紫草素通過PI3K/Akt通路抑制氧糖剝奪誘導(dǎo)的大鼠原代皮層神經(jīng)元凋亡*

陳夢月， 陳偉東， 柳怡敏， 向思程， 殷慧玲， 張志鋒

(湖北醫(yī)藥學(xué)院 1第一臨床學(xué)院， 2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室， 湖北 十堰 442000)

缺血性腦卒中是一種由腦部血液循環(huán)障礙引起的以局部神經(jīng)功能缺失為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)疾病，死亡率和致殘率很高，涉及的主要病理生理學(xué)發(fā)病機(jī)制包括自由基損傷、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)以及免疫反應(yīng)等[1-2]。由于其發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，臨床上尚無有效的治療措施，積極研究我國中草藥資源在缺血性腦卒中中的作用具有重要的意義。紫草素(shikonin)是一種中草藥提取物，進(jìn)入機(jī)體后可通過清除氧自由基來發(fā)揮抗感染和抗炎作用[3-4]，研究表明，shikonin通過抗凋亡途徑可抑制6-羥多巴胺介導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞神經(jīng)毒性作用[5]。本項(xiàng)工作探討shikonin對氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation,OGD)損傷模型大鼠原代皮層神經(jīng)元的作用效果及機(jī)制，以進(jìn)一步闡明紫草素的神經(jīng)保護(hù)作用。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級孕17 d的SD大鼠，由湖北醫(yī)藥學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供。

2 主要試劑

Shikonin購自Sigma-Aldrich；LY294002購自Cell Signaling Technology；p-Akt (Ser473)和t-Akt抗體購自Santa Cruz。

3 主要方法

3.1原代大鼠皮層神經(jīng)元培養(yǎng)及分組處理 用含4%異氟烷的70%N2O和30%O2混合氣體麻醉孕17 d SD大鼠，后頸椎脫臼處死，70%乙醇對皮膚進(jìn)行消毒，切開腹部皮膚并暴露子宮，取出所有胎鼠，移入含冰凍分離液的培養(yǎng)皿中。快速剪取胎鼠頭部，去除腦膜，清洗并分離皮層組織，將皮層組織移入另一含冰凍分離液的培養(yǎng)皿中。剪碎皮層腦組織，將組織混懸液自培養(yǎng)皿中吸出，移至15 mL離心管中，靜置30 s，使組織從混懸液中沉淀，將上層分離液棄掉。用原代神經(jīng)元培養(yǎng)液(含Neurobasal培養(yǎng)液、2% B-27補(bǔ)充物、0.5% FBS、0.5 mmol/L L-谷氨酰胺和25 mmol/L谷氨酸)重懸組織細(xì)胞，用巴氏吸管輕輕吹打培養(yǎng)液20～30次，靜置30 s，用巴氏吸管吸取上層細(xì)胞渾濁液，用尼龍濾網(wǎng)過濾混濁液，得到大腦皮層單細(xì)胞懸液。最后將神經(jīng)元移入已包被過的培養(yǎng)皿中置細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。每隔3 d全量換無 FBS 神經(jīng)元培養(yǎng)液一次，培養(yǎng)至12 d可用于其它實(shí)驗(yàn)。

為了確定最適shikonin濃度，將神經(jīng)元分別用濃度為0、0.02、0.2、2和20 μmol/L的shikonin提前1 h預(yù)處理神經(jīng)元，然后OGD處理1.5 h，再轉(zhuǎn)至正常培養(yǎng)液中復(fù)氧條件下培養(yǎng)24 h，然后再次確定shikonin是否有保護(hù)作用。

為了研究shikonin的作用機(jī)制，先用LY294002(1 μmol/L)提前處理神經(jīng)元30 min，然后加入shikonin(2 μmol/L)處理1 h，最后再進(jìn)行同上所述的OGD及復(fù)氧損傷處理。實(shí)驗(yàn)分為4組：對照(control)組；OGD+vehicle組；OGD+shikonin(2 μmol/L) 組；OGD+shikonin(2 μmol/L)+LY294002(1 μmol/L)組。

