硫代葡萄糖苷檢測技術(shù)及其在花椰菜硫苷研究中的應(yīng)用

鄂恒超 - 趙曉燕 - 張艷梅 - 周昌艷 -

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，上海 201403)

硫代葡萄糖苷(glucosinolates，GSLs)簡稱硫苷，是一類廣泛存在于雙子葉被子植物根、莖、葉和種子中的次生代謝產(chǎn)物。根據(jù)硫苷中側(cè)鏈基團(tuán)的不同，可將硫苷分為脂肪類、芳香類和吲哚類硫苷3類180余種[1]。硫苷在芥子酶(myrosinase)、高溫、強酸、強堿等條件下可發(fā)生降解，產(chǎn)生異硫氰酸酯類、腈類、硫氰酸酯類、環(huán)腈類(epithionitriles)、噁唑烷酮類化合物(Oxazolidine-2-thiones，OZTs)等物質(zhì)[2-3]，進(jìn)而產(chǎn)生抗癌、抗菌殺蟲、改善風(fēng)味等多種作用[4-5]。

花椰菜是中國重要的十字花科蕓薹屬甘藍(lán)類蔬菜，是硫苷含量最為豐富的幾種蔬菜之一[6]?；ㄒ朔N植地域分布廣泛，常見品種類型有白花菜、松花菜、青花菜以及羅馬花椰菜等[7]。近年來，隨著花椰菜新品種的不斷選育，除產(chǎn)量和口感方面多樣化外，總硫苷含量和種類也有著較大差異[8]，因此，高效準(zhǔn)確完成硫苷的定性定量分析對花椰菜育種、營養(yǎng)評價以及硫苷類物質(zhì)研究開發(fā)中至關(guān)重要。文章擬通過系統(tǒng)整理硫苷的檢測方法，以及近10年花椰菜中硫苷檢測新方法的應(yīng)用，并對其未來發(fā)展方向進(jìn)行展望，旨在為花椰菜中硫苷開發(fā)、育種以及營養(yǎng)評價等研究提供參考。

1 硫代葡萄糖苷分析方法

1.1 樣品前處理

硫苷的化學(xué)性質(zhì)相對穩(wěn)定，但植物中黑芥子酶會使硫苷產(chǎn)生酶解反應(yīng)，因此在硫苷提取過程中首先需要高溫結(jié)合有機溶劑的方式進(jìn)行黑芥子酶滅活處理。其次，在硫苷提取過程中，一般采用沸水、甲醇、乙醇和氯仿等作為提取溶劑。目前應(yīng)用較廣泛的溶劑為一定比例的甲醇—水溶液，提取方式主要有浸提、震蕩、渦旋、超聲等。Ares等[9]采用微波加熱方式提取西蘭花葉中硫苷，僅需3.5 min，是目前文獻(xiàn)報道提取時間最短的方法。通過以上提取方法獲得的硫苷類化合物粗提物含有較多雜質(zhì)[10]，通常需凈化處理。常用的凈化方法包括萃取法和色譜法等。前者是基于硫苷在不同溶液中的溶解度差異達(dá)到富集硫苷的目的，后者則是利用硫苷特有的化學(xué)性質(zhì)，選擇合適的固定相和流動相，達(dá)到硫苷富集的目的。常用的固定相有DEAE Sephadex A-25樹脂、酸性氧化鋁、親水鍵合填料、反相硅膠等[11]。此外，Szmigielska等[12]利用陰離子交換膜在油菜籽提取液中吸附硫苷類化合物，除4-hydroxyglucobrassicin外其余硫苷都具有較好的回收率。目前常用的樣品前處理方法是將一定量的樣品于75 ℃ 下預(yù)熱后，加入預(yù)熱至75 ℃(或沸騰)的70%甲醇—水溶液，75 ℃水浴提取10～30 min，浸提過程中震蕩，離心收集上清，沉淀重復(fù)上述操作2～3次，合并上清液。提取液經(jīng)DEAE Sephadex A-25樹脂吸附處理后獲得總硫苷。

