莖瘤芥餅粕中硫苷的酶解條件優(yōu)化

張燕 張欣欣

摘要：用硫脲比色法、紫外分光光度法測定莖瘤芥餅粕中異硫氰酸酯的生成量，并以此為評價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，研究莖瘤芥（俗稱榨菜）餅粕中的硫苷在外源黑芥子酶催化作用下生成異硫氰酸酯的影響因素，從而確定硫苷酶解的最佳條件。單因素試驗(yàn)探究不同料液比（1 g ∶ 10 mL、1 g ∶ 15 mL、1 g ∶ 20 mL、1 g ∶ 25 mL、1 g ∶ 30 mL）、酶解時(shí)間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h）、溫度（30、40、50、60、70、80 ℃）及pH值（2、3、4、5、6、7、8、9）對異硫氰酸酯生成量的影響。根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選取對餅粕中異硫氰酸酯生成量影響較為顯著的料液比、酶解溫度、時(shí)間及pH值進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對硫苷的酶解條件進(jìn)行優(yōu)化。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，硫苷酶解的最適條件如下：酶解時(shí)間為1.0 h、反應(yīng)溫度為60 ℃、反應(yīng)體系pH值為6、料液比為1 g ∶ 15 mL，在該條件下，異硫氰酸酯的生成量達(dá)到最大值，為1.485 mg/g。通過研究，確定了莖瘤芥餅粕中硫苷酶解的最佳條件，從而為人類研發(fā)出更具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值和功能價(jià)值的產(chǎn)品提供了數(shù)據(jù)參考，提高了莖瘤芥的綜合利用效率。

關(guān)鍵詞：莖瘤芥;硫苷;異硫氰酸酯;酶解條件

中圖分類號： S188+.3 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）22-0238-05

硫代葡萄糖苷（簡稱硫苷）是十字花科蔬菜中一類重要的含硫次級代謝產(chǎn)物。近年來的研究表明，十字花科植物對癌癥有一定的療效，并且發(fā)現(xiàn)這種抗癌物質(zhì)是硫苷的降解產(chǎn)物或其相關(guān)的衍生物，其中最主要的是異硫氰酸酯（ITC）。異硫氰酸酯可以形成辛辣的風(fēng)味，如芥菜的特殊辛辣味與烯丙基異硫氰酸鹽有關(guān)[1]。同時(shí)研究表明，硫苷的降解產(chǎn)物異硫氰酸酯還可以抑制細(xì)菌的生長，其原因主要是異硫氰酸酯可以使細(xì)菌的細(xì)胞膜通透性改變[2]。由于異硫氰酸酯具有多種生物學(xué)活性，因此若能將其成功地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)上癌癥的治療以及食品的加工和貯藏，將對人類具有積極的影響。目前，全世界死于癌癥的人數(shù)不斷增加，癌癥已經(jīng)成為全世界科學(xué)家重點(diǎn)攻克的對象，而異硫氰酸酯具有抗癌的生物活性，這對人類攻克癌癥、延長壽命找到了1個可行的切入點(diǎn)。同時(shí)，在食品的加工上，異硫氰酸酯可以形成辛辣的風(fēng)味，使食品的味道更加鮮美。在貯藏上，異硫氰酸酯的抑菌作用，使食品的保質(zhì)期延長，貯藏的時(shí)間更久。這些都對人類的生活產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)效益。莖瘤芥（俗稱榨菜）是屬于十字花科的蕓薹屬植物，研究發(fā)現(xiàn)，硫苷在蕓薹屬植物中的含量是最豐富的，因而根據(jù)區(qū)域特色作物來探究硫苷的酶解條件并進(jìn)行優(yōu)化，將更有利于地方經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，并可為藥物的開發(fā)提供數(shù)據(jù)參考。