3.2OGD損傷模型制備 將神經(jīng)元維持培養(yǎng)液置換成無糖細(xì)胞外液(mmol/L: 116 NaCl, 5.4 KCl, 0.8 MgSO4, 1.0 NaH2PO4, 1.8 CaCl2, 26 NaHCO3)，將神經(jīng)元置于三氣培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)1.5 h，用正常細(xì)胞外液漂洗3次，每次10 min,然后換成新的神經(jīng)元維持培養(yǎng)液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

3.3乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)釋放測定 乳酸脫氫酶是由具有完整質(zhì)膜的活細(xì)胞所保留的細(xì)胞質(zhì)酶，當(dāng)細(xì)胞膜受損時會從細(xì)胞中釋放，細(xì)胞損傷越厲害其釋放越多。將細(xì)胞以1×108/L的密度接種到96孔板中，每孔100 μL 細(xì)胞懸液，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)，具體步驟參照CytoTox? 96非放射性細(xì)胞毒性檢測試劑盒(Promega)說明書所述， 該LDH試劑盒包裝包含5種主要試劑：檢測緩沖液、底物、裂解液(10×)、LDH陽性對照及反應(yīng)終止液。所有實(shí)驗(yàn)組均做5個復(fù)孔。除樣本組外，還有4個對照組：A:培養(yǎng)液背景組；B:培養(yǎng)液+裂解液(10 μL)組(體積校正)；C:正常細(xì)胞組；D:正常細(xì)胞+裂解液組。各組實(shí)驗(yàn)數(shù)值為490 nm處吸光度(A)值。細(xì)胞死亡率(%)=(實(shí)驗(yàn)孔A值-細(xì)胞自發(fā)A值)/(最大裂解A值-細(xì)胞自發(fā)A值)×100%，其中細(xì)胞自發(fā)LDH值=C-A，最大裂解LDH值=D-B。

3.4蛋白提取及Western blot實(shí)驗(yàn) 收集經(jīng)各組藥物處理24 h后的神經(jīng)元，加RIPA裂解液冰上裂解15 min；于4 ℃、16 100×g離心15 min，取上清液； 加5×sample buffer，于100 ℃煮10 min；冷卻后，用BCA法測所提各組蛋白液濃度；上樣等量各組蛋白液(10 μg)，經(jīng)SDS-PAGE分離，用PVDF 膜轉(zhuǎn)膜，用5% 脫脂奶粉封閉1 h，孵I抗(p-Akt和t-Akt, 1 ∶1 000)， 4 ℃ 過夜，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的II抗室溫孵育2 h，用ECL 發(fā)光試劑盒顯影檢測蛋白。

3.5熒光素二乙酸酯/碘化丙啶(fluorescein diacetate/propidium iodide, FDA/PI)染色 采用改進(jìn)型FDA和PI雙染法檢測神經(jīng)元存活情況。紅色熒光代表PI染色細(xì)胞，為凋亡細(xì)胞，綠色熒光代表FDA所染細(xì)胞，代表存活細(xì)胞。用細(xì)胞外液清洗2次，與FDA(5 μmol/L)和PI(2 μmol/L)共孵育30 min。用細(xì)胞外液清洗2次，快速在Olympus IX51型熒光顯微鏡下觀察。 通過計(jì)算PI標(biāo)記的凋亡神經(jīng)元數(shù)量與FDA標(biāo)記的存活神經(jīng)元數(shù)量之間的比值來確定神經(jīng)元死亡情況。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 LDH法檢測shikonin對OGD損傷神經(jīng)元活性的影響

