取物的水溶液，繼續(xù)喂養(yǎng)30 d。于第31天下午進(jìn)水禁食，12 h后測(cè)空腹血糖值，并取血清樣品于-80℃保存?zhèn)溆茫∧I臟樣品于福爾馬林溶液（4%甲醛）中保存?zhèn)溆肹13]。

1.2.3 生理指標(biāo)分析

建模期間觀察小鼠的毛色、生活習(xí)性和精神狀態(tài)等體征變化，并每天記錄小鼠的體重差異。建模結(jié)束前一天禁食不禁水12 h后，小鼠斷尾取血測(cè)定空腹血糖值。

1.2.4 生化指標(biāo)檢測(cè)

禁食但進(jìn)水12 h后，注射1%肝素鈉，于眼底動(dòng)脈取血冰浴中靜置5 min，3 000 r/min離心10 min，取血清樣品于-80℃保存?zhèn)溆?。按試劑盒所示方法測(cè)定血清中的肌酐（CRE）、尿素氮（BUN）、乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAG）。

1.2.5 形態(tài)學(xué)分析

解剖小鼠后取出腎臟去掉薄膜并除去腹腔液后稱重，浸泡于福爾馬林溶液中于室溫中保存?zhèn)溆谩９潭ㄒ恢芎笕∩倭拷M織塊乙醇脫水處理后用石蠟包埋，切片5 μm厚度，脫蠟處理后用蘇木精和署紅染液依次染色，并于光學(xué)顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 生理指標(biāo)結(jié)果

不同組小鼠體重、空腹血糖值變化見圖1。

圖1 不同組小鼠體重、空腹血糖值變化圖Fig.1 Changes in body weight and fasting blood glucose levels in different groups of mice

如圖1A所示，與空白組相比，模型組和保護(hù)組小鼠都給予腹腔注射CdCl2，致使飼養(yǎng)的前11周，小鼠體重短暫上升后持續(xù)下降且精神萎靡毛色暗黃，15周后由于持續(xù)損傷導(dǎo)致模型組小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的腹部積水，體重反彈。11周后，保護(hù)組小鼠開始給予灌胃葛根的60%乙醇提取物的水溶液，所以，與模型組相比，保護(hù)組小鼠從12周開始體重慢慢回升。從生長(zhǎng)狀況可以發(fā)現(xiàn)葛根提取物能夠有效緩解CdCl2聯(lián)合高脂高糖飼料對(duì)小鼠造成的機(jī)體損傷，維持其正常的生活狀態(tài)，可能與葛根提取物對(duì)部分臟器形成保護(hù)作用相關(guān)。

如圖1B圖所示，對(duì)小鼠12 h空腹血糖值分析發(fā)現(xiàn)，與空白組的正常小鼠相比，模型組小鼠空腹血糖值上升明顯（P<0.001）。灌胃給予葛根提取物一段時(shí)間后，發(fā)現(xiàn)與模型組相比，給藥保護(hù)組小鼠的空腹血糖值明顯有所下降，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。有研究表明葛根降糖降脂作用可能與其主要活性成分葛根多糖能夠清除體內(nèi)自由基含量，維持機(jī)體氧化應(yīng)激相關(guān)酶系活性正常的活性相關(guān)[14]。也有研究顯示葛根素的降糖活性可能由于其能夠增加G6PD的活性、降低MIN6細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平，起到保護(hù)線粒體、促進(jìn)MIN6細(xì)胞存活的作用[15]。葛根提取物的血糖調(diào)節(jié)作用可能是葛根素、葛根多糖以及葛根總黃酮的有效成分協(xié)同調(diào)節(jié)的結(jié)果，較好的發(fā)揮多組分少劑量聯(lián)合作用的優(yōu)勢(shì)，這樣也可以避免單一組分因劑量問題引發(fā)的毒副作用，而更好的發(fā)揮其生物活性。

2.2 生活指標(biāo)結(jié)果

不同組小鼠CRE、BUN和NAG含量見圖2。

圖2 不同組小鼠CRE、BUN和NAG含量Fig.2 CRE，BUN and NAG content in different groups of mice

如圖2A所示，對(duì)腎功能評(píng)價(jià)指標(biāo)考察分析，發(fā)現(xiàn)模型組與空白組相比，模型組小鼠血清中肌酐含量明顯較高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。但與模型組相比，保護(hù)組小鼠肌酐含量顯著降低（P＜0.001）。如2B圖，分析尿素氮（BUN）數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，與空白組小鼠相比，模型組小鼠血清中尿素氮（BUN）含量明顯升高（P＜0.001）；但保護(hù)組在灌胃一段時(shí)間葛根提取物后，與模型組小鼠相比，血清中尿素氮（BUN）含量則明顯降低，接近空白組小鼠（P＜0.01）。如圖2C顯示，模型組與空白組相比，小鼠血清中乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAG）活性明顯上升，且數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；但相比模型組，保護(hù)藥組小鼠血清中乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAG）活性則有所降低，數(shù)據(jù)也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

相關(guān)研究表明，TGFβ-Smad信號(hào)通路異常是引發(fā)糖尿病諸多并發(fā)癥及腎功能損傷形成的關(guān)鍵因素，而葛根異黃酮可以通過調(diào)節(jié)糖尿病腎病患者的細(xì)胞內(nèi)TGFβ-Smad通路，防止血液流變學(xué)異常，發(fā)揮維持腎功能正常的效果[16]。也有研究發(fā)現(xiàn)，葛根對(duì)腎臟的保護(hù)作用與其主要活性成分葛根素減弱SIRT1-FOXO1通路、下調(diào)相關(guān)活性蛋白密切相關(guān)[17]。

2.3 形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

光鏡下小鼠腎臟組織切片見圖3。

圖3 光鏡下小鼠腎臟組織切片圖（HE×400）Fig.3 Photomicrograph of mice kidney tissue under light microscope（HE×400）

腎臟組織的HE染色切片圖在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察，可以清楚地看到空白組小鼠腎組織結(jié)構(gòu)正常，腎小球的球形結(jié)構(gòu)飽滿，細(xì)胞核分布均勻，排列整齊，未見病理改變；模型組小鼠，腎臟組織結(jié)構(gòu)排列混亂，腎小球皺縮，細(xì)胞核重疊，基本的球形結(jié)構(gòu)消失，腎間質(zhì)水腫明顯，并伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，出現(xiàn)明顯的病變特征；與模型組相比，保護(hù)組小鼠腎臟上述病變情況有所減輕，整體排列整齊，可見腎小球球形結(jié)構(gòu)完整，腎間質(zhì)可見輕微水腫和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)糖尿病腎病小鼠灌胃一定量葛根提取物后，受試小鼠體重、血糖等生理指標(biāo)得到明顯改觀，腎功能評(píng)價(jià)指標(biāo)CRE、BUN、NAG等也較正常小鼠有所變化。表明適量的葛根提取物可以緩解糖尿病腎病小鼠的病情惡化，能夠有效減緩糖尿病腎病早期時(shí)氧化應(yīng)激、微血管病變等多種因素對(duì)腎功能的損害，為適用于糖尿病腎功能障礙群體的特殊膳食食品的開發(fā)提供可選的理論依據(jù)。