丹皮酚通過抑制樹突狀細(xì)胞活性在咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病皮膚病中的作用研究

丁文，杜恭韶，萬永山，李玉萍

（安陽市人民醫(yī)院，河南安陽 455000）

銀屑病近年在我國患病率逐步攀升，臨床以局部皮膚鱗屑、浸潤、紅斑為主要癥狀的自身免疫性疾病[1]。藥物對皮損的治療主要通過改善皮損積分，作用皮損細(xì)胞和組織的生長等發(fā)揮作用。丹皮酚（Paeonol）是中藥材丹皮中提取出來的小分子化合物，也是丹皮發(fā)揮抗炎作用的有效成分[2]。本研究通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和骨髓細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，旨在探討丹皮酚對DCs抑制作用，綜合評價(jià)丹皮酚對銀屑病的治療前景。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8～10周齡BALB/c雄性小鼠由山東魯抗藥品公司提供，體質(zhì)量（20±2）g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證編號：SCXK（京）2016-0013。將實(shí)驗(yàn)用鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法平均分為6組，分別為空白對照組（Con）、模型組（Model組/IMQ 組）、甲氨蝶呤組（MTX組）及丹皮酚高（PG-H）、中（PG-M）、低（PGL）劑量組，以上每組10只，均飼養(yǎng)于SPF級動(dòng)物室。

1.2 藥品與試劑 丹皮酚(國家研究院食品藥品檢驗(yàn)所，中國，北京）；咪喹莫特乳膏（四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司產(chǎn)品，批號：101112）；凡士林（河北蘭煉飛天石化有限公司產(chǎn)品，批號：Z31200147）；DAB顯色液（中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；CD3單克隆抗體（Abcam公司，英國）；CD11c單克隆抗體（Abcam公司，英國），CD11c-PE單克隆抗體（eBioscience公司，中國，上海）；抗鼠白細(xì)胞介素（IL）-23（Santa Cruz公司，美國）；CCK-8試劑盒（日本同仁化學(xué)）。

1.3 BMDCs骨髓細(xì)胞分離及體外誘導(dǎo)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)[3-5]采用BMDCs細(xì)胞株（上海賽百慷生物技術(shù)股份有限公司）。體外誘導(dǎo)培養(yǎng)10周齡BALB/c小鼠的股骨和脛骨骨髓細(xì)胞。BMDCs骨髓細(xì)胞體外培養(yǎng)應(yīng)用含有10%（體積分?jǐn)?shù)）胎牛血清（Gibco Life技術(shù)，格林德艾蘭，NY，美國）、1%青霉素、1%鏈霉素、20 g/L的IL-4和20 μg/L的GM-CSF的培養(yǎng)液，置于37℃、5%（體積分?jǐn)?shù)）CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d誘導(dǎo)DCS和補(bǔ)充介質(zhì)，定期換液及觀察細(xì)胞形態(tài)，選取細(xì)胞備用。

1.4 動(dòng)物造模、給藥及取材

1.4.1 動(dòng)物處理 在實(shí)驗(yàn)前對本次實(shí)驗(yàn)用的所有小鼠，戊巴比妥鈉麻醉并除去背部同1個(gè)部位約2 cm2面積的毛發(fā)，備皮后單籠飼養(yǎng)。

1.4.2 分組動(dòng)物實(shí)驗(yàn) ①空白對照組：小鼠背部裸露處每日涂抹適量凡士林，予生理鹽水0.4 mL/次，1次/d；②模型組：銀屑病小鼠模型是選擇實(shí)驗(yàn)小鼠參照文獻(xiàn)[6-7]建立IMQ誘導(dǎo)的銀屑病模型，于背部裸露處每日涂抹約420 ng體積分?jǐn)?shù)4%的IMG，模型組小鼠給藥按照生理鹽水注射1次/d，0.4 mL/次；③甲氨蝶呤組，在動(dòng)物模型制作成功的基礎(chǔ)上予MTX 1 mg/kg,1次/d；④丹皮酚高、中、低劑量組小鼠在動(dòng)物模型制作成功的基礎(chǔ)上分別予100 mg/（kg·d）、50 mg/（kg·d）、25 mg/（kg·d）的丹皮酚灌胃[8]。給藥連續(xù)7 d，第8天取材，第14天后，斷頸處死，在戊巴比妥鈉麻醉下采集皮膚病變和血清標(biāo)本。

1.5 檢測和實(shí)驗(yàn)

1.5.1 皮損組織IL-23、CD11c+及CD3+檢測[9]采用免疫組織化學(xué)法（IHC）對小鼠皮損組織石蠟切片進(jìn)行CD3染色，觀察CD3+表達(dá)情況。采用OCT包埋做冰凍切片，經(jīng)丙酮固定、抗體孵育、DAB顯色，觀察CD11c+的表達(dá)情況。依照TRIzoI試劑要求提取組織mRNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測IL-23水平。