1 硫苷及其降解產(chǎn)物的研究現(xiàn)狀

硫苷在植物細(xì)胞中主要以離子的形式存在，尚毅等總結(jié)了硫代葡萄糖苷的研究進(jìn)展，結(jié)果顯示，硫苷的結(jié)構(gòu)由3個部分構(gòu)成：硫代糖苷鍵、磺酸根和側(cè)鏈基團(tuán)[3]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在植物中含有120多種硫苷[4]，這些硫苷在結(jié)構(gòu)組成上存在的差異主要是由于側(cè)鏈R基團(tuán)的不同。根據(jù)側(cè)鏈R基團(tuán)結(jié)構(gòu)的不同，可以把硫苷分為以下3大類：含有直鏈或支鏈烷基的脂肪族硫苷、含有苯環(huán)的芳香族硫苷以及含有吲哚環(huán)的吲哚族硫苷。其中異亮氨酸、甲硫氨酸主要構(gòu)成脂肪族硫苷的側(cè)鏈，酪氨酸、苯丙氨酸主要構(gòu)成芳香族硫苷的側(cè)鏈，而色氨酸構(gòu)成吲哚族硫苷的側(cè)鏈[5]。程坤等研究發(fā)現(xiàn)，硫苷在十字花科植物中的種類與含量占顯著優(yōu)勢，其含有硫苷的種類占目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的120多種硫苷的絕大部分，而在植物的其他科、屬中只發(fā)現(xiàn)含有1種或其中幾種硫苷，所含硫苷種類的數(shù)量遠(yuǎn)不及十字花科植物的多[6]。硫苷廣泛分布在植物的根、莖、葉和種子等部位，但是在種子中硫苷的含量是最高的[7]。王科研究發(fā)現(xiàn)，在十字花科植物的種子中含有的硫苷量可高達(dá)植物干質(zhì)量的10%;而在其他部位中，硫苷的含量僅占植物干質(zhì)量的1%左右[8]。硫苷的種類及其相應(yīng)的組分含量在不同植物中具有顯著的差異，當(dāng)植物處于不同的地理環(huán)境或在不同的生物階段中，就算是同一種植物的不同品種，各品種間所含有的硫苷種類和組分含量各不相同[9]。例如，在西蘭花中的硫苷主要是4-甲基亞磺酰酸基丁基硫苷、3-烯丁基硫苷和3-吲哚甲基硫苷;而在白菜中的硫苷則以2-烯丙基硫苷、3-吲哚甲基硫苷為主[10]。修麗麗等對西蘭花的嫩芽進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，4-甲基亞磺酰酸基丁基硫苷的含量是植株成熟時(shí)的100倍[11]。硫苷在黑芥子酶的催化作用下會發(fā)生相應(yīng)的酶解反應(yīng)，黑芥子酶是水解硫苷的專一酶，它是一種二聚體蛋白質(zhì)，其相對分子質(zhì)量在59～75 ku[12]之間。在植物細(xì)胞中，硫苷并不是獨(dú)立存在的，而是以硫苷-黑芥子酶這種體系的形式存在的[13]。在植物未受到損傷的狀態(tài)下，細(xì)胞中的硫苷、黑芥子酶是相互分隔開的，它們之間有1道天然的屏障。硫苷存在于植物細(xì)胞的液泡中[14]，液泡具有1層生物膜，這層液泡膜將形成硫苷與黑芥子酶之間的生物屏障。在正常情況下，硫苷與黑芥子酶并不會互相接觸而發(fā)生酶解反應(yīng)，只有當(dāng)植物細(xì)胞受到損傷或破壞時(shí)，硫苷與黑芥子酶之間的液泡膜屏障被破壞，才會相互聚集到一起，從而在酶的作用下發(fā)生催化反應(yīng)，產(chǎn)生一系列的代謝產(chǎn)物，例如，生成1個糖苷配基以及1分子葡萄糖[15]。其中糖苷配基非常不穩(wěn)定，會自發(fā)排列重新組合生成不同的降解產(chǎn)物。得到的降解產(chǎn)物不僅與硫苷的結(jié)構(gòu)組成有關(guān)，而且與反應(yīng)條件有關(guān)。當(dāng)反應(yīng)體系的pH值為中性時(shí)，糖苷配基會通過重新排列生成較穩(wěn)定的，并且具有生物活性的異硫氰酸酯;當(dāng)反應(yīng)體系的pH值為酸性時(shí)，糖苷配基發(fā)生脫硫反應(yīng)，從而得到腈類化合物;當(dāng)反應(yīng)體系的pH值為堿性時(shí)，糖苷配基將重新排列生成硫代氰酸鹽[16]。近年關(guān)于硫苷降解產(chǎn)物的研究發(fā)現(xiàn)，其產(chǎn)物具有多種醫(yī)用價(jià)值和藥用價(jià)值，尤其是硫苷的酶解產(chǎn)物異硫氰酸酯具有抗癌作用。申樹芳等的研究表明，異硫氰酸酯的抗癌機(jī)制主要是異硫氰酸酯可以使谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶、UDP（尿苷二磷酸）-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶的活性提高[17]。UDP-葡萄糖醛酸可與藥物或者與含有羥基、羧基、氨基、硫基等的有害化學(xué)物質(zhì)結(jié)合，生成可溶于水的化合物，并隨著尿液排出，使機(jī)體中對基因損傷的化學(xué)物質(zhì)減少，因此降低了基因的突變率。鮑英慧對油菜籽餅粕中異硫氰酸酯的測定方法[18]，為本研究中異硫氰酸酯的測定提供了參考。

2 本研究的創(chuàng)新點(diǎn)

本研究的試驗(yàn)材料是莖瘤芥雜交種涪雜2號的種子，涪雜2號是重慶市涪陵區(qū)的特色作物，該地區(qū)擁有豐富的榨菜資源和天然的地理?xiàng)l件。目前，大部分研究者對西蘭花、油菜、芥菜中硫苷及硫苷酶的研究較多，同時(shí)選取的材料大多是植物的根、莖、葉等組織，對種子中硫苷的酶解條件優(yōu)化研究較少。

3 材料與方法

3.1 材料

本研究所用材料為由涪陵莖瘤芥（榨菜）研究所研制的莖瘤芥雜交種涪雜2號的種子。

3.2 試劑

主要試劑為丙酮、檸檬酸、磷酸氫二鈉、80%氨乙醇（量取20 mL氨水與80 mL無水乙醇后充分混勻）。pH值為7.0的磷酸鹽-檸檬酸緩沖溶液。二氯甲烷、氨水、無水乙醇，購自重慶真真化工有限公司。

3.3 主要儀器與設(shè)備

JJ-2B型電動高速搗碎機(jī)，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;QL-901渦旋混合器，江蘇省海門市麒麟醫(yī)用儀器廠;CS101-2EBN電熱鼓風(fēng)干燥箱，重慶市恒達(dá)儀器廠;離心機(jī)，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司;恒溫水浴鍋，江蘇榮華儀器制造有限公司;紫外分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司。

3.4 試驗(yàn)方法

3.4.1 莖瘤芥籽餅粕的提取 將涪雜2號種子（48 h內(nèi)的發(fā)芽率必須大于85%，且保存期不超過1年）粉碎后，稱取適量榨菜籽餅粕，過60目篩，留下篩出的部分，并在50 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中干燥，干燥后存放于干燥器中，備用。

3.4.2 黑芥子酶的粗制酶粉提取 按文獻(xiàn)[19]描述的方法提取黑芥子酶的粗制酶粉。（1）將涪雜2號種子（48 h內(nèi)的發(fā)芽率必須大于85%，且保存期不超過1年）經(jīng)電動高速搗碎機(jī)粉碎，粉碎得越細(xì)越好，可以經(jīng)過多次粉碎。（2）稱取100 g粉碎過的榨菜籽，每次用30 mL丙酮進(jìn)行脫脂處理，一共進(jìn)行10次脫脂處理，共耗用300 mL丙酮。（3）用濾紙過濾，留取過濾在燒杯中的脫脂榨菜籽粉，在電熱鼓風(fēng)干燥箱中干燥。干燥過后，用400 mL蒸餾水分2次來提取脫脂粉中的黑芥子酶。（4）再進(jìn)行離心，取上層混懸液體，在混懸液中加入 400 mL 丙酮將黑芥子酶沉淀出來，然后將上清液棄去，留下沉淀。之后再用丙酮洗滌沉淀，共洗滌5次。（5）將洗滌好的沉淀進(jìn)行離心，棄去上清液，留下層的沉淀物，將沉淀物在電熱鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)進(jìn)行干燥，待干燥過后，將其研磨成粉末，裝入密封的干燥瓶中，保存在4 ℃冰箱中備用。