1.2 硫苷定性定量檢測方法

目前硫代葡萄糖苷的測定方法主要分為間接法和直接法(表1)[13]。間接測定法主要是利用GSLs在酶催化等降解過程中會產(chǎn)生硫酸鹽、葡萄糖以及異硫氰酸酯等中間產(chǎn)物(圖1)，通過定性定量檢測這些產(chǎn)物，間接對硫苷進(jìn)行定性定量；直接檢測法不需破壞硫苷分子直接完成定性定量。

圖1 硫苷降解過程及其產(chǎn)物[3]

表1 常用硫苷檢測方法及其優(yōu)缺點

1.2.1 硫苷間接分析法

(1) 硫酸根法：通過檢測樣品中GSLs降解后產(chǎn)生的硫酸根離子含量，間接測定樣品中總硫苷含量，常用的方法包括BaSO4重量法[14]和滴定法[15]等。這兩種方法都是利用BaSO4難溶的特點，在酶反應(yīng)終止后加入過量的Ba2+鹽，但重量法通過直接檢測沉淀物重量計算總硫苷含量，而滴定法是通過檢測剩余Ba2+含量計算總硫苷含量。該方法操作簡單，使用試劑、設(shè)備較少，但該方法會受到酶活性和pH等因素影響，進(jìn)而影響硫苷酶解程度，使結(jié)果的不穩(wěn)定性增加，結(jié)果可信度不高。

(2) 葡萄糖殘基檢測法：葡萄糖殘基檢測法包括比色法和熒光檢測法等[13]。比色法包括蒽酮比色法和3,5-二硝基水楊酸比色法等，其原理為顯色試劑在一定條件下與硫苷降解產(chǎn)生的葡萄糖發(fā)生顏色反應(yīng)，根據(jù)顏色深淺可比較準(zhǔn)確地測定硫苷總量。比色法的優(yōu)點是試劑易獲取、操作簡單；不足則在于玻璃器皿、凈化樹脂等對檢測結(jié)果易產(chǎn)生干擾。Karcher等[16]利用硫苷降解得到的葡萄糖在葡萄糖氧化酶作用下得到葡萄糖酸(gluconic acid，GA)與7-氨基萘-1,3-二磺酸(7-aminonaphthalene-1,3-disulfonic acid，ANDSA)反應(yīng)生成熒光物質(zhì)(GA-ANDSA)，進(jìn)而通過熒光檢測器檢測推算硫苷的含量。該檢測方法涉及酶降解、葡萄糖氧化、熒光物質(zhì)生成等多個操作步驟，因此對試驗人員要求較高，且易產(chǎn)生較大誤差。該方法還包括雙聯(lián)酶極譜法[17]和電流安培酶法[18]等。

(3) 硫苷降解產(chǎn)生的異硫氰酸酯類(ITCs)、腈類(RCNs)、噁唑烷酮類化合物(OZTs)等產(chǎn)物也常用于定性定量分析樣品中的硫苷。ITCs作為硫苷降解產(chǎn)物中的主要活性物質(zhì)受到更多的關(guān)注。目前常用的ITCs檢測方法包括光譜法、容量法和色譜法等[19-20]。如NY/T 1596—2008采用硫脲比色法測定油菜餅粕中異硫氰酸酯；此外還有利用紫外分光光度計直接測定有機溶劑(正己烷、乙醇)提取ITCs 在249 nm或243 nm處的吸光度值[21-22]、紅外吸收光譜測定2 060～2 105 cm-1處的特征吸收值[23]，定性、定量分析ITCs。光譜法測定方法簡單，所需時間短、靈敏度高，能完成定性和總量測定；銀量法是容量法的一種，是中國測定菜籽餅粕中ITCs的國標(biāo)方法之一(GB 13087—1991)，該法利用ITCs與氨水反應(yīng)，生成相應(yīng)的硫脲類化合物，然后再加入過量的硝酸銀，生成不溶解的硫化銀和碳化二亞胺，剩余的硝酸銀用經(jīng)典的伏爾哈德容量法測定。該方法時間長，操作復(fù)雜，但消耗較低，適用于定性和總量測定。除銀量法外，容量法還包括直接滴定法和二乙胺滴定法等[20]；色譜法測定ITCs含量的方法包括氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS)和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS)兩種。GC-MS方法能對多組分的ITCs進(jìn)行分析和鑒定，且操作簡便，應(yīng)用相對較多[24-25]。GC-MS方法也有一定的局限性，因為其不能測出受熱易分解的吲哚類硫苷，對以吲哚類硫苷為主的十字花科植物測定結(jié)果偏低，另外花椰菜等樣品自身會含有一定量的ITCs，通過測定酶解產(chǎn)物ITCs間接定量硫苷的方法會有一定的偏差。與GC-MS方法相比，LC-MS方法具有檢測限低、分析時間短、分析范圍廣、分離能力強、定性分析結(jié)果可靠等優(yōu)點[26]，但目前尚未見應(yīng)用此方法通過測定ITCs間接定性定量分析GSLs的報道。