與OGD+vehicle組相比，隨著shikonin濃度增加(從0.2 μmol/L開始)，OGD+shikonin組神經(jīng)元LDH釋放率減少，即神經(jīng)元存活率升高，并呈濃度依賴關(guān)系(P<0.05)，且shikonin濃度達(dá)2 μmol/L時LDH釋放量已減少到最佳效果，因此，選擇2 μmol/L作為shikonin的最適濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見圖1。

2 FDA/PI雙染檢測shikonin對OGD損傷神經(jīng)元凋亡的影響

與OGD+vehicle組相比，隨著shikonin濃度增加(從0.2 μmol/L開始)，OGD+shikonin組PI染色神經(jīng)元與FDA染色神經(jīng)元的比值顯著減小(P<0.05),見圖2。

Figure 1.Shikonin (0.2～20 μmol/L) decreased LDH release during OGD-induced neuronal death. Mean±SEM.n=5.*P<0.05vsOGD+vehicle group.

圖1Shikonin減少神經(jīng)元LDH的釋放

Figure 2.Shikonin decreased the apoptosis of OGD-injured neurons. The red fluorescence represents the apoptotic neurons stained by PI, and green fluorescence represents the surviving neurons stained by FDA. Scale bar=40 μm. Mean±SEM.n=5.*P<0.05vsOGD+vehicle group.

圖2Shikonin減少OGD損傷的神經(jīng)元凋亡

3 Western blot法檢測shikonin對OGD損傷神經(jīng)元p-Akt(Ser473)水平的影響

與shikonin+vehicle組相比，shikonin濃度達(dá)0.2 μmol/L以上可顯著提高神經(jīng)元的p-Akt(Ser473)水平(P<0.05)，見圖3。若提前用LY294002(1 μmol/L)阻斷PI3K后，用Western blot檢測此時shikonin(2 μmol/L)對神經(jīng)元p-Akt(Ser473)水平的影響,結(jié)果顯示，與OGD+shikonin組相比，OGD+shikonin+LY294002可顯著抑制p-Akt(Ser473)水平(P<0.05)，見圖4。

Figure 3.OGD-induced decrease in p-Akt was reduced by shikonin.Mean±SEM.n=5.*P<0.05vsOGD+vehicle group;#P<0.05vscontrol group.

圖3Shikonin對神經(jīng)元p-Akt表達(dá)的影響

4 LDH法檢測LY294002對shikonin預(yù)處理的OGD損傷神經(jīng)元活性的影響

提前用LY294002(1 μmol/L)阻斷PI3K后，用LDH法檢測shikonin(2 μmol/L)對神經(jīng)元LDH釋放水平的影響，結(jié)果顯示，與OGD+vehicle組相比，shikonin可顯著抑制LDH釋放(P<0.05);與OGD+shikonin組相比，OGD+shikonin+LY294002組可顯著升高LDH的釋放(P<0.05)，見圖5。

5 FDA/PI雙染檢測LY294002對shikonin預(yù)處理的OGD損傷神經(jīng)元凋亡的影響

同樣預(yù)先用LY294002降低p-Akt(Ser473)阻斷PI3K后，用FDA/PI法檢測shikonin(2 μmol/L)對OGD損傷神經(jīng)元凋亡的影響。結(jié)果顯示，與OGD+vehicle組相比，shikonin可顯著減小PI染色神經(jīng)元與FDA染色神經(jīng)元的比值(P<0.05)；與OGD+shikonin組相比，OGD+shikonin+LY294002組顯著提高了PI染色神經(jīng)元與FDA染色神經(jīng)元的比值(P<0.05)，見圖6。

討 論

紫草素是一種中草藥紫草的主要提取成分，多以結(jié)合酯存在，由于其具有電子傳遞作用，可以干預(yù)機(jī)體內(nèi)某些生化反應(yīng)過程，如線粒體功能可受到影響，具有抗炎、抗凋亡和抗感染等生物學(xué)作用[3-4]，因此，shikonin具有良好的臨床應(yīng)用前景。本研究以SD大鼠的原代皮層神經(jīng)元作為實(shí)驗(yàn)對象，用氧糖剝奪模型來開展探討shikonin在缺血性腦卒中的作用及機(jī)制。

Figure 4.LY294002 suppressed p-Akt expression in cortical neurons. Mean±SEM.n=5.△P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsOGD+vehicle group;#P<0.05vsOGD+shikonin group.