3.4.3 硫苷酶解生成異硫氰酸酯含量的測定 準(zhǔn)確稱取 0.200 g 榨菜籽餅粕于試管中，向試管中加入40 mg粗黑芥子酶、2.0 mL pH值為7.0的緩沖液。將試管放在渦旋混合器上，使試管中的反應(yīng)物充分混合。將反應(yīng)物放在不同的酶解條件下，酶促反應(yīng)2 h。待酶解過后向試管中加入2.5 mL二氯甲烷，再用渦旋混合器進(jìn)行充分混勻，混勻后將試管放在室溫下振蕩，頻率為40 kHz，時(shí)間為1 h。之后再用渦旋混合器將試管中的水相、有機(jī)相、樣品進(jìn)行充分混合，將混勻后的樣液裝入待離心的試管中，在離心機(jī)中于4 000 r/min離心 20 min。取具塞試管，向試管中加入6 mL 80%氨已醇。用移液槍取離心管下層的有機(jī)相樣液50 μL，將其加入盛裝80%氨已醇的試管中，蓋上塞子。用渦旋混合器將試管中的液體混合均勻，再將試管放入50 ℃水浴鍋中，加熱0.5 h，取出試管，待其冷卻至室溫。最后用紫外分光光度計(jì)測定其吸光度（波長為245 nm）。每個試樣需要平行測定3次，求出其算術(shù)平均值。

3.5 單因素酶解條件的確定

準(zhǔn)確稱取0.200 g榨菜籽餅粕，向其中加入40 mg外源黑芥子酶。研究不同料液比（1 g ∶ 10 mL、1 g ∶ 15 mL、1 g ∶ 20 mL、1 g ∶ 25 mL、1 g ∶ 30 mL）、時(shí)間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h）、溫度（30、40、50、60、70、80 ℃）、pH值（2、3、4、5、6、7、8、9）對異硫氰酸酯生成量的影響。

3.6 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)的確定

莖瘤芥餅粕中的硫苷會在黑芥子酶的作用下降解生成異硫氰酸酯。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇對異硫氰酸酯生成量相對影響較高的3個水平進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表1），以此來對莖瘤芥餅粕中硫苷的酶解條件進(jìn)行優(yōu)化。

3.7 異硫氰酸酯含量的計(jì)算公式

本試驗(yàn)用李培武等的測定油菜餅粕中異硫氰酸酯的硫脲比色法[20]來計(jì)算異硫氰酸酯的含量，相關(guān)公式如下：

c=D245 nm-D235 nm+D255 nm2×28.55。

式中：c為異硫氰酸酯的含量。

4 結(jié)果與分析

4.1 單因素試驗(yàn)的結(jié)果與分析

4.1.1 不同料液比對異硫氰酸酯生成量的影響 由圖1可以看出，料液比對異硫氰酸酯生成量的影響趨勢如下：隨著料液比增加，異硫氰酸酯的生成量先增加，當(dāng)異硫氰酸酯的生成量達(dá)到最大值時(shí)，此時(shí)的料液比為1 g ∶ 15 mL，在添加外源黑芥子酶的條件下，測得異硫氰酸酯的生成量為0.83 mg/g;隨著料液比的不斷提高，異硫氰酸酯的生成量降低并逐漸趨于平穩(wěn)，料液比為1 g ∶ 25 mL、1 g ∶ 30 mL時(shí)的異硫氰酸酯生成量分別為0.66、0.64 mg/g。由于硫苷的生物降解需要水分子的參與，當(dāng)料液比較低時(shí)，硫苷在磷酸鹽-檸檬酸緩沖液中溶解的量較少，導(dǎo)致硫苷酶解生成異硫氰酸酯的量也很小。之后，隨著料液比的增加，硫苷在緩沖液中的溶解量達(dá)到最大值，于是硫苷降解生成異硫氰酸酯的量最高。最后，由于反應(yīng)體系中添加的黑芥子酶量有限，隨著料液比的提高，異硫氰酸酯的生成量并不會隨之提高，逐漸趨向于平穩(wěn)。

