芹黃素對氧化應激誘導的HaCat細胞XBP1表達的影響

張德利 ，刁慶春 ，涂彩霞 ，林茂

（1.西南醫(yī)科大學，四川瀘州646000；2.重慶市中醫(yī)院，重慶400011；3.大連醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院，遼寧大連116027）

白癜風是一種常見的獲得性的色素脫失性皮膚病，發(fā)病機制不清，治療困難。近年來，有學者提出白癜風的綜合發(fā)病機制學說：在遺傳學背景基礎上，氧化應激造成局部黑素細胞損傷及凋亡，誘導自身免疫反應攻擊更多的黑素細胞，造成進行性的皮膚色素脫失[1]，但氧化應激如何啟動自身免疫反應尚不清楚。

遺傳學研究顯示，白癜風X-box結合蛋白1（X-box binding protein 1，XBP1）啟動子區(qū)域的遺傳變異與白癜風發(fā)病密切相關，且皮損中XBP1表達明顯增加[2]。XBP1是一種多功能核轉錄因子，被剪切后的XBP1（XBP1s）可調節(jié)多種下游基因轉錄，可能促進黑素細胞黑素小體自噬，釋放自身抗原[3]；促進B細胞活化[4]，分泌針對黑素細胞的自身抗體；促進樹枝狀細胞傳遞自身抗原[5]，激活CD8+T細胞攻擊黑素細胞，從而引發(fā)自身免疫反應，破壞黑素細胞，因此可能是氧化應激引起的白癜風自身免疫反應中的關鍵因素。

黃酮類化合物在多種細胞系中具有強大的抗氧化生物學效應[6]。芹黃素屬于黃酮類化合物，廣泛存在于芹菜、大蒜、蘋果等蔬菜水果，及地錢、西藏雪蓮花等中草藥中[7]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，芹黃素可通過抑制ROS產生，減少氧化應激引起的黑素細胞凋亡[8]。但芹黃素可否可抑制氧化應激引起的XBP1表達升高，從而抑制其自身免疫激活，目前尚未見報道。因此，本文擬通過建立體外過氧化氫誘導的角質形成細胞氧化應激模型，檢測芹黃素對氧化應激誘導的XBP1表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

1.1.1 材料

1.1.1.1 細胞 人永生化HaCat細胞株購自上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.1.1.2 主要試劑 芹黃素（Apigenin，Sigma，美國）、30%過氧化氫（H2O2，Sigma，美國）、N－乙酰半胱氨酸（Acetylcysteine，NAC，Sigma，美國）、胰蛋白酶（Gibico，美國）、乙二胺四乙酸（EDTA，Sigma，美國）、二甲基亞砜（DMSO）、四甲基偶氮唑藍（MTT，Sigma，美國）、2'，7'-二氯氫化熒光素探針（DCFDA，Sigma，美國）。RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒（Takara，日本）。PCR引物由Takara公司大連分公司合成。

1.1.2 儀器 自動酶標儀（Thermo，芬蘭）、流式細胞儀（Becton Dickinson，美國）、7500型實時定量PCR檢測儀（ABI，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) HaCat細胞株常規(guī)方法復蘇后，用含10%胎牛血清DMEM低糖培養(yǎng)基，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)（37℃，相對濕度95%），2～3 d傳代1次，取對數(shù)生長期細胞制成5×104/mL單細胞懸液，接種于96孔板或6孔板后繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 細胞活力測定 不同濃度的芹黃素作用于HaCat細胞12 h后，采用四甲基偶氮唑蘭比色法（MTT法）。96孔板每孔加5 g/L MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上清，每孔加100 μL DMSO，低速震蕩5 min，酶標儀測定吸光度值，測定波長490 nm。

1.2.3 活性氧含量檢測 采用DCF-DA法[9]。培養(yǎng)的HaCat細胞加入25 μmol/L芹黃素或10 mmol/L的NAC（陽性對照）預處理1 h，再加入500 μmol/L的H2O2作用12 h，空白對照組及陰性對照組處理同上。培養(yǎng)細胞加入10 μmol/L DCF-DA，37℃孵箱中孵育30 min，消化收集細胞，用預冷的PBS洗3次，流式細胞儀檢測熒光強度，檢測波長488/525 nm。

