小白菜抵御蟲(chóng)害時(shí)硫苷含量變化的探究

在植物的一生中，它面臨著非常復(fù)雜、充滿威脅的生存環(huán)境，要面臨滅絕的危險(xiǎn)，但植物通過(guò)物種進(jìn)化的方式形成了各種各樣的防御機(jī)制。十字花科植物中有很多種類是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，比如小白菜、芥菜、甘藍(lán)、油菜等。而小菜蛾是一種喜好取食十字花科植物的雜食性昆蟲(chóng)，特別是當(dāng)小菜蛾成長(zhǎng)為2～3齡幼蟲(chóng)時(shí)，對(duì)十字花科植物有極大的危害性，給我國(guó)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)了不可估量的經(jīng)濟(jì)損失。硫代葡萄糖苷（簡(jiǎn)稱硫苷）是一種特殊的存在于十字花科植物中的次生代謝物質(zhì)，在植株的防御機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，同時(shí)，硫苷還賦予了十字花科植物特殊的風(fēng)味，在人類的防癌、抗癌方面也有一定功能。我們的課題就是研究十字花科蔬菜的小白菜是如何在小菜蛾取食的情況下誘導(dǎo)產(chǎn)生出一系列防御機(jī)制的。在我們的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)了：在被害蟲(chóng)取食72h 后，小白菜植株被害蟲(chóng)取食的地上部分葉片的硫苷含量趨于增加，硫苷可以在植物體內(nèi)形成非均勻分布的模式，并且容易遭受昆蟲(chóng)取食的部位和植物的繁殖器官容易積累更多硫苷。

引言

植物的進(jìn)化面臨著復(fù)雜多變的環(huán)境，比如被害蟲(chóng)取食，被動(dòng)物當(dāng)作食物，被人類當(dāng)作糧食，甚至生存環(huán)境會(huì)被洪澇、干旱等極端條件影響，或者被細(xì)菌病毒浸染。因而進(jìn)化出了一系列防御機(jī)制，如“組成型防御”指的是植物利用自身固有特征，來(lái)阻止昆蟲(chóng)取食或病原菌浸染，這種防御方式是植物與生俱來(lái)的，外界環(huán)境對(duì)其影響不大，并且可以在植物體內(nèi)持續(xù)地發(fā)揮作用；而“誘導(dǎo)型防御”則指的是植物因?yàn)樵馐芾ハx(chóng)取食或被機(jī)械損傷等行為的誘導(dǎo)，而產(chǎn)生了某種物質(zhì)來(lái)避免或減少被取食造成的傷害，這是在植物被外界損傷后才表現(xiàn)出的防御反應(yīng)，例如煙草被害蟲(chóng)取食后會(huì)讓根部開(kāi)始生產(chǎn)尼古丁將害蟲(chóng)毒死，從而達(dá)到防御的目的。

十字花科是一個(gè)經(jīng)濟(jì)價(jià)值較大的科。全世界有300屬以上，3200種左右。主產(chǎn)地為北溫帶。在我國(guó)有95屬，400余種，全國(guó)各地均有分布，其中以西北、西南及東北的高山區(qū)或丘陵、平原地帶分布為多，是我國(guó)主要的經(jīng)濟(jì)作物。一般可分為四類：甘藍(lán)類、芥菜類、白菜類和蘿卜類。

小菜蛾，鱗翅目菜蛾科，主要為害的蔬菜品種包括甘藍(lán)、紫甘藍(lán)、青花菜、薹菜、芥菜、花椰菜、白菜、油菜、蘿卜等十字花科農(nóng)作物。其為害特點(diǎn)：初齡幼蟲(chóng)僅取食葉肉，留下表皮，在菜葉上形成一個(gè)個(gè)透明的斑，即常說(shuō)的“開(kāi)天窗”。3～4齡幼蟲(chóng)可將菜葉食成孔洞和缺刻，嚴(yán)重時(shí)植株全葉被吃成網(wǎng)狀。在苗期常集中心葉為害，影響包心。在留種株上，危害嫩莖、幼莢和籽粒。

硫代葡萄糖苷（簡(jiǎn)稱硫苷），是十字花科蔬菜中的重要的也是其特有的一種次生代謝產(chǎn)物。學(xué)者根據(jù)側(cè)鏈基團(tuán)的不同，把硫苷分為三大類，包括脂肪族硫苷、芳香族硫苷與吲哚族硫苷。硫代葡萄糖苷不僅在植株的防御機(jī)制中起著舉足輕重的作用，同時(shí)，十字花科植物中存在的特殊風(fēng)味也與硫苷有關(guān)，而且硫苷還在人類的健康方面也有一定功能，科學(xué)家倡導(dǎo)常吃白菜、蘿卜、甘藍(lán)等新鮮蔬菜可以防癌便是出于十字花科蔬菜含有硫苷的原因[2]。