4.1.2 不同溫度對異硫氰酸酯生成量的影響 由圖2可以看出，當(dāng)酶解溫度為30 ℃時(shí)，異硫氰酸酯的生成量較少，為0.38 mg/g，之后隨著溫度的升高，異硫氰酸酯的生成量逐漸增加。當(dāng)溫度為60 ℃時(shí)，異硫氰酸酯的生成量達(dá)到最大值;在添加外源黑芥子酶的條件下，測得異硫氰酸酯的生成量為0.54 mg/g;當(dāng)溫度超過60 ℃后，異硫氰酸酯的生成量又逐漸減少?？梢钥闯?，溫度對異硫氰酸酯生成量的影響趨勢總體是先升高，達(dá)到最大值后又逐漸降低。當(dāng)溫度較低時(shí)，黑芥子酶的活性也比較低，于是硫苷酶解產(chǎn)物異硫氰酸酯的生成量較少。當(dāng)溫度達(dá)到黑芥子酶的最適溫度60 ℃時(shí)，此時(shí)黑芥子酶的活性達(dá)到最大值，硫苷降解產(chǎn)物異硫氰酸酯的生成量最高。之后隨著溫度的繼續(xù)升高，由于高溫在一定程度上會破壞黑芥子酶的空間結(jié)構(gòu)，使黑芥子酶變性失活，從而導(dǎo)致異硫氰酸酯的生成量減少。

4.1.3 不同時(shí)間對異硫氰酸酯生成量的影響 由圖3可以看出，硫苷酶解1 h后，異硫氰酸酯的生成量達(dá)到最大值，在添加外源黑芥子酶的條件下，測得異硫氰酸酯的生成量為 1.02 mg/g，隨著時(shí)間逐漸增加，異硫氰酸酯的生成量又逐漸減少，當(dāng)酶解5 h時(shí)，在添加外源黑芥子酶的條件下測得異硫氰酸酯的生成量為0.32 mg/g，比酶解1 h時(shí)降低了 0.70 mg/g。隨著酶解時(shí)間的延長，異硫氰酸酯的穩(wěn)定性降低，與反應(yīng)體系中含有的親核基團(tuán)如羥基、氨基等物質(zhì)發(fā)生加成反應(yīng)，導(dǎo)致異硫氰酸酯的生成量減少。

4.1.4 不同pH值對異硫氰酸酯生成量的影響 由圖4可以看出，硫苷的酶解產(chǎn)物異硫氰酸酯在pH值為5～7的環(huán)境中生成量較高，當(dāng)體系的pH值為6時(shí)，異硫氰酸酯的生成量達(dá)到最大值，在添加外源黑芥子酶的條件下，測得異硫氰酸酯的生成量為0.77 mg/g，而在過酸或過堿的環(huán)境中，異硫氰酸酯的生成量較少。在pH值為2、9的環(huán)境中，生成的異硫氰酸酯的量分別為0.34、0.31 mg/g，分別比pH值為6的環(huán)境中的pH值降低了0.43、0.46 mg/g。當(dāng)反應(yīng)體系的pH值為 2～4 時(shí)，處于過酸的環(huán)境中，黑芥子酶的活性受到抑制，因此硫苷酶解生成異硫氰酸酯的量較少。當(dāng)反應(yīng)體系的pH值為中性或偏酸性時(shí)（pH值為5～7），黑芥子酶的活性較高，因而異硫氰酸酯的生成量較高。當(dāng)反應(yīng)體系的pH值為8～9時(shí)，黑芥子酶的活性降低，導(dǎo)致異硫氰酸酯的生成量較少。

