一株猴源空腸彎曲菌的鑒定及其生物學(xué)特性分析

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空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni,C.jejuni)是世界范圍內(nèi)引起腹瀉的最主要病原菌之一，尤其是對(duì)發(fā)達(dá)國家而言?？漳c彎曲菌可造成腹痛、水瀉、血便、發(fā)燒、惡心、嘔吐等不同程度的病癥，雖多為自限性疾病，但對(duì)年幼的兒童、老年人以及免疫抑制人群可能具有致命性。此外，部分人群可因感染彎曲菌而導(dǎo)致包括吉蘭巴雷綜合征(GBS)、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎(ReA)、腸易激綜合征(IBS)等多種后遺癥，給人的健康安全帶來巨大威脅[1-2]。

空腸彎曲菌是重要的食源性病原菌，其宿主范圍極為廣泛，包括禽類、人、牛、羊，犬、貓、昆蟲等，非人靈長類動(dòng)物對(duì)空腸彎曲菌也較為敏感，能產(chǎn)生不同程度的腹瀉[3]，但其傳播規(guī)律并不明確[4]。周勤[5]等人曾對(duì)我國健康實(shí)驗(yàn)猴彎曲菌感染進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果表明彎曲菌病在實(shí)驗(yàn)猴類中普遍存在，但并不表現(xiàn)臨床癥狀，調(diào)查中并未對(duì)感染猴群的菌株進(jìn)行深入的生物學(xué)特性分析。Koga[6]等人對(duì)購自亞洲國家的獼猴進(jìn)行彎曲菌檢測，發(fā)現(xiàn)中國來源的獼猴彎曲菌總檢出率為15%，空腸彎曲菌檢出率雖僅有2.5%，但根據(jù)藥敏實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)非人靈長類動(dòng)物中有多重耐藥的彎曲菌，這從人獸共患病角度考慮是一個(gè)值得關(guān)注的生物安全警示。本實(shí)驗(yàn)室在對(duì)猴群腸道致病菌進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查過程中發(fā)現(xiàn)某腹瀉實(shí)驗(yàn)猴群志賀菌和沙門菌檢出陰性，但彎曲菌檢出陽性。因此，我們對(duì)從一株分離自正處于腹瀉期的實(shí)驗(yàn)猴的肛拭樣中的空腸彎曲菌分離株進(jìn)行鑒定和生物學(xué)特性分析，以期通過對(duì)流動(dòng)性較小的實(shí)驗(yàn)猴群的流行病學(xué)監(jiān)測和相應(yīng)的空腸彎曲菌分離株的研究，探究空腸彎曲菌在猴群中的傳播規(guī)律及其致病機(jī)理。

1 材料和方法

1.1主要材料 空腸彎曲菌 NCTC11168 由遵義醫(yī)學(xué)院孫萬邦教授惠贈(zèng)；Balb/c小鼠購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心；頭孢哌酮購自LKT公司；兩性霉素B購自Wako公司；馬尿酸鈉購自國藥集團(tuán)；茚三酮購自Solarbio公司；改良CCDA培養(yǎng)基購自O(shè)XOID公司；Muller Hinton(MH)液體培養(yǎng)基購自BD公司；NH鑒定卡購自德國梅里埃公司；其余常規(guī)試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純產(chǎn)品。

1.2主要儀器 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(BRUKER)、VITEK-2 Compact 30全自動(dòng)微生物鑒定與藥敏分析系統(tǒng)(Bio Mérieux)、環(huán)境掃描電子顯微鏡為揚(yáng)州大學(xué)測試中心儀器。

1.3 細(xì)菌鑒定

1.3.1細(xì)菌多重PCR鑒定、純化 猴源分離株經(jīng)初步純化，傳代培養(yǎng)后挑取菌苔于SW中，金屬浴99 ℃加熱10 min，獲得水煮DNA模板，按何蕊[7]的方法進(jìn)行多重PCR鑒定是否為空腸彎曲菌。將初步鑒定的空腸彎曲菌挑取單菌落傳代于CCDA上，培養(yǎng)24 h后，再挑取單菌落純化3次。

1.3.2NH生化鑒定實(shí)驗(yàn) 用CCDA復(fù)蘇猴源分離株，傳代后用0.45% NaCl溶液收獲，按說明書調(diào)濁度至3.0，用NH鑒定卡在VITEK 2鑒定系統(tǒng)進(jìn)行檢測，6 h后獲取鑒定結(jié)果。