1.5.2 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)[4]通過酶聯(lián)免疫法對DCs細(xì)胞 IL-23、IL-1β、IL-12p40 mRNA 進(jìn)行檢測，收集各組細(xì)胞，按TRIzoI試劑說明書提取細(xì)胞mRNA，采用RT-PCR法檢測。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 6及SPSS 17.0版本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，2組間對比采用t檢驗(yàn)，多組間對比采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠皮損炎性細(xì)胞浸潤檢測結(jié)果 通過對小鼠皮損中IL-23、CD11c+及CD3+表達(dá)水平進(jìn)行檢測。CD3表達(dá)水平中，較Con組，IMQ組小鼠真皮層褐色沉淀顆粒CD3+明顯增多（P＜0.01），與IMQ組相比，各治療組小鼠皮損真皮層中CD3陽性細(xì)胞的浸潤數(shù)量均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與MTX組相比，丹皮酚3個(gè)劑量組小鼠皮損中CD3陽性細(xì)胞數(shù)量接近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明PH劑量各組CD3+表達(dá)水平相似，且與MTX組表達(dá)水平相似，見圖1。

CDllc+細(xì)胞浸潤情況，與IMQ組相比，各治療組小鼠皮損中CD11c+細(xì)胞浸潤數(shù)量明顯下降（P＜0.05）：①Con組vs.IMQ組，=10.1516，=0.0000；②MTX組vs.IMQ 組，=3.7144，=0.0002；③PL組vs.IMQ組，=2.5677，=0.0258；④PM 組vs.IMQ 組，=3.9844，=0.0009；⑤PH組vs.IMQ組，=5.933 9，=0.000 0；與MTX組相比，PM組小鼠皮損中CD11c+細(xì)胞數(shù)量與MTX組相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），=0.110 5，=0.913 2；而PH組與MTX組對比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），=2.2225，=0.0393；提示PH組降低小鼠真皮中CD11c+的作用明顯優(yōu)于PM組，見圖2。IL-23細(xì)胞因子表達(dá)水平方面，與CD11c+存在一致性，提示PH組降低小鼠真皮中IL-23作用最優(yōu)（P<0.05）。見表1。

表1 各組小鼠皮損中IL-23、CD11c+及CD3+表達(dá)結(jié)果

2.2 丹皮酚體外BMDCs細(xì)胞IL-23、IL-1β、IL-12 p40mRNA表達(dá)的影響 統(tǒng)計(jì)結(jié)果所示，IL-23、IL-1β、IL-12p40 mRNA表達(dá)明顯增加，加入丹皮酚后，直接作用BMDCs細(xì)胞，IL-23 mRNA表達(dá)均明顯降低（P＜0．05），而對 IL-1β、IL-12p40 mRNA 的影響無差異（P>0.05）。丹皮酚加入濃度間差異對IL-23 mRNA 表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），說明丹皮酚作用于BMDCs細(xì)胞可抑制細(xì)胞IL-23 mRNA的表達(dá)。見圖3。

3 討論

銀屑病近年在我國患病率逐步攀升，究其根本是一種自身免疫性疾病[10]。近幾年的學(xué)術(shù)研究指出，樹突狀細(xì)胞（DCs）的異常活化與這一自身病理免疫反應(yīng)最為相關(guān)。DCs作為體內(nèi)監(jiān)視細(xì)胞，通過分泌多種免疫因子啟動(dòng)并調(diào)節(jié)機(jī)體先天固有或后天獲得性的免疫應(yīng)答，其在真皮層很可能負(fù)責(zé)炎癥浸潤與銀屑病的發(fā)生[11]。

丹皮作為涼血熱之要藥[12]，其干燥根皮中提取出來的小分子化合物丹皮酚是丹皮發(fā)揮抗炎作用的有效成分。但鑒于丹皮酚對銀屑病治療療效臨床和科研類型研究報(bào)告均存在空白，故本實(shí)驗(yàn)旨在探究丹皮酚對銀屑病的治療，為進(jìn)一步的研究提供參考。

圖1 小鼠皮損樣本免疫組化中CD3+的表達(dá)水平

圖2 小鼠皮損樣本免疫組化中CD11c+的表達(dá)水平

圖3 BMDCs細(xì)胞IL-23、IL-1β、IL-12p40 mRNA檢測結(jié)果

研究結(jié)果表明，皮損組織CD3+表達(dá)水平方面，丹皮酚各劑量之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與MTX組效果一致。皮損組織IL-23表達(dá)水平方面，高劑量效果最顯著（P<0.05）。體外實(shí)驗(yàn)中，丹皮酚直接作用于 BMDCs，IL-23 mRNA 表達(dá)明顯降低（P＜0．05），而對IL-1β、IL-12p40 mRNA的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。本次研究中，丹皮酚可有效減輕咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病局部皮損，作用機(jī)制可通過減弱IL-23 mRNA表達(dá)，抑制了樹突細(xì)胞的成熟和活化，最終減輕了銀屑病的皮膚損傷。這與相關(guān)研究結(jié)論存在一致性[9]，銀屑病患者局部皮損及外周血中IL-23含量較高，臨床針對IL-23采取的單抗治療也有顯著療效，丹皮酚的此次研究可為銀屑病的治療靶點(diǎn)明確提供了新研究方向。但本次研究涉及到的細(xì)胞免疫因子較少，未涉及細(xì)胞傳導(dǎo)通路的研究，存在局限性，仍需進(jìn)一步深入研究。