4.2 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)的結(jié)果與分析

正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)的結(jié)果與分析見表2、表3。由表3可以看出，時(shí)間和溫度的P值為0.01～0.05，說明時(shí)間和溫度對異硫氰酸酯生成量的影響達(dá)到顯著水平，在其F值的右上方標(biāo)記“*”;pH值和料液比的P值<0.01，說明pH值和料液比對異硫氰酸酯生成量的影響達(dá)到極顯著水平，在其F值的右上方標(biāo)記“**”。通過F值的大小可以看出，影響莖瘤芥餅粕中硫苷酶解的因素主次排序是料液比（D）>pH值（C）>時(shí)間（A）>溫度（B）。由表2可以看出，A1B2C3D2為硫苷酶解的最佳組合，但是在正交設(shè)計(jì)組合中并沒有這一組合。在單因素試驗(yàn)中，異硫氰酸酯的生成量在C2條件下（pH值為6）比C3條件下（pH值為7）的高。因此結(jié)合單因素及正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)的結(jié)果，得出A1B2C2D2這一組合為硫苷酶解的最佳組合。進(jìn)一步得出莖瘤芥餅粕中硫苷的最佳酶解條件如下：時(shí)間為1 h，溫度為60 ℃，pH值為6，料液比為1 g ∶ 15 mL。在添加外源黑芥子酶的條件下，測得異硫氰酸酯的生成量為1.485 mg/g。

