基于Notch1信號(hào)通路探討白藜蘆醇對(duì)人結(jié)腸上皮細(xì)胞炎癥損傷的保護(hù)作用

趙 麗，華 夏，譚 曄，胡承蓮，熊 剛

(恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院 急診科，湖北 恩施 445000)

“腸粘膜屏障”遭到破壞會(huì)引起腸道上皮粘膜的持續(xù)性受損，進(jìn)一步引發(fā)潰瘍性結(jié)腸炎[1]。然而研究報(bào)道結(jié)腸上皮細(xì)胞分化異常是導(dǎo)致腸粘膜屏障破損的主要致病機(jī)制[2-3]。早期發(fā)現(xiàn)Notch1信號(hào)傳導(dǎo)能介導(dǎo)結(jié)腸上皮細(xì)胞的分化過(guò)程[4-5]，提示Notch1信號(hào)傳導(dǎo)激活會(huì)誘發(fā)靶基因Hes-1活化而介導(dǎo)信號(hào)向下游傳導(dǎo)，誘導(dǎo)腸道祖/干細(xì)胞增殖，調(diào)控結(jié)腸上皮細(xì)胞的分化，從而修復(fù)腸粘膜屏障損傷及促使結(jié)腸上皮再生，是治療潰瘍性結(jié)腸炎的重要環(huán)節(jié)[6]。白藜蘆醇(Resveratrol，Res)主要分布于葡萄、虎杖、花生、桑葚等多種植物，在抗腫瘤、降血脂及抗炎等方面表現(xiàn)出較強(qiáng)的生物活性[7]。近期報(bào)道Res能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移及侵襲，降低了結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，起著抗腫瘤的作用[8]；還發(fā)現(xiàn)Res能通過(guò)抑制Notch1信號(hào)傳導(dǎo)降低肝缺血/再灌注損傷大鼠的炎性反應(yīng)及氧化損傷，從而起著保護(hù)作用[9]。但是Res是否通過(guò)調(diào)節(jié)Notch1信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)影響結(jié)腸上皮細(xì)胞分化尚不清楚，于是本文采用人結(jié)腸上皮(NCM460)細(xì)胞為模型，探討了Res對(duì)LPS誘導(dǎo)細(xì)胞炎性損傷的保護(hù)作用及其對(duì)Notch1信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料 SPX-250型細(xì)胞培養(yǎng)箱及DNM-9602G酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)；CX31-P型倒置顯微鏡(中國(guó)奧林巴斯公司)；BBS-V800型單人超凈臺(tái)(香港Heal Force公司)； NCM460細(xì)胞株(中國(guó)Auragene公司)；胎牛血清、1640培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)；雙抗(美國(guó)MP公司)；白藜蘆醇(湖北盛天恒創(chuàng)生物有限公司，經(jīng)HPLC測(cè)定含量高于98%)；Notch1激動(dòng)劑(NSC 22423，美國(guó)Sigma公司)；脂多糖(LPS，Sigma公司)；IL-6、IL-1β 及TNF-α ELISA試劑盒(武漢華美生物有限公司)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(武漢谷歌生物有限公司)；兔抗鼠β-actin、iNOS、COX-2、Notch1、Hes-1及Math-1一抗均購(gòu)自美國(guó)CST公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自武漢谷歌生物有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 采用1640培養(yǎng)基培養(yǎng)NCM460細(xì)胞，條件為37 ℃、5% CO2恒濕培養(yǎng)箱，待細(xì)胞長(zhǎng)滿至95%左右時(shí)用PBS清洗后加入胰酶消化，顯微鏡下觀察待細(xì)胞變圓后加入培養(yǎng)基終止消化，分裝于3個(gè)培養(yǎng)瓶進(jìn)行傳代培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較佳，用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、LPS誘導(dǎo)組、LPS+低劑量Res組、LPS+高劑量Res組、LPS+高劑量Res+NSC組。采用LPS(1 mg/L)干預(yù)細(xì)胞構(gòu)建炎性損傷模型，低、高劑量Res(40、120 μmol/L)及Notch1激動(dòng)劑NSC 22423(2 μmol/L)處理細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞及培養(yǎng)液進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.3 CCK8實(shí)驗(yàn) 按照“1.2”分組將適量密度細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)過(guò)夜后進(jìn)行相關(guān)藥物干預(yù)，24 h后棄去舊培養(yǎng)液，每孔加入10 μL CCK8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，在酶標(biāo)儀中于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A值，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞相對(duì)存活率(%)=A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組×100%。

1.4 ELISA實(shí)驗(yàn) 按照“1.2”分組將適量密度細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行相關(guān)藥物干預(yù)，24 h后收集培養(yǎng)液及細(xì)胞，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞培養(yǎng)液用于ELISA檢測(cè)，細(xì)胞用于Western Blot檢測(cè)。細(xì)胞培養(yǎng)液中炎性因子IL-6、IL-1β及TNF-α水平檢測(cè)步驟按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。具體操作如下：將細(xì)胞培養(yǎng)液離心，取標(biāo)準(zhǔn)品及標(biāo)本上清100 μL加入酶標(biāo)板中，37 ℃孵育2 h；棄去上清液，加入100 μL生物素化抗體工作液，37 ℃孵育1 h；洗滌3次，加入100 μL酶結(jié)合物工作液，37 ℃孵育1 h；洗滌5次，加入90 μL底物溶液，37 ℃孵育10 min；加入50 μL終止液；5 min內(nèi)在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量OD值。

1.5 Western blot實(shí)驗(yàn) 將“1.4”項(xiàng)收集的細(xì)胞用RIPA裂解液冰上充分裂解制備勻漿，超聲破碎、12 000 rpm離心12 min后收集上清，BCA試劑盒測(cè)定上清蛋白濃度。每個(gè)樣本上樣50 μg進(jìn)行凝膠電泳，待蛋白完全分離后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜實(shí)驗(yàn)。結(jié)束后加入5%脫脂奶粉封閉液于搖床上室溫封閉1h后，分別加入iNOS、COX-2、Notch1、Hes-1及Math-1抗體(體積稀釋比例均為1∶1 000)4 ℃反應(yīng)過(guò)夜。次日TBST洗膜3次后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(體積稀釋比例為1∶3 000)，室溫反應(yīng)1 h。再用TBST洗膜3次，每次10 min，以ECL試劑顯影后進(jìn)行蛋白條帶灰度值分析。每組設(shè)置1個(gè)復(fù)孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，以β-actin作為內(nèi)參，蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

2 結(jié)果

2.1 Res對(duì)NCM460細(xì)胞增殖的影響 CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示LPS干預(yù)能明顯抑制NCM460細(xì)胞增殖，而不同劑量Res能促使NCM460細(xì)胞增殖，其相對(duì)存活率顯著高于LPS誘導(dǎo)組(P<0.05)；然而加入Res和NSC共同孵育NCