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    鐵死亡相關(guān)蛋白在AD小鼠海馬中的表達(dá)☆

    2019-01-18 02:51:30李燕新呂占云李維郝延磊
    中國神經(jīng)精神疾病雜志 2018年12期
    關(guān)鍵詞:谷胱甘肽磷脂脂質(zhì)

    李燕新 呂占云 李維 郝延磊

    鐵死亡(ferroptosis)是一種鐵離子依賴的、以脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物和致死活性氧的積累為特點的非典型的細(xì)胞死亡方式[1]。長鏈酯酰輔酶A合成酶4(long-chain fattyacyl-CoA synthetase4,ACSL4)、谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase4,GPX4)和胱氨酸-谷氨酸反向轉(zhuǎn)運蛋白系統(tǒng)(the cystine/glutamate antiporter system Xc,XCˉ系統(tǒng))是其最重要的調(diào)控分子[2]。另外,磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白1(phosphatidylethanolamine-binding protein1,PEBP1)也在鐵死亡過程中發(fā)揮著重要的作用[3-4]。盡管全世界對阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease,AD)的研究投入了大量的人力和財力,但AD的發(fā)病機(jī)制仍然不明確。有研究顯示AD患者腦組織中存在鐵的沉積和鐵代謝的異常,提示鐵的代謝異??赡茉贏D的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[5]。目前鐵死亡的機(jī)制研究多集中于氧化損傷及鐵代謝兩方面,且谷氨酸系統(tǒng)受損、鐵代謝障礙和脂質(zhì)過氧化水平升高參與AD的發(fā)病,然而鐵死亡與AD相關(guān)性的研究相對比較少,鐵死亡相關(guān)蛋白在AD發(fā)生發(fā)展中的作用尚不清楚?;谙惹皥蟮赖腜SEN1p.G378E突變的AD家系[6-8],本研究構(gòu)建了PSEN1p.G378E敲入的AD小鼠,采用免疫印跡的方法檢測其海馬組織中鐵死亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平,以探討鐵死亡在AD中的作用。

    1 動物與方法

    1.1 實驗動物與分組我們委托賽業(yè)生物科技公司進(jìn)行了PSEN1p.G378E敲入的AD小鼠模型的構(gòu)建,于濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院SPF級實驗動物中心繁殖,根據(jù)基因測序結(jié)果將其分為WT組、PSEN1p.G378E-/+組和PSEN1p.G378E-/-組,隨機(jī)選取5月齡的三組小鼠各10只進(jìn)行實驗。

    1.2 小鼠基因型的鑒定小鼠出生2周后,剪取2~5mm的小鼠尾尖組織,按照血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN公司)的步驟提取DNA后進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR引物采用Primer5軟件設(shè)計,并通過 Primer-BLAST(http//www.ncbi.nlm.nib.gov/tools/primerblast)對照NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行引物特異性匹配,選擇合適的引物序列,由上海生工生物工程有限公司合成,F(xiàn):5’-CTGTACACACCACTTACTGACTTCTC-3’R:5’-CCCAAAAG GTTGTTCTCTGAGAG-3’, 采用30μL 的反應(yīng)體系: 包括 Taq Hot Start酶0.15μL、Buffer3μL、dNTP3μL、上下游引物(10μM)各1μL、DNA2μL及雙蒸水19.85μL。 PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3min,95℃變性30s,60℃退火30s,72℃延伸1min,共35個循環(huán),然后72℃延伸5min,4℃停止。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,檢測出目的條帶后,送上海生物工程公司測序。

