采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析靈芝孢子粉提取物中的三萜類化合物

李福森 郝建宇 王晶

摘要：以靈芝孢子粉為研究對象，通過高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，簡稱HPLC）考察不同溶劑對其三萜類化合物的提取效果。應(yīng)用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）快速對靈芝孢子粉中的三萜類化合物進(jìn)行初步鑒定。應(yīng)用超聲提取法，分別以甲醇、95%乙醇和異丙醇為提取溶劑對靈芝孢子粉中三萜類化合物進(jìn)行提取，以HPLC分析提取物，考察不同溶劑對有效成分的影響。采用LC-MS技術(shù)對提取物進(jìn)行分析，對三萜類化合物進(jìn)行快速鑒定。結(jié)果表明，通過HPLC對3種不同溶劑提取物進(jìn)行分析，確定異丙醇為靈芝孢子粉中活性成分最佳的提取溶劑。應(yīng)用LC-MS技術(shù)對提取物進(jìn)行分析，與相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行比對，對其中15種三萜類化合物進(jìn)行快速鑒定。結(jié)果表明，異丙醇適合于靈芝孢子粉中三萜類化合物的提取，提取物中含有多種三萜類化合物，LC-MS能夠快速對提取物中的化合物進(jìn)行快速的結(jié)構(gòu)鑒定。

關(guān)鍵詞：靈芝孢子粉;三萜;高效液相色譜;LC-ESI-MS

中圖分類號：R284.1 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）22-0230-04

靈芝（Ganoderma lucidum）別稱仙草，珍貴的藥用真菌，屬擔(dān)子菌綱，多孔菌科，靈芝屬。靈芝在我國有2 000多年的藥用歷史，根據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》記載，靈芝具有補(bǔ)中益氣、扶正固本、等功效[1]。靈芝傳統(tǒng)藥用部位是子實體，但靈芝孢子是靈芝生長成熟期從菌蓋彈射出來的淡霧狀的極其微小的孢子，具有靈芝的遺傳活性物質(zhì)[2]。近年來，靈芝孢子粉作為靈芝的又一藥用部位逐漸被認(rèn)識和接收。經(jīng)現(xiàn)代藥理驗證，靈芝孢子粉具有抗腫瘤、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、保肝、降血脂、降血壓、降血糖、抗缺氧能力、神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)等功效[3-4]。

國內(nèi)外學(xué)者從上世紀(jì)80年代開始深入研究靈芝的化學(xué)成分，迄今為止，已分離出200多種化合物[5]。靈芝孢子粉中的藥效成分主要是靈芝多糖、肽類、三萜類、腺嘌呤核苷、硒元素等成分，其中，三萜類化合物是其中的主要藥效成分之一。目前，三萜類化合物仍然未被充分開發(fā)利用，主要原因是天然存在的三萜類化合物含量較少，大多數(shù)不能被人工合成[6]。因此，研究靈芝孢子粉三萜化合物具有重要的現(xiàn)實意義。

以靈芝孢子粉中三萜類化合物為研究對象，考察不同溶劑對有效成分提取效果的影響，并應(yīng)用液相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對其中的成分進(jìn)行快速的分析和鑒定，以期為靈芝孢子粉這一藥用資源的研究開發(fā)提供試驗依據(jù)。

1 試驗方法

1.1 材料與儀器

靈芝孢子粉由吉林省寶源東北特產(chǎn)經(jīng)銷處提供，長春師范大學(xué)中心實驗室鑒定為多孔菌科藥用真菌靈芝（Ganoderma lucidum）所產(chǎn)生的孢子粉;甲醇、醋酸等用于色譜分析的試劑均為色譜純（加拿大Caledon LaboratoriesL Ltd.公司）;乙醇、異丙醇等用于提取試劑均為分析純（北京精細(xì)化學(xué)品有限公司）。

主要儀器有0.45 μm濾膜（美國安捷倫公司）、1100 Series HPLC高效液相色譜（美國安捷倫公司）;S180H超聲清洗器（德國Elma公司）、BS 124S電子天平（德國Sartorius AG）、Thermo LCQ Fleet離子阱LC-MS聯(lián)用儀（美國Thermo公司）。

1.2 樣品提取

精確稱取1.006 3 g靈芝孢子粉，50 mL甲醇浸泡24 h，超聲提取90 min，過濾蒸干后加2 mL色譜甲醇溶解，提取物放入4 ℃冰箱中保存，待檢測。

精確稱取1.337 5 g靈芝孢子粉，50 mL 95%乙醇浸泡 24 h，超聲提取90 min，過濾蒸干后加2 mL色譜甲醇溶解，提取物放入4 ℃冰箱中保存，待測。

精確稱取1.006 6 g靈芝孢子粉，50 mL異丙醇溶解，超聲提取90 min，蒸干后加2 mL色譜甲醇溶解，提取物放入 4 ℃ 冰箱中保存，待測。

1.3 HPLC分析條件

高效液相色譜為Agilent 1100，配備四元洗脫泵，脫氣閥，自動進(jìn)樣器，二極管陣列檢測器（diode-array detector，簡稱DAD），柱溫箱（Agilent 1200），色譜柱為Agilent-extend C18 （250×4.6 mm，5 μm）。流動相為甲醇（A）和0.5%乙酸水溶液（B），所用溶劑經(jīng)0.45 μm濾膜過濾;流速為1.0 mL/min，運行時間為30 min，進(jìn)樣量為10 μL，檢測波長252 nm。HPCL洗脫梯度如下表1。