我們選擇這個(gè)課題，希望通過(guò)比較農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛種植的小白菜在受到雜食性昆蟲(chóng)小菜蛾的取食為害后，植株體內(nèi)硫苷含量是如何變化的，希望研究硫苷在十字花科植物防御體系中發(fā)揮的作用，在未來(lái)可以更多地去提取該類硫苷來(lái)開(kāi)發(fā)“綠色農(nóng)藥”幫助十字花科植物建立更佳優(yōu)越的防御機(jī)制。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)材料

十字花科蔬菜：小白菜，2～3齡小菜蛾幼蟲(chóng)，育苗營(yíng)養(yǎng)缽，基質(zhì)土，光照培養(yǎng)箱，塑料罐。

實(shí)驗(yàn)方案

育苗：將四種蔬菜分別播種于育苗盤(pán)當(dāng)中，做好標(biāo)記，標(biāo)明播種時(shí)間。

移栽：等待3～4天，幼苗長(zhǎng)出3～4片葉子后，選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗，小心移植到營(yíng)養(yǎng)缽中，移植過(guò)程中注意避免機(jī)械損傷。

培養(yǎng)：為了防止其他蟲(chóng)害和機(jī)械損傷，將植株放置在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行育苗培養(yǎng)。待幼苗長(zhǎng)至四葉一心、八葉一心和十二葉一心，對(duì)幼苗進(jìn)行蟲(chóng)吃處理。

蟲(chóng)吃處理：實(shí)驗(yàn)處理前，將小菜蛾進(jìn)行饑餓處理5h，然后把小菜蛾放置在葉片上，每棵植株上放置3頭。再把塑料罐的底部用剪刀剪去，透明塑料罐倒扣在營(yíng)養(yǎng)缽上，這樣既能透氣又能透光，同時(shí)用圓形紙片將營(yíng)養(yǎng)缽中的土全部蓋住，以上措施主要為了防止小菜蛾逃逸。

觀察與檢測(cè)：分別于不同時(shí)間進(jìn)行觀察并拍照記錄。蟲(chóng)吃處理后，進(jìn)行硫苷含量的檢測(cè)。

硫苷提?。喝訒r(shí)以三株為一組處理，并且每組設(shè)置三次生物學(xué)重復(fù)，植株成熟并進(jìn)行接蟲(chóng)處理采收后，分別做好標(biāo)記放入提前準(zhǔn)備好的網(wǎng)袋中，進(jìn)行液氮速凍保鮮。然后存放于-80℃冰箱，以便用于硫苷的提取和檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)先對(duì)樣品進(jìn)行萃取，提取出硫苷后采用高效液相色譜法分析樣品中的硫苷含量[3]。

數(shù)據(jù)處理，采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與作圖，SPSS進(jìn)行差異顯著性分析。

結(jié)果與分析

小菜蛾取食小白菜時(shí)間的探究

我們根據(jù)觀察實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)小菜蛾對(duì)于小白菜的取食偏好主要集中在新生葉片部分，而且相比于八葉期植株和十二葉期植株，小菜蛾更偏好于取食四葉期植株。越靠近植株包心部分，受小菜蛾取食也更嚴(yán)重。此外，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，蟲(chóng)齡越大，植株被損害程度也越嚴(yán)重。

不同生長(zhǎng)期小白菜硫苷含量的分析

通過(guò)文獻(xiàn)查詢確定植株體內(nèi)硫苷組分，使用高效液相色譜法對(duì)小白菜植株中不同種類的硫苷含量進(jìn)行分析，比較鑒定出小白菜植株中硫苷種類一共有8種（圖2），他們的名稱分別是：2-羥基-3-丁烯基硫苷、5-甲基亞硫酰戊烷基硫苷、3-丁烯基硫苷、4-羥基-3-吲哚基硫苷、4－戊稀基硫苷、2-苯乙基硫苷、4-甲氧基-3-吲哚基甲基硫苷、1-甲氧基-3-吲哚基甲基硫苷。