1.3.3馬尿酸鈉水解實(shí)驗(yàn) 參照國標(biāo)法進(jìn)行馬尿酸鈉水解實(shí)驗(yàn)：挑取細(xì)菌于400 μL 1%馬尿酸鈉溶液中，37 ℃水浴2 h后，沿壁緩緩加入200 μL 3.5%茚三酮，37 ℃水浴10 min，觀察是否有顏色變化，出現(xiàn)深紫色者為陽性，淡紫色或無顏色變化為陰性，用NCTC11168做陽性對(duì)照，沙門菌做陰性對(duì)照。

1.3.4質(zhì)譜鑒定 復(fù)蘇分離株并傳代。儀器校準(zhǔn)后，挑取新鮮的猴源分離株菌落，用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF)進(jìn)行指紋圖譜法鑒定細(xì)菌，NCTC11168做陽性對(duì)照菌株。

1.3.5電鏡觀察 用PBS收集生長中期的猴源分離株，2 000 r/min離心5 min，收集菌體沉淀，用2.5%戊二醛溶液輕柔重懸，4 ℃下固定2 h。取菌懸液滴于銅網(wǎng)上，室溫靜置10 min，然后用濾紙吸去樣品懸液，再在銅網(wǎng)上滴加一滴磷鎢酸，負(fù)染2 min，用濾紙吸去負(fù)染液，于室溫條件下干燥20 min后進(jìn)行電鏡觀察。在揚(yáng)州大學(xué)測試中心進(jìn)行透射電子顯微鏡觀察細(xì)菌形態(tài)，NCTC11168做對(duì)照菌株。

1.4生長曲線測定 復(fù)蘇菌株并傳代培養(yǎng)至生長對(duì)數(shù)期，用MH液體培養(yǎng)基收獲，調(diào)OD600為1.0，稀釋100倍，OD600為0.001。加1 mL稀釋后的菌液于24孔板中，2個(gè)復(fù)孔，42 ℃，130 r/min，微需氧條件下培養(yǎng)，每3 h取一塊24孔板檢測OD600，共檢測27 h。與NCTC11168進(jìn)行比較，并設(shè)純MH液體培養(yǎng)基為陰性對(duì)照。

1.5運(yùn)動(dòng)力檢測 經(jīng)復(fù)蘇、傳代后，用PBS收集生長中期的細(xì)菌，調(diào)OD600至0.8。用接種針蘸取菌液，垂直穿刺于0.4%MH半固體培養(yǎng)基中，42 ℃，微需氧條件下培養(yǎng)24 h，觀察運(yùn)動(dòng)圈大小。

1.6小鼠體內(nèi)定殖實(shí)驗(yàn) 采集6～8周齡雄性清潔級(jí)Balb/c小鼠新鮮糞便，用PBS懸浮后,取100 μL涂布于含二抗的CCDA平板[8]中，42 ℃微需氧培養(yǎng)24 h，無細(xì)菌生長，表明該小鼠體內(nèi)無彎曲菌，且在該條件下小鼠體內(nèi)雜菌不生長。提前15 min灌胃200 μL 5% NaHCO3中和胃酸，用無菌PBS收集生長中期的細(xì)菌，調(diào)OD600至1.0，取200 μL菌液進(jìn)行灌胃，每組3只，空白對(duì)照組用等量PBS灌胃。每天檢測糞便中是否帶菌，攻毒后第7天，脫頸椎致死小鼠，無菌采取肝、脾，均質(zhì)后取100 μL原液涂布計(jì)數(shù)。同時(shí)采集十二指腸、空腸、回腸、盲腸，均質(zhì)后10倍倍比稀釋，用二抗CCDA平板10 μL計(jì)數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1多重PCR鑒定 猴源分離株多重PCR鑒定結(jié)果顯示在約857 bp處和589 bp處分別有16SrRNA基因條帶和mapA基因條帶，與陽性對(duì)照一致，鑒定為空腸彎曲菌，將該空腸彎曲菌分離株命名為M166。結(jié)果見圖1。

M: DL 2000, 1:M166, P:陽性對(duì)照, N:陰性對(duì)照?qǐng)D1 M166的PCR鑒定Fig.1 PCR identification of C.jejuni isolation M166

2.2生化鑒定結(jié)果 生化鑒定 M166在VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀檢測結(jié)果表明M166有99%的可能性為空腸彎曲菌。參照國標(biāo)法判定結(jié)果，M166的馬尿酸鈉水解實(shí)驗(yàn)呈現(xiàn)深藍(lán)紫色，和NCTC11168結(jié)果一致(見圖2)，為陽性，符合空腸彎曲菌的生化特性。