此外，通過測定硫酸酯酶水解產(chǎn)物間接定性定量分析硫苷化合物的方法也比較常見。國際標(biāo)準(zhǔn)化組織在1992 年頒布了ISO 9167-1：1992(E)推薦使用HPLC分析法，定性定量檢測硫酸酯酶水解后的脫硫酸硫苷，間接測定硫苷類化合物的種類和含量。Olsen等[27]利用HPLC-MS/MS和NMR分析脫硫酸硫苷的方法，鑒定了豆蔻科中70余種硫苷化合物。

1.2.2 硫苷直接分析法 直接測定法不涉及衍生化和降解過程，既能大大減少降解環(huán)節(jié)產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差，又能排除樣品內(nèi)已有的降解產(chǎn)物干擾，提高方法的準(zhǔn)確性。目前報道的直接測定法有麝香草酚法[15]、近紅外光譜法[28-30]、膠束電動毛細(xì)管色譜法(MECC)[31]、高效液相色譜法(HPLC)、LC-MS等。

麝香草酚法在濃硫酸存在的條件下，與完整硫苷分子上的葡萄糖殘基產(chǎn)生顏色反應(yīng)，根據(jù)顏色深淺可比較準(zhǔn)確地測定硫苷總量；近紅外光譜法主要是通過已知標(biāo)品建立紅外分析模型，對比樣品數(shù)據(jù)，快速測定硫苷含量。NY/T 3295—2018采用近紅外光譜法測定油菜籽中硫苷含量；MECC法利用硫苷分子中含有硫酸酯基、吲哚基等官能團(tuán)，能通過電泳的方式在硼酸鹽緩沖體系中使硫苷達(dá)到分離的效果，從而達(dá)到定性定量分析樣品中硫苷化合物的目的。

HPLC法可以更精確地鑒別硫苷，是目前應(yīng)用最廣泛的硫苷檢測方法，其中超高效液相色譜(UPLC)具有快速、高分離度以及高靈敏度的優(yōu)勢，在含量較低成分的檢測中具有很高的應(yīng)用價值，受到廣泛應(yīng)用。HPLC聯(lián)合紫外檢測器(UV)或者二極管陣列(DAD)定性定量檢測硫苷類化合物，能快速高效地完成樣品的檢測，具有較高的靈敏度[32-33]。隨著質(zhì)譜技術(shù)的快速發(fā)展，UPLC-MS/MS及UPLC-HRMS的聯(lián)用技術(shù)越來越多地應(yīng)用于硫苷檢測中，目前已基于LC-MS技術(shù)開發(fā)出多種硫苷定性定量方法[34-39]，NY/T 3296—2018即采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測油菜籽中的硫苷化合物。