圖2 小白菜硫苷種類的液相色譜圖

此外，不同時(shí)期總硫苷和各類硫苷的含量也有所不同，即四葉期植株、八葉期植株和十二葉期植株中葉片的硫苷含量也存在不同。從四葉期植株到八葉期植株，我們發(fā)現(xiàn)葉片中的硫苷含量呈顯著上升趨勢(shì)（p＜ 0.05），而八葉期植株硫苷含量則達(dá)到峰值，到十二葉期時(shí)植株的硫苷含量有所下降（圖3）。其中，小白菜植株中吲哚族和芳香族的硫苷含量變化趨勢(shì)與總硫苷含量的變化趨勢(shì)一致，即在八葉期時(shí)含量最高，而在四葉期和十二葉期含量較低。脂肪族硫苷的含量則是隨著葉期的生長(zhǎng)而呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，在十二葉期時(shí)含量達(dá)到了最低。另外，從圖中還可以發(fā)現(xiàn)，在不同的時(shí)期，小白菜植株中脂肪族硫苷、吲哚族硫苷和芳香族硫苷的含量分別占總硫苷含量的比重也有所不同。在植株四葉期時(shí)，脂肪族硫苷含量的占比是最高的，約占總硫苷含量的 65%；生長(zhǎng)至八葉期時(shí)，吲哚族硫苷含量所占的比重最大，占總硫含量苷的 48%；到十二葉期時(shí)脂肪族硫苷與吲哚族硫苷的含量相差不大。此外，在這三個(gè)時(shí)期當(dāng)中，芳香族硫苷的含量所占比例都是最低的。

圖3 不同時(shí)期總硫苷和各類硫苷的含量比較

聯(lián)系我們的觀察實(shí)驗(yàn)，這一結(jié)果告訴我們，對(duì)于小白菜植株來(lái)說(shuō)，四葉期相比于八葉期和十二葉期來(lái)說(shuō)更容易遭受昆蟲(chóng)取食或者承受更多潛在的其他威脅，所以小白菜植株體內(nèi)產(chǎn)生了更多脂肪族硫苷來(lái)幫助植株抵御外界給小白菜帶來(lái)的危害；而隨著植株的生長(zhǎng)，到八葉期時(shí)植株體內(nèi)的硫苷含量累計(jì)達(dá)到了峰值，且增加的硫苷也主要以吲哚族和芳香族硫苷為主，脂肪族硫苷含量則在慢慢減少。

小菜蛾取食后小白菜中硫苷含量變化

我們對(duì)不同時(shí)期的小白菜進(jìn)行含量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)小白菜在八葉期含量已累計(jì)達(dá)到峰值，說(shuō)明此前小白菜硫苷含量處于加速積累狀態(tài)，因此為了減小因植株生長(zhǎng)造成的硫苷含量增加的誤差，我們?cè)谔骄啃“撞吮浑s食性昆蟲(chóng)小菜蛾取食后植株體內(nèi)硫苷含量的變化時(shí)，選擇的是長(zhǎng)勢(shì)一致的八葉期植株，在光照培養(yǎng)箱中接同一時(shí)期的小菜蛾幼蟲(chóng)，分別提取不同時(shí)間的對(duì)照植株和進(jìn)行了接蟲(chóng)處理后葉片中的硫苷，利用高效液相色譜法進(jìn)行對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組硫苷含量的鑒定。發(fā)現(xiàn)接蟲(chóng)處理后植株總硫苷在被昆蟲(chóng)危害的不同時(shí)間植株體內(nèi)硫苷含量的變化都有所不同（圖4）。

圖4 小菜蛾取食對(duì)小白菜中總硫苷各類硫苷含量的影響

對(duì)小菜蛾取食后的72h內(nèi)選取了四個(gè)時(shí)間點(diǎn)：1h、24h、48h和72h進(jìn)行硫苷含量的檢測(cè)。我們發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，不論是總硫苷含量還是各不同種類的硫苷含量，都表現(xiàn)出整體上升趨勢(shì)，這一結(jié)果說(shuō)明小菜蛾取食確實(shí)能夠引起硫苷含量的增加。

在我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，植株被昆蟲(chóng)取食 1h 后，硫苷含量增加不顯著(p＜ 0.05)，24h 后硫苷含量明顯上升，與對(duì)照差異性顯著，在48 h 后硫苷的含量呈增加趨勢(shì)，但上升的幅度卻逐漸減弱，被小菜蛾取食72h 時(shí)達(dá)到其最高值2.02μmol/g，相比對(duì)照的 1.15μmol/ g，含量了上升將近 0.8倍。在被小菜蛾取食前后，小白菜植株體內(nèi)的脂肪族硫苷在總硫苷含量中都確實(shí)占主要比重，而被小菜蛾取食 1h 后脂肪族硫苷明顯上升，隨取食時(shí)間的延長(zhǎng)，脂肪族硫苷的含量逐漸升高，48h 達(dá)到最高值1.135μmol/ g，比對(duì)照組硫苷含量增加了 59%。此外，吲哚族硫苷含量的變化與總硫苷含量的變化趨勢(shì)一致，含量最高的 72h 相比于對(duì)照增加 136%。芳香族硫苷的含量較低，被小菜蛾取食24h 后達(dá)到最高，增加近 63.5%，而在被小菜蛾取食 48h 和 72h后，芳香族硫苷的含量都出現(xiàn)了顯著降低。