圖2 馬尿酸鈉水解實(shí)驗(yàn)Fig.2 Hydrolyzation of sodium hippurate

2.3質(zhì)譜鑒定 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀對(duì)M166質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示：最高評(píng)分為2.321，大于2.3，鑒定結(jié)果十分可信，其他評(píng)分分別為2.202、2.161、2.142，均鑒定到種，結(jié)果可信，該菌鑒定為空腸彎曲菌Campylobacterjejuni。

2.4電鏡形態(tài)觀察 M166投射電鏡觀察結(jié)果如圖3A所示，菌體呈現(xiàn)彎曲、螺旋形態(tài)，菌體長度多為1～2 μm，有1～2個(gè)不等的螺旋，是典型的彎曲菌形態(tài)，且約有90%菌體含有鞭毛(鍵頭指向處)。但標(biāo)準(zhǔn)株NCTC11168結(jié)果如圖3B所示，菌體形態(tài)近乎桿狀，僅約有30%菌體有鞭毛。

圖3 透射電子顯微鏡結(jié)果Fig.3 TEM of C.jejuni

2.5生長曲線 生長曲線每3 h檢測1次，共27 h，圖4表明M166和NCTC11168的生長趨勢一致，生長對(duì)數(shù)期在前12 h，15 h后OD值繼續(xù)上漲，但24 h后進(jìn)入平臺(tái)期。M166生長速度明顯慢于NCTC11168，且生長峰值不如NCTC11168高。

圖4 M166和NCTC11168生長曲線Fig.4 Growth curve of M166 and NCTC11168

2.6運(yùn)動(dòng)力 由圖5可知，M166的運(yùn)動(dòng)圈顯著大于NCTC11168，而NCTC11168表現(xiàn)出微弱的運(yùn)動(dòng)力，表明M166的運(yùn)動(dòng)力較強(qiáng)，具有豐富的有活力的運(yùn)動(dòng)裝置。

圖5 M166和NCTC11168運(yùn)動(dòng)力檢測Fig.5 Motility of M166 and NCTC11168

2.7小鼠體內(nèi)定殖結(jié)果 小鼠糞便載菌檢測結(jié)果顯示NCTC11168感染組僅在接種后第1天有分離到空腸彎曲菌，此后6 d均無空腸彎曲菌分離出，屬于一過性排菌，但M166感染組能持續(xù)7 d排菌，且保持較高排菌量，可達(dá)105CFU/g。第7天取小鼠臟器分離細(xì)菌，在肝、脾部位均無細(xì)菌檢出，但各腸道部位分離結(jié)果如圖6所示，NCTC11168和空白對(duì)照組在腸道中均無細(xì)菌檢出，與糞便分離結(jié)果一致。M166感染組十二指腸、空腸、回腸、盲腸均能檢測到空腸彎曲菌，對(duì)數(shù)載菌量分別可達(dá)3.09±0.47，3.01±0.84，3.80±0.46，5.63±0.34 CFU/g。細(xì)菌分離并未見其他雜菌菌落生長。

圖6 小鼠腸道內(nèi)空腸彎曲菌載量Fig.6 Load of C.jejuni in mouse intestinal tracts

3 討 論

經(jīng)過多重PCR、VITEK 2生化分析、馬尿酸鈉水解實(shí)驗(yàn)、MALDI-TOF-MS質(zhì)譜鑒定、電鏡形態(tài)觀察，證明猴源分離株M166是空腸彎曲菌。VITEK 2生化鑒定空腸彎曲菌，推薦結(jié)合馬尿酸鈉水解實(shí)驗(yàn)。馬尿酸鈉水解實(shí)驗(yàn)有兩種檢測方法，分別為茚三酮法和三氯化鐵法，但茚三酮法更為快速，也是國家標(biāo)準(zhǔn)中推薦的方法。基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法(MALDI-TOF-MS)作為一種新型的利用蛋白質(zhì)譜學(xué)生物快速檢測和鑒定技術(shù)得到了較快的發(fā)展，Martiny等人[9]證明利用MALDI-TOF-MS鑒定空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌的準(zhǔn)確性可達(dá)100%，較API Campy系統(tǒng)和Vitek 2 NH鑒定卡準(zhǔn)確程度更高。本實(shí)驗(yàn)利用MALDI-TOF-MS微生物質(zhì)譜儀鑒定彎曲菌的結(jié)果也表明該方法是準(zhǔn)確、快速、重復(fù)性高的彎曲菌的鑒定方法，但因彎曲菌生長緩慢，菌落較小，多刮取菌苔上樣，故分離株需要純化后進(jìn)行鑒定。