1.2.4 實時定量PCR檢測 細胞經0.25%胰蛋白酶消化、離心，收集細胞，利用TaKaRa細胞總RNA抽提試劑盒提取各組細胞總RNA，采用TaKaRa反轉錄試劑盒按照說明書以RNA為模板反轉錄為cDNA，采用熒光定量PCR試劑盒按照說明書以cDNA為模板進行PCR反應，然后使用ABI 7500 PCR儀進行熒光PCR。引物序列見表1。實時定量PCR反應條件：94℃預變性3 min，擴增40個循環(huán)，每循環(huán)中，94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸45 s，采集熒光信號；40循環(huán)結束后，經94℃30 s、57℃30 s、72℃45 s，采集熔解曲線。使用7500型Real-time PCR儀分析軟件進行數(shù)據(jù)分析。以GAPDH為內參基因，計算同一樣本中目的基因與內參基因的含量比值，評價目的基因的表達水平。每個樣本取3個復孔，PCR重復3次。

表1 引物序列

2 結果

2.1 芹黃素對HaCat細胞活力的影響 芹黃素濃度≤25 μmol/L時，對HaCat細胞活力無明顯影響，無細胞毒性（P＞0.05），見圖 1。

圖1 芹黃素對HaCat細胞活力的影響

2.2 芹黃素抑制過氧化氫引起的HaCat細胞ROS含量升高 500 μmol/L的過氧化氫可顯著誘導Ha－Cat細胞 ROS 含量升高（P＜0.01）；10 μmol/L 及 25 μmol/L的芹黃素可顯著抑制過氧化氫引起的HaCat細胞ROS含量升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖2。

圖2 芹黃素對H2O2引起的HaCat細胞ROS含量升高的影響

2.3 芹黃素抑制過氧化氫引起的HaCat細胞的XBP1s mRNA表達升高 500 μmol/L的過氧化氫可顯著誘導HaCat細胞XBP1s mRNA表達（P＜0.01）；10 μmol/L及25 μmol/L的芹黃素可顯著抑制過氧化氫引起的HaCat細胞XBP1s mRNA表達升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），見圖3。而過氧化氫或芹黃素對Hacat細胞未剪切的XBP1（XBP1u）的mRNA水平無明顯影響，見圖4。

圖3 芹黃素對H2O2引起的HaCat細胞XBP1s mRNA表達升高的影響

圖4 芹黃素對H2O2引起的HaCat細胞XBP1u mRNA表達升高的影響

3 討論

在白癜風的發(fā)病機制研究中，近年來發(fā)現(xiàn)XBP1可能在氧化應激誘導自身免疫的過程中起重要作用。XBP1是未折疊蛋白應答（Unfolded protein response，UPR）信號通路中的標志性信號之一。氧化應激可引起內質網(wǎng)應激（Endoplasmic reticulum stress，ER stress），激活 UPR，使得 XBP1 mRNA 發(fā)生剪切，剪切后的XBP1即XBP1s，轉移到細胞核，調節(jié)多種自身免疫相關的基因表達[9]。最近的研究發(fā)現(xiàn)XBP1活化可促進角質形成細胞分泌趨化因子CXCL 16，誘導CD8+T淋巴細胞趨化；還可促進黑素細胞產生IL-6、8[10]，可促進B細胞分化為漿細胞分泌抗體[4]，可維持樹枝狀細胞存活和功能[5]；還可調節(jié)細胞自噬[3]。因此，對XBP1的調控可能有助于阻斷白癜風氧化應激誘導的自身免疫反應，成為重要的治療靶點。在本研究中，筆者根據(jù)前期文獻報道[11]，選用500 μmol/L的過氧化氫誘導角質形成細胞氧化應激，并證實其可明顯增加XBP1s的表達，可用于抗氧化藥物的檢測。

芹黃素是黃酮類化合物，具有明顯的體內及體外抗氧化作用[7]，筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，芹黃素可通過抑制ROS產生，減少氧化應激引起的黑素細胞凋亡[8]；但其是否對角質形成細胞的氧化應激具有拮抗作用，是否對XBP1的表達具有調控作用尚未見報道。本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)芹黃素濃度小于或等于25 μmol/L時，對HaCat細胞活力無明顯影響。10 μmol/L及25 μmol/L的芹黃素可顯著抑制過氧化氫引起的HaCat細胞ROS含量升高，顯著抑制過氧化氫引起的HaCat細胞XBP1s mRNA表達升高，而對未剪切的XBP1（XBP1u）的mRNA水平無明顯影響。這些結果說明，芹黃素可能通過抑制XBP1s表達，對白癜風氧化應激誘導的自身免疫具有一定的拮抗作用。

綜上所述，芹黃素可能通過抗氧化，對過氧化氫引起的XBP1s表達升高具有抑制作用，因而可能具有開發(fā)成為治療白癜風的新藥的前景。