結(jié)果與討論

在抵御十字花科植物被害蟲(chóng)取食方面，硫苷一直扮演者十分重要的角色。本實(shí)驗(yàn)研究了小白菜在不同葉期時(shí)葉片中硫苷含量的變化，發(fā)現(xiàn)四葉期到八葉期硫苷含量加速累積，十二葉期時(shí)葉片中的硫苷含量下降，說(shuō)明小白菜葉片在不同生長(zhǎng)期的硫苷含量處于不斷的變化之中。硫苷在植株的體內(nèi)是不斷產(chǎn)生和積累的，而十二葉期硫苷含量的下降，則可能是因?yàn)橹仓曛辛蜍盏姆e累速率是不高于植物的生長(zhǎng)速率的，所以表現(xiàn)出來(lái)了硫苷在植株體內(nèi)出現(xiàn)含量降低的情況，同時(shí)也有可能是由于隨著植株的不斷生長(zhǎng)和發(fā)育，葉片新合成的硫苷又被運(yùn)輸?shù)搅酥参锏那o部或地下根等其他部位的器官所導(dǎo)致的。除此之外，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，小白菜在生長(zhǎng)至四葉期時(shí)受昆蟲(chóng)取食為害最為嚴(yán)重，所以小白菜植株體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生更多硫苷希望幫助植株抵御昆蟲(chóng)取食給小白菜帶來(lái)的危害，而這些產(chǎn)生的硫苷在植株生長(zhǎng)至八葉期時(shí)累積達(dá)到了峰值；同時(shí)，在遭受害蟲(chóng)取食為害1h，硫苷含量即開(kāi)始上升，待被為害24-48h時(shí)，植株體內(nèi)的硫苷處于加速積累的過(guò)程，而且產(chǎn)生的硫苷也主要以脂肪族硫苷和吲哚族硫苷為主，這證明了小白菜在處于不利環(huán)境時(shí)，植株體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生更多硫苷以幫助植株減少和抵御來(lái)自外界環(huán)境的侵害。

為了揭示害蟲(chóng)取食植株后引起硫苷含量變化的反應(yīng)機(jī)理，我們利用害蟲(chóng)小菜蛾對(duì)十字花科蔬菜品種小白菜進(jìn)行接蟲(chóng)處理，能夠幫助我們更加深入地了解硫苷在植物抗蟲(chóng)防御體系中所起到的重要作用。在我們的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：在被害蟲(chóng)取食72h 后，小白菜被害蟲(chóng)取食的地上部葉片硫苷含量增加，說(shuō)明硫苷介導(dǎo)的防御體系的確響應(yīng)了害蟲(chóng)脅迫，對(duì)增加植物抗蟲(chóng)的阻力也會(huì)起到一定的作用。此外，研究表明，硫苷可以在植物體內(nèi)形成非均勻分布的模式，而且在易受昆蟲(chóng)取食的部位以及植物的繁殖器官當(dāng)中會(huì)容易積累更多硫苷。

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，由于時(shí)間和條件的限制，我們無(wú)法測(cè)量蟲(chóng)體內(nèi)的解毒酶來(lái)觀察蟲(chóng)體的變化，所以用測(cè)量植株內(nèi)的硫苷含量變化來(lái)進(jìn)行替代。不同植株和種類中硫苷的含量也存在很大差別，這些差別究竟對(duì)植物的防御起到了怎樣不同的影響，這些問(wèn)題有待于我們進(jìn)一步去研究發(fā)現(xiàn)。明確以硫苷介導(dǎo)的植物防御機(jī)理，這對(duì)于將來(lái)在植物抗菌、抗蟲(chóng)和抗病方面的研究將會(huì)有重要意義[4]。

本研究創(chuàng)新點(diǎn)