5 討論

莖瘤芥餅粕中硫苷的生物降解主要依靠黑芥子酶，同時(shí)適當(dāng)?shù)木彌_液會使黑芥子酶在緩沖液中的活性提高。張蕾等研究者在提取西蘭花籽中的黑芥子酶時(shí)，得出在Tris-HCl緩沖液中，黑芥子酶的活性比在蒸餾水和其他緩沖液中的都高，其次是在磷酸鹽-檸檬酸緩沖液中的活性，但是在蒸餾水中黑芥子酶活性是最低的[21]。該研究結(jié)果對本試驗(yàn)選取適當(dāng)?shù)木彌_液奠定了基礎(chǔ)。趙振東在海南芥子中硫苷及其酶解產(chǎn)物的提取分離與鑒定中，發(fā)現(xiàn)Tris中含有的氨基會與硫苷的酶解產(chǎn)物異硫氰酸酯發(fā)生相應(yīng)的加成反應(yīng)[22]。這對本試驗(yàn)最終測定異硫氰酸酯的生成量有影響，于是本研究選取磷酸鹽-檸檬酸緩沖液作為研究的緩沖液。劉哲等對蘿卜硫苷合成和調(diào)節(jié)相關(guān)基因的研究表明，硫代葡萄糖苷屬于陰離子親水性類物質(zhì)，因此硫苷發(fā)生生物降解需要在有水分子的環(huán)境中[23]。丁艷等在油菜籽餅粕中硫苷的酶解條件優(yōu)化及降解產(chǎn)物分析中發(fā)現(xiàn)，料液比對異硫氰酸酯生成量影響的總體趨勢如下：先升高，當(dāng)料液比為1 g ∶ 15 mL時(shí)，異硫氰酸酯的生成量達(dá)到最大值，之后下降，最后趨向于平穩(wěn)[13]，這與本研究結(jié)果基本相符合。劉月萍在黑芥子酶提取分離、性質(zhì)及固定化的研究中發(fā)現(xiàn)，使硫苷發(fā)生降解的專一黑芥子酶，其對溫度的穩(wěn)定性可以達(dá)到65 ℃[24]。在本研究中，當(dāng)溫度為60 ℃時(shí)，黑芥子酶的活性最高，本研究中黑芥子酶的最適溫度在其穩(wěn)定的區(qū)間內(nèi)。張清峰在辣根中生物活性成分——異硫氰酸酯的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度偏高時(shí)，異硫氰酸酯的穩(wěn)定性會降低，同時(shí)會與溶液中存在的OH-發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致實(shí)際測得的異硫氰酸酯量減少[25]。在本研究中，當(dāng)溫度為 80 ℃ 時(shí)，異硫氰酸酯的實(shí)際量顯著較低，與張清峰的研究結(jié)論基本相符。在酶解時(shí)間方面，隨著酶解時(shí)間延長，異硫氰酸酯的穩(wěn)定性下降，反應(yīng)體系中含有的親核基團(tuán)如氨基、羥基等物質(zhì)發(fā)生加成反應(yīng)，導(dǎo)致異硫氰酸酯的生成量減少，這與丁艷等得出的時(shí)間對異硫氰酸酯的影響規(guī)律[13]基本相符。在硫苷酶解的最適pH值方面，本研究得出的結(jié)論和其他學(xué)者的研究結(jié)論有一定的差異。蘇光耀等在西蘭花籽中硫代葡萄糖苷酶解條件的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)反應(yīng)體系的pH值為4.0時(shí)，在西蘭花籽中硫苷酶解生成異硫氰酸酯的量是最高的[26]。陳紅霞在辣根中異硫氰酸酯的制備和活性研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)反應(yīng)體系的pH值為7.0時(shí)，在辣根中硫苷酶解生成異硫氰酸酯的量達(dá)到最大值[27]。在本研究中得出莖瘤芥餅粕中硫苷酶解的最佳pH值為6，此時(shí)生成的異硫氰酸酯的量最高。分析其主要原因，是研究的材料不同，本研究的材料是重慶市涪陵區(qū)的特色區(qū)域作物莖瘤芥雜交種的涪雜2號，同時(shí)是以涪雜2號的種子為原料。研究發(fā)現(xiàn)，材料取自不同的植物，甚至植物的不同組織部位時(shí)，黑芥子酶的活性都存在一定差異。因此本研究與其他學(xué)者的研究得出的最適pH值有所不同是符合植物生理規(guī)律的。但是本研究得出，莖瘤芥餅粕中硫苷酶解的最適pH值為6，與郭強(qiáng)暉在西蘭花芽苗異硫氰酸酯富集與調(diào)控技術(shù)中研究發(fā)現(xiàn)的黑芥子酶的活性在pH值為5～8的區(qū)間內(nèi)較高這一總體規(guī)律是基本相符的[28]。

6 結(jié)論

本研究得出莖瘤芥餅粕中硫苷的最佳酶解條件如下：時(shí)間為1 h，溫度為 60 ℃，pH值為6，料液比為1 g ∶ 15 mL。在添加外源黑芥子酶的條件下，測得異硫氰酸酯的生成量為1.485 mg/g。本研究確定了莖瘤芥餅粕中硫苷的最佳酶解條件，為研發(fā)出更具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值和功能價(jià)值的產(chǎn)品提供了數(shù)據(jù)參考，提高了莖瘤芥的綜合利用效率。

參考文獻(xiàn)：

[1]肖華志. 食用辛辣風(fēng)味物質(zhì)異硫氰酸烯丙酯（AITC）的研究[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004：10-100.

[2]陳蘭英，畢明芳，余 倩，等. 異硫氰酸酯的分析方法[J]. 化學(xué)世界，2014，55（5）：307-310.

[3]尚 毅，田建華，李殿榮. 硫代葡萄糖苷的研究進(jìn)展[C]//食物與能源安全戰(zhàn)略中的中國油料——中國作物學(xué)會油料作物專業(yè)委員會第五屆學(xué)術(shù)年會論文集. 上海，2004：668-679.

[4]翟志亭. 氨基酸對甘藍(lán)硫代葡萄糖苷組分及含量的影響[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008：6-76.

[5]梁 浩，李瑞敏，袁其朋. 天然活性異硫氰酸酯類化合物的研究進(jìn)展[J]. 北京化工大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2015，42（2）：1-12.