生長曲線測定取始終處于同一培養(yǎng)條件下不同時(shí)間點(diǎn)的菌液檢測OD600，避免氧壓、溫度反復(fù)變化引起的應(yīng)激。M166和NCTC11168的生長趨勢一致，15 h后OD值繼續(xù)上漲，可能是進(jìn)入二次生長或者是由于代謝產(chǎn)物增加。運(yùn)動(dòng)力和鞭毛關(guān)系密切，M166的運(yùn)動(dòng)力顯著強(qiáng)于NCTC11168，提示NCTC11168的鞭毛活力不強(qiáng)或者鞭毛數(shù)量較少，而透射電鏡結(jié)果顯示有鞭毛的M166菌體數(shù)比NCTC11168多。而鞭毛合成是一個(gè)十分復(fù)雜并耗能的過程[10]，M166表達(dá)、組裝鞭毛，消耗較多能量物質(zhì)，限制了菌體的增殖，可能是導(dǎo)致M166在有限的MH培養(yǎng)基中生長較緩慢、生長峰值不高的原因。此外，電鏡觀察結(jié)果顯示NCTC11168為鞭毛缺陷的直桿菌，表明標(biāo)準(zhǔn)株發(fā)生了表型變異，F(xiàn)rirdich等人證實(shí)Pgp1突變株可導(dǎo)致空腸彎曲菌喪失彎曲、螺旋形態(tài)，呈現(xiàn)桿狀形態(tài)[11]，Pgp2也與此相關(guān)[12]，說明肽聚糖修飾影響空腸彎曲菌表型，螺旋形態(tài)變成桿狀可一定程度上降低運(yùn)動(dòng)力[13]。鞭毛基因經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)是易變的[14]，鞭毛出現(xiàn)缺陷可能是由于發(fā)生了基因變異。而M166具有典型的彎曲菌形態(tài)，生化特征穩(wěn)定，且運(yùn)動(dòng)性能活潑，是一株表型典型的空腸彎曲菌分離株。

由于猴類動(dòng)物的菌株回歸實(shí)驗(yàn)受限較多，空腸彎曲菌一直沒有穩(wěn)定的動(dòng)物致病模型，但小鼠常用來做定殖評(píng)價(jià)模型。根據(jù)流行病學(xué)分析表明雄性動(dòng)物對(duì)彎曲菌比雌性更易感，Walter等人[15]分析德國2001-2013年間細(xì)菌感染和性別的關(guān)系以及Kuhn等人[16]分析丹麥彎曲菌病和性別的關(guān)系中都表明男性發(fā)病率更高，故選用雄性小鼠進(jìn)行定殖實(shí)驗(yàn)。NCTC11168并不能在小鼠腸道中穩(wěn)定定殖，僅有一過性排菌現(xiàn)象，這與文獻(xiàn)報(bào)道用于測序的NCTC11168的定殖能力差的結(jié)果相符，但同時(shí)M166能在Balb/c小鼠各腸道內(nèi)穩(wěn)定定殖，且排菌期超過7 d，盲腸載菌量超過105CFU/g，雖然不如在雞盲腸中的定殖水平(108～1010CFU/g)高[17]，但也證明小鼠盲腸是M166最主要的定殖部位，這說明M166是一株有較強(qiáng)定殖能力的空腸彎曲菌。定殖能力強(qiáng)是M166在實(shí)驗(yàn)猴腸道中定殖并引起腹瀉的重要前提。雖然第一株完成全基因組測序的空腸彎曲菌是NCTC11168[14]，但后期實(shí)驗(yàn)證明其腸道定殖能力差。而NCTC11168最原始菌株具有定殖能力，但是各實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)株多為在復(fù)蘇、培養(yǎng)過程中得到是形態(tài)發(fā)生改變和/或運(yùn)動(dòng)力、定殖能力減弱的變異株[13,18]。鑒于空腸彎曲菌基因組的易變性，M166在實(shí)驗(yàn)室保存、傳代培養(yǎng)過程中，是否會(huì)出現(xiàn)定殖能力減弱的變異株需要繼續(xù)觀察。

在標(biāo)準(zhǔn)株NCTC11168普遍發(fā)生變異、致病性減弱的情況下，猴源分離株M166是對(duì)空腸彎曲菌病研究的重要生物材料補(bǔ)充，而其生物學(xué)特性、毒力和傳播規(guī)律也有待下一步深入研究，以期能有助闡明空腸彎曲菌的致病性，指導(dǎo)對(duì)空腸彎曲菌的防控。