    1.3 Western blot檢測鐵死亡相關(guān)蛋白的表達(dá)10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠 (0.1mL/10g)后,取小鼠新鮮海馬組織,運用液氮研磨的方法提取蛋白,測定蛋白濃度(BCA法),以RIPA裂解液調(diào)整蛋白樣本終濃度為3mg/mL。配制5%濃縮膠,10%分離膠,每孔蛋白上樣量為30μg。電泳約1.5h,轉(zhuǎn)膜90min,用5%的脫脂奶粉室溫封閉1h后, 用兔抗 GPX4多克隆抗體(Abclonal,1:2000)、兔抗 SLC7A11多克隆抗體 (Abclonal,1:2000)、兔抗 ACSL4多克隆抗體 (Abclonal,1:2000)、 兔抗PEBP1多 克 隆 抗 體 (Abclonal,1:2000)、 鼠 抗GAPDH 單克隆抗體 (Abcam,1:50000)4℃孵育過夜,二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(碧云天,1:1000)室溫孵育1h,用化學(xué)發(fā)光試劑盒(Millipore)進(jìn)行顯色曝光,分析各電泳帶灰度值,以GAPDH為內(nèi)參。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析,計量資料以(±s)表示,多個樣本均數(shù)比較先進(jìn)行方差齊性檢驗,方差齊則采用單因素方差分析,有統(tǒng)計學(xué)差異后再進(jìn)行兩兩比較(LSD檢驗),方差不齊則采用Krudkal-Wallis H檢驗。檢驗水準(zhǔn) α=0.05。

    2 結(jié)果

    2.1 小鼠基因型的鑒定根據(jù)測序峰圖,將小鼠分為三種類型:野生型(wild type,WT)、雜合型(PSEN1p.G378E-/+)、純合型(PSEN1p.G378E-/-),詳見圖1。

    2.2 鐵死亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

    2.2.1GPX4蛋白的表達(dá)情況 WT組、PSEN1p.G378E-/+組和 PSEN1p.G378E-/-組的GPX4蛋白表達(dá)具有統(tǒng)計學(xué)意義 (F=65.167,P<0.001),PSEN1p.G378E-/+組的GPX4蛋白表達(dá)量是WT組的1.54倍 (P=0.01),PSEN1p.G378E-/-組的 GPX4的蛋白表達(dá)量是 WT組的1.97倍 (P<0.001),PSEN1p.G378E-/-組比 PSEN1p.G378E-/+組增加了27.5%(P=0.002)(表1,圖2)。

    2.2.2SLC7A11蛋白的表達(dá)情況 WT組、PSEN1p.G378E-/+組和 PSEN1p.G378E-/-組的SLC7A11蛋白表達(dá)具有統(tǒng)計學(xué)意義 (F=22.390,P=0.002),PSEN1p.G378E-/+組與WT組的SLC7A11蛋白表達(dá)量無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.232),PSEN1p.G378E-/-組的SLC7A11的蛋白表達(dá)量是WT組的1.32倍(P=0.001),PSEN1p.G378E-/-組比 PSEN1p.G378E-/+組增加了23.6%(P=0.002)(表1,圖2)。

    2.2.3ACSL4蛋白的表達(dá)情況 WT組、PSEN1p.G378E-/+組和 PSEN1p.G378E-/-組的 ACSL4蛋白表達(dá)具有統(tǒng)計學(xué)意義 (F=256.262,P<0.001),PSEN1p.G378E-/+組與WT組的ACSL4蛋白表達(dá)量無明顯差異 (P=0.115),PSEN1p.G378E-/-組的ACSL4的蛋白表達(dá)量是 WT組的2.69倍 (P<0.001),PSEN1p.G378E-/-組 是 PSEN1p.G378E-/+組2.33倍(P<0.001)(表1,圖2)。

    2.2.4PEBP1蛋白的表達(dá)情況 WT組、PSEN1p.G378E-/+組和 PSEN1p.G378E-/-組的 ACSL4蛋白表達(dá)具有統(tǒng)計學(xué)意義 (F=151.691,P<0.001),PSEN1p.G378E-/+組比WT組的PEBP1蛋白表達(dá)量增 加27.6%(P=0.001),PSEN1p.G378E-/-組 的PEBP1的蛋白表達(dá)量是 WT組的1.85倍 (P<0.001),PSEN1p.G378E-/-組 是 PSEN1p.G378E-/+組1.45倍(P<0.001)(表1,圖2)。