[6]程 坤，楊麗梅，方智遠(yuǎn)，等. 十字花科植物中主要硫代葡萄糖苷合成與調(diào)節(jié)基因的研究進(jìn)展[J]. 中國蔬菜，2010，1（12）：1-6.

[7]周政子. 蘿卜籽中硫代葡萄糖苷的提取純化及其降解產(chǎn)物的抑菌特性研究[D]. 杭州：浙江工商大學(xué)，2013：3-79.

[8]王 科. 基于低速逆流色譜法的蘿卜籽中硫代葡萄糖苷的制各分離[D]. 杭州：浙江工商大學(xué)，2008：3-76.

[9]邱海榮. 不同品種青花菜和花椰菜硫代葡萄糖苷含量的測定及比較[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008：7-64.

[10]李 鮮，陳昆松，張明方，等. 十字花科植物中硫代葡萄糖苷的研究進(jìn)展[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2006，33（3）：675-679.

[11]修麗麗，鈕昆亮. 十字花科植物中的硫代葡萄糖苷及其降解產(chǎn)物[J]. 浙江科技學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，16（3）：187-189，211.

[12]朱 磊. 十字花科植物種子黑芥子酶酶學(xué)性質(zhì)研究[D]. 北京：北京化工大學(xué)，2011：6-87.

[13]丁 艷，李麗倩，曹 蓉，等. 油菜籽餅粕中硫苷的酶解條件優(yōu)化及降解產(chǎn)物分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，47（2）：383-393.

[14]阮 穎，周樸華，劉春林. 植物硫代葡萄糖苷-黑芥子酶底物酶系統(tǒng)[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2007，33（1）：18-23，78.

[15]劉 楠. 黑胡蘿卜色素的提取純化及其結(jié)構(gòu)分析[D]. 天津：天津科技大學(xué)，2007：4-74.

[16]李 雷，鄒 翔，季宇彬. 十字花科植物中異硫氰酸鹽的性質(zhì)及活性研究[J]. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2007，23（4）：385-389，399.

[17]申樹芳，張英鋒，馬子川. 西蘭花中硫代葡萄糖苷的抗癌藥理[J]. 化學(xué)教學(xué)，2009，2（7）：64-65.

[18]鮑英慧. 比色法測定菜籽餅粕中異硫氰酸酯[J]. 中國飼料，1999（24）：13.

[19]汪 儆，雷祖玉，馮學(xué)勤，等. 飼料中異硫氰酸酯的測定方法：GB 13087—1991[S]. 北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，1991.

[20]李培武，張 文，丁小霞，等. 油菜餅粕中異硫氰酸酯的測定硫脲比色法：NY/T 1596—2008[S]. 2008.

[21]張 蕾，龐秋穎，王 洋. 黑芥子酶提取及活性測定方法的改進(jìn)[J]. 東北師大學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2011，43（1）：118-121.

[22]趙振東. 海南芥子中硫苷及其酶解產(chǎn)物的提取分離與鑒定[D]. 海口：海南大學(xué)，2013：4-77.

[23]劉 哲，張秋萍，蘇小俊，等. 蘿卜硫苷合成和調(diào)節(jié)相關(guān)基因研究進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（6）：168-170.

[24]劉月萍. 黑芥子酶提取分離、性質(zhì)及固定化研究[D]. 杭州：浙江工商大學(xué)，2007：3-74.

[25]張清峰. 辣根中生物活性成分——異硫氰酸酯的研究[D]. 天津：天津商業(yè)大學(xué)，2007：4-97.

[26]蘇光耀，沈蓮清，王向陽，等. 西蘭花籽中硫代葡萄糖苷酶解條件的研究[J]. 中國糧油學(xué)報(bào)，2008，23（2）：178-182.

[27]陳虹霞. 辣根中異硫氰酸酯的制備和活性研究[D]. 北京：中國林業(yè)科學(xué)研究院，2009：5-106.

[28]郭強(qiáng)暉. 西蘭花芽苗異硫氰酸酯富集與調(diào)控技術(shù)研究[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014：7-77.