上述硫代葡萄糖苷檢測方法各有優(yōu)缺點(表1)。近紅外反射譜法可以無損檢測，雖然采樣量少，但需大量標(biāo)品去建立可信模型；熒光檢測法檢測步驟繁多，會導(dǎo)致檢測結(jié)果誤差增大；膠束電動毛細(xì)管電泳法干擾因素少，成本低，但分離時間長；氣相色譜法無法檢測出受熱易分解的硫苷；高效液相色譜串聯(lián)紫外檢測法因可同時測定各種硫苷含量，重現(xiàn)性與精密度尚可，在實際應(yīng)用中比較普遍，但該方法的檢測限及其靈敏度較差，在硫苷或異硫氰酸酯含量較低的樣品上存在方法應(yīng)用的局限性；高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法因在硫苷檢測中具備更低的檢測限以及更高的靈敏度，受到越來越多的關(guān)注與應(yīng)用，但在定性定量研究中需硫苷標(biāo)準(zhǔn)品，成本相對較高。

2 花椰菜中的硫苷分析

大量研究[32]證實花椰菜含有豐富的硫苷類化合物，在硫苷種類和含量方面均排在市售蔬菜的前列。不同品種的花椰菜中硫苷總含量差異較大，丁云花等[8]對3種類型15個花椰菜品種硫苷組分含量測定結(jié)果顯示，其含量范圍為0.332 3～4.872 8 μmol/g(FW)。花椰菜中已報道硫苷有50余個[40]，其中常見的有20個，包括脂肪類硫苷12個，芳香類硫苷4個，吲哚類硫苷4個，含量相對較大的為3-(甲基亞磺?；?丙基硫苷(1)、4-(甲基亞磺?；?丁基硫苷(2)、3-丁烯基硫苷(9)、3-吲哚基甲基硫苷(17)和1-甲氧基-3-吲哚基甲基硫苷(18)等，這些硫苷的降解產(chǎn)物多具有抗腫瘤活性，其中4-(甲基亞磺酰基)丁基硫苷的酶解產(chǎn)物萊菔硫烷抗癌活性得到了廣泛研究且取得了國際上的認(rèn)可[41]。表2總結(jié)了近10年花椰菜中硫苷的定性定量分析方法，其中基于LC-MS的分析方法由于樣品前處理簡單、靈敏度高、定性定量方便等被廣泛應(yīng)用。高分辨質(zhì)譜能提供準(zhǔn)確的分子量信息，多用來進(jìn)行定性分析；多級質(zhì)譜因能選擇特定離子進(jìn)行碎裂片段分析，進(jìn)而通過SIM、MRM等方式完成化合物定量分析，具有較高的靈敏度。花椰菜中常見硫苷及其在質(zhì)譜中的MS/MS碎片信息，以及對應(yīng)的降解產(chǎn)物相關(guān)信息見表3。

表3 花椰菜中常見硫苷及其對應(yīng)的降解產(chǎn)物

表2 近10年花椰菜中硫苷的定性定量分析方法

3 總結(jié)與展望

目前，花椰菜中硫苷的分離、分析方法研究取得了很大的進(jìn)展，但仍存在一些問題。① 檢測技術(shù)方面，目前常用的色譜、質(zhì)譜檢測方法需購買硫苷標(biāo)準(zhǔn)品，但市場上的標(biāo)準(zhǔn)品價格較高且種類不齊全，使得檢測成本相對較高?；ㄒ酥辛蜍张c異硫氰酸酯等降解產(chǎn)物是共存的，但迄今為止很多研究工作未同時考慮這兩類化合物，導(dǎo)致對花椰菜中的硫苷營養(yǎng)成分評價不夠全面。② 檢測技術(shù)的不斷創(chuàng)新要服務(wù)于花椰菜的生產(chǎn)加工。除花椰菜可食用部分外，其莖、葉中也含有大量的硫苷，但這些部位很多都以廢棄物丟掉，未能得到更好的利用?；谝陨喜蛔悖_發(fā)種類多樣的硫苷化合物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)顯得尤為必要。此外，開發(fā)同時分析硫苷和異硫氰酸酯等降解產(chǎn)物的分析方法，可有效地克服目前檢測方法的不足；以及提高檢測方法的靈敏度和檢測限，縮短檢測時間，提高檢測效率和精確度等，均對花椰菜的品質(zhì)評價，指導(dǎo)育種和產(chǎn)品開發(fā)具有重要意義。