    3 討論

    2012年DIXON等[9]首次發(fā)現(xiàn)并報道了鐵死亡這一新型細(xì)胞死亡方式,它在形態(tài)學(xué)、生化、遺傳學(xué)方面不同于其他形式的細(xì)胞死亡。脂質(zhì)過氧化是鐵死亡的重要步驟,ACSL4參與磷脂酰乙醇胺或磷脂酰肌醇等帶負(fù)電膜磷脂的合成,促進(jìn)鐵死亡[10-11],YUAN等[12]發(fā)現(xiàn) ACSL4通過增加具有脂毒性的5羥二十碳四烯酸的表達(dá)來促進(jìn)鐵死亡,可以作為鐵死亡的標(biāo)志物,ACSL4可通過脂質(zhì)改變來抑制神經(jīng)突觸的生長[13]。PEBP1又稱Raf激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitor protein,RKIP),通過與脂氧合酶結(jié)合,作用于磷脂酰乙醇胺,生成雙/三氧化磷脂酰乙醇胺,導(dǎo)致鐵死亡的發(fā)生[3-4]。PEBP1在早發(fā)型AD(early onset Alzheimer disease,EOAD)患者中的腦脊液中的表達(dá)增加[14]。與先前研究結(jié)果一致,我們發(fā)現(xiàn)ACSL4、PEBP1蛋白的表達(dá)純合組均高于雜合組和野生組,結(jié)果提示可能與AD的疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān),我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)磷酸化的Tau蛋白表達(dá)情況純合組均高于雜合和野生組(數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)。

    圖1 小鼠的基因測序圖(野生型:WT;雜合型PSEN1p.G378E-/+;純合型PSEN1p.G378E-/-)

    圖2 鐵死亡相關(guān)蛋白在三組小鼠海馬中的表達(dá)情況

    表1 海馬中GPX4、SLC7A11、ACSL4及PEBP1蛋白的相對表達(dá)水平(n=10)

    既往研究發(fā)現(xiàn),GPX4敲除小鼠的腦組織中GPX4的表達(dá)降低,海馬中可見神經(jīng)元丟失、星形膠質(zhì)細(xì)胞激活,病理特征同AD類似[15]。SLC7A11的主要作用為促進(jìn)胱氨酸的吸收,排出谷氨酸,從而促進(jìn)谷胱甘肽的合成,而谷胱甘肽是GPX4必需的輔助因子,當(dāng)其合成受阻,導(dǎo)致GPX4活性降低,細(xì)胞抗氧化能力降低,促進(jìn)鐵死亡的發(fā)生[16]。谷胱甘肽表現(xiàn)出的抗氧化作用用于AD藥物的研發(fā)[17]。與其結(jié)果不一致,我們發(fā)現(xiàn)GPX4、SLC7A11蛋白在PSEN1p.G378E敲入的AD小鼠海馬中表達(dá)增加,可能提示GPX4和SLC7A11蛋白起到保護(hù)作用。目前鐵死亡與AD的研究相對較少。ZHAGN等[18]對P301S tau轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),α-硫辛酸可降低鐵沉積、脂質(zhì)過氧化、炎癥反應(yīng)、tau磷酸化,從而改善小鼠的學(xué)習(xí)認(rèn)知能力。通過建立APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因模型[19],使用鐵螯合劑處理,表現(xiàn)出明顯的腦保護(hù)作用并改善神經(jīng)功能,表明鐵死亡參與AD的發(fā)病過程。ACSL4、PEBP1、GPX4和SLC7A11蛋白具體如何發(fā)揮作用影響AD的發(fā)生,這尚需進(jìn)一步研究。

    本實驗發(fā)現(xiàn)鐵死亡相關(guān)蛋白(GPX4、SLC7A11、ACSL4、PEBP1)在PSEN1p.G378E敲入的 AD小鼠海馬組織中的表達(dá)增加 (與正常小鼠相比),暗示鐵死亡與AD有著或多或少的聯(lián)系,但是其詳細(xì)機(jī)制尚不清楚,對于鐵死亡相關(guān)蛋白如何發(fā)揮作用促進(jìn)AD的發(fā)生發(fā)展值得我們更進(jìn)一步的研究,為AD的診斷與治療策略提供可能。

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