圖4LY294002抑制皮層神經(jīng)元p-Akt的表達(dá)

本研究首先使用不同濃度的shikonin處理OGD損傷的大鼠原代皮層神經(jīng)元，檢測其對細(xì)胞活性的影響，結(jié)果顯示0.2 μmol/L的shikonin對神經(jīng)元的活性無影響，而shikonin濃度達(dá)到0.2 μmol/L以上時，其可減少神經(jīng)元LDH的釋放量，抑制神經(jīng)元凋亡，并且濃度達(dá)2 μmol/L時，其抑制效果達(dá)到最佳，因此我們選擇2 μmol/L進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，以上結(jié)果表明，shikonin能夠緩解OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡。

PI3K/Akt信號通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移、分化、生長、凋亡及炎癥反應(yīng)等過程中發(fā)揮作用[6-11]。

Figure 5.The LDH release-inhibiting effect of shikonin was reversed by LY294002. Mean±SEM.n=5.△P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsOGD+vehicle group;#P<0.05vsOGD+shikonin group.

圖5LY294002逆轉(zhuǎn)shikonin對LDH釋放的抑制作用

研究證實(shí)，PI3K/Akt信號通路對缺氧損傷的PC12細(xì)胞株和大鼠神經(jīng)元起到一定的保護(hù)作用[12-13]；在大腦中動脈阻塞損傷和OGD損傷條件下均可下調(diào)神經(jīng)元的p-Akt(Ser473)水平[14-16]。本研究同樣也檢測到OGD處理能夠下調(diào)大鼠原代皮層神經(jīng)元p-Akt(Ser473)水平。

Wang等[17]研究證實(shí)，在心肌細(xì)胞株H9c2的缺氧復(fù)氧損傷模型中，shikonin可通過激活PI3K/Akt來減少細(xì)胞死亡;Liu等[18]研究也證實(shí)，在肝臟的缺血再灌注損傷模型中shikonin可經(jīng)PI3K/Akt途徑保護(hù)細(xì)胞。本研究結(jié)果也顯示，與OGD損傷組相比，shikonin處理后可上調(diào)p-Akt(Ser473)水平，并且高劑量的shikonin上調(diào)p-Akt(Ser473)水平更加明顯，這表明shikonin降低OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡可能與PI3K/Akt通路活性激活[即p-Akt(Ser473)水平升高]有關(guān)。

既往研究顯示，LY294002是PI3K拮抗劑，可有效阻斷PI3K/Akt通路[19]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證shikonin是否通過PI3K/Akt通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，我們使用了LY294002(1 μmol/L)，結(jié)果表明，與shikonin單獨(dú)處理神經(jīng)元相比，LY294002和shikonin共處理則提高了神經(jīng)元LDH釋放量，增加了神經(jīng)元的凋亡率，這進(jìn)一步證實(shí)了shikonin是通過PI3K/Akt通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的?？傊?，本研究表明，shikonin是通過激活PI3K/Akt通路抑制OGD誘導(dǎo)的大鼠原代皮層神經(jīng)元的凋亡。

Figure 6.The neuroprotective effect of shikonin was weakened by LY294002. The red fluorescence represents the apoptotic neurons stained by PI, and green fluorescence represents the surviving neurons stained by FDA. Scale bar=40 μm. Mean±SEM.n=5.△P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsOGD+vehicle group;#P<0.05vsOGD+shikonin group.

圖6LY294002抑制shikonin對神經(jīng)元的保護(hù)作用