在對(duì)各類文獻(xiàn)的查找過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)雖然有關(guān)十字花科植物硫苷產(chǎn)生機(jī)制的研究比較多，但對(duì)于害蟲(chóng)取食誘導(dǎo)十字花科產(chǎn)生硫苷防御機(jī)制的研究并不多。我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)中設(shè)置了植株在不同生長(zhǎng)時(shí)期（四葉期、八葉期和十二葉期）被害蟲(chóng)取食做比較，發(fā)現(xiàn)害蟲(chóng)更傾向于取食四葉期植株，而且從四葉到八葉這一段時(shí)期硫苷是呈加速積累狀態(tài)的；此外我們還設(shè)置了被害蟲(chóng)取食后不同時(shí)間（1h、24h、48h和72h）測(cè)量硫苷變化，發(fā)現(xiàn)被害蟲(chóng)取食72h時(shí)達(dá)到最高值，而且脂肪族硫苷在植株防御機(jī)制中更起著主要作用。

研究感悟

植物為了生存必須拼盡全力，它們的祖先們由于承受了巨大的被取食的壓力，所以需要不斷進(jìn)化，進(jìn)化出了一系列防御機(jī)制。根據(jù)防御方式的不同，我們可以將這種進(jìn)化出來(lái)的優(yōu)異性狀防蟲(chóng)術(shù)統(tǒng)分為兩類：一類是非常直接的，稱之為“直接防御”。比如，有些植物會(huì)讓自己變得很難吃，于是蟲(chóng)子吃得就少了，或者干脆不吃了；有些植物長(zhǎng)出堅(jiān)硬鋒利的刺、毛，嚴(yán)禁蟲(chóng)子靠近，或者給自己穿上厚厚的盔甲，增強(qiáng)角質(zhì)層的厚度，增多蠟質(zhì)的合成，讓蟲(chóng)子們咬不動(dòng)；植物還可以通過(guò)改變果實(shí)和葉片的形狀、大小、顏色，改變植株性狀等進(jìn)行直接防御。另外一類植物的防御方式是間接的，稱之為“間接防御”。有的植物在遭受蟲(chóng)子襲擊的時(shí)候就釋放出一些揮發(fā)性化合物，釋放到空氣中，引誘植物的天敵前來(lái)捕食蟲(chóng)子。此外，次生代謝產(chǎn)物在植物的整個(gè)代謝活動(dòng)中都具有重要作用。大量的文獻(xiàn)表明，次生代謝物質(zhì)在植物的抗蟲(chóng)、抗病、抗逆方面起重要作用，有的次生代謝產(chǎn)物可以增強(qiáng)植物的抗蟲(chóng)性、抗病性，有的則可以作為植物逆境傳遞信號(hào)等，比如十字花科植物中特有的硫苷[5]、橡膠樹(shù)產(chǎn)生的大量橡膠[6]和甜菊葉中特有的甜菊甙[7]等都是重要的植物次生代謝產(chǎn)物。

研究表明，植物和昆蟲(chóng)的關(guān)系可以分為兩類：一類是相互受益，比如，昆蟲(chóng)給植物傳播花粉，而植物為昆蟲(chóng)提供食物然而，自然界中更普遍的植物和蟲(chóng)的關(guān)系卻是第二類——單純的取食行為。事實(shí)上，所有的植物都會(huì)被至少一種蟲(chóng)類所取食，這就是共進(jìn)化理論。植物為應(yīng)對(duì)極大的環(huán)境挑戰(zhàn)二形成了各自的防御機(jī)制，包括組成型防御，如許多植物都只是靠吸收土壤里的營(yíng)養(yǎng)而生長(zhǎng)，但豬籠草卻與眾不同——它不但靠吸收土壤里的營(yíng)養(yǎng)而生長(zhǎng)，還吸收昆蟲(chóng)里的營(yíng)養(yǎng)；或誘導(dǎo)型防御，如植物通過(guò)進(jìn)化，產(chǎn)生一系列的次生代謝物，十字花科植物就產(chǎn)生了特殊的次生代謝產(chǎn)物——硫苷，保護(hù)了自身。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，我更加深刻地認(rèn)識(shí)了植物防御機(jī)制的重要性，雖然對(duì)我來(lái)說(shuō)這個(gè)實(shí)驗(yàn)比較難，但是在指導(dǎo)老師的幫助下我學(xué)會(huì)了很多知識(shí)，比如硫苷的提取、液相色譜圖的分析、怎樣去計(jì)算硫苷含量等，都是在學(xué)校里學(xué)不到的知識(shí)。這項(xiàng)研究讓我對(duì)化學(xué)、生物產(chǎn)生了很大興趣，希望未來(lái)我也可以為我國(guó)的科研事業(yè)出一把力！