1.4 LC-MS分析條件

利用電噴霧離子阱質(zhì)譜研究靈芝孢子粉粗提物的三萜類化合物，在負(fù)離子模式進(jìn)行分析。液相色譜（liquid chromatography，簡稱LC）分析條件：色譜柱為Agilent-extend C18 （250×4.6 mm，5 μm）;流動相為乙腈（A）和0.5%乙酸水溶液（B），洗脫梯度如表2所示;進(jìn)樣量為10 μL;檢測波長252 nm。MS分析條件：負(fù)離子模式，鞘氣（N2）流速40 arb（arbitrary unit），輔助氣（N2）流速10 arb;毛細(xì)管電壓為 3.5 kV;毛細(xì)管溫度為350 ℃;透鏡電壓為110 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 通過HPLC確定最佳提取溶劑

采用甲醇、95%乙醇、異丙醇等3種溶劑對靈芝孢子粉進(jìn)行提取，將靈芝孢子粉的提取物應(yīng)用HPLC-DAD進(jìn)行分析，得到不同溶劑提取物的色譜（圖1），其中，95%乙醇提取物與甲醇提取物的色譜圖基本一致，因此，選擇甲醇提取物的譜圖為代表。

由圖1可知，以甲醇作為提取溶劑得到譜圖的溶劑峰較高，說明提取物中極性大的雜質(zhì)較多，而在之后的梯度洗脫過程中沒有出現(xiàn)顯著的色譜圖，說明提取物中三萜類化合物含量較低;而以異丙醇作提取溶劑，得到的譜圖中溶劑峰明顯降低，說明提取物中的極性雜質(zhì)含量減少，但在洗脫過程中也出現(xiàn)多個色譜峰，說明以異丙醇為溶劑，對靈芝孢子粉中的三萜類化合物提取效果較好。

2.2 應(yīng)用LC-MS聯(lián)用儀分析靈芝孢子粉中有效成分

以異丙醇溶液作為提取溶劑，提取靈芝孢子分中有效成分，并應(yīng)用LC-MS法對靈芝孢子粉中有效成分進(jìn)行分析，得到LC-MS譜圖（圖2）。

通過優(yōu)化液相和色譜的分析條件，對靈芝孢子粉的提取物進(jìn)行了分析，對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理， 并與文獻(xiàn)[6-19]進(jìn)行對比，對其中15個主要的化合物進(jìn)行了初步定性分析。在圖2-B中，主要的[M-H]-離子峰分別為m/z 454、458、474、476、502、502、508、512、514、528、528、528、528、528、570的化合物進(jìn)行多級串聯(lián)質(zhì)譜研究，相應(yīng)化合物的分子量分別為455、459、475、477、503、503、509、513、515、529、529、529、529、529、571 u。通過整理質(zhì)譜所提供的數(shù)據(jù)，根據(jù)化合物的洗脫順序、保留時間、分子量、質(zhì)譜信息，得到可能的分子式以及初步鑒定結(jié)果見表3。

采用LC-MS技術(shù)分析得到數(shù)據(jù)，查閱文獻(xiàn)對其進(jìn)行分析，對主要的活性成分進(jìn)行了初步鑒定，根據(jù)文獻(xiàn)[9]報道，目前已知的靈芝孢子粉中三萜類化合物的母核可歸類為5種（圖3）。LC-MS的試驗結(jié)果表明，從靈芝孢子粉的異丙醇提取物中初步鑒別了15種有效成分，其中的三萜類化合物的結(jié)構(gòu)都屬于高度氧化的羊毛甾烷衍生物，其中所含的碳原子分為C30、C27和C24等3大類，在三萜酸的結(jié)構(gòu)中，環(huán)上的雙鍵大多位于Δ8（9）大部分在C11位和C23位有羧基，而且在C3、C7、C15位也有被羧基或羥基所取代。而在三萜醇、醛和過氧化物的結(jié)構(gòu)中，環(huán)大多存在2個不飽和雙鍵，其位置在Δ7（8）Δ9（11）位，C11位和C23位不存在羰基，而且環(huán)上取代基明顯減少。

3 結(jié)論

采用超聲提取法，分別以甲醇、95%乙醇、異丙醇為溶劑對靈芝孢子粉中三萜類化合物進(jìn)行提取，應(yīng)用HPLC法對提取物進(jìn)行分析，通過對色譜結(jié)果進(jìn)行對比，甲醇和95%乙醇提取物的色譜圖相似，其中溶劑峰較高，極性雜質(zhì)含量多，三萜類化合物含量較低;異丙醇的色譜圖中溶劑峰明顯降低，極性雜質(zhì)少，確定最佳提取溶劑為異丙醇。應(yīng)用LC-MS聯(lián)用技術(shù)對靈芝孢子粉中有效成分進(jìn)行分析，最后通過與相關(guān)文獻(xiàn)對比， 初步從提取物中確定了靈芝孢子粉中含有靈芝醇I、

赤芝酸J甲脂、靈芝酸C、赤芝酸C、靈芝酸V、赤芝酸D、靈芝酸Mf等15種三萜類化合物。

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