續(xù)表3

類別化學(xué)式CAS號分子量質(zhì)荷比[M-H]-質(zhì)譜碎片降解產(chǎn)物(ITC等)化學(xué)式CAS號分子量5-(甲硫基)戊基硫苷C13H24NO9S329611-01-6435.52434.06434.06,354.11,259.01,195.03,128.93,96.96,74.995-(甲硫基)戊基異硫氰酸酯C7H13NS24430-42-6175.315-(甲基亞磺酰基)戊基硫苷C13H24NO10S3499-37-6451.50450.06450.06,435.03,386.06,192.03,96.96,74.995-(甲基亞磺?；?戊基異硫氰酸酯C7H13NOS2646-23-1191.316-(甲基磺酰基)己基硫苷C14H27NO11S374542-18-0481.60480.07480.07,259.01,96.96,74.996-(甲基磺?；?己基異硫氰酸酯C8H15NO2S2167963-03-3221.343-丁烯基硫苷C11H19NO9S219041-10-2373.39372.04372.04,259.01,195.03,130.03,96.96,74.993-丁烯基異硫氰酸酯C5H7NS34424-44-7113.182-羥基-3-丁烯基硫苷C11H19NO10S2585-95-5389.39388.04388.04,332.01,259.01,195.03,135.97,96.96,74.99告依春C5H7NOS1072-93-1129.184-戊烯基硫苷C12H21NO9S219041-10-2387.42386.06386.06,306.10,259.01,195.03,144.05,96.96,74.994-戊烯基異硫氰酸酯C6H9NS18060-79-2127.21黑芥子硫苷C10H17NO9S23952-98-5359.40358.03358.03,259.01,195.03,116.02,96.96,74.99烯丙基異硫氰酸酯C4H5NS200-309-299.15豆瓣菜苷C15H21NO9S2499-30-9423.45422.06422.06,358.02,259.01,195.03,96.96,74.99苯乙基異硫氰酸酯C9H9NS2257-09-2163.242(R)-羥基-2-苯乙基硫苷C15H21NO10S221087-78-5439.45438.05438.05,332.01,259.01,195.03,135.97,96.96,74.995-苯基-1,3-惡唑烷-2-硫酮C9H9NOS3433-15-6179.24芐基硫苷C14H19NO9S25115-71-9409.42408.04408.04,259.01,195.03,166.03,96.96,74.99芐基異硫氰酸酯C8H7NS622-78-6149.214-羥基芐基硫苷C14H19NO10S220196-67-2425.42424.04424.04,360.02,259.01,195.03,96.96,74.994-羥基芐基異硫氰酸酯C8H7NOS23763-98-6165.213-吲哚基甲基硫苷C16H20N2O9S24356-52-9448.46447.05447.05,367.10,259.01,195.03,121.95,96.96,74.99吲哚-3-甲醇C9H9NO700-06-1147.171-甲氧基-3-吲哚基甲基硫苷C17H22N2O10S25187-84-8478.49477.06477.06,446.05,259.01,96.96,74.991-甲氧基-吲哚-3-甲醇C10H11NO2110139-35-0177.204-羥基-3-吲哚基甲基硫苷C16H20N2O10S283327-20-2464.50463.05463.05,285.02,267.01,259.01,221.04,96.96,74.994-羥基-吲哚-3-甲醇C9H9NO281779-28-4163.174-甲氧基-3-吲哚基甲基硫苷C17H22N2O10S283327-21-3478.49477.06477.06,299.06,274.99,259.01,96.96,74.994-甲氧基-吲哚-3-甲醇C10H11NO296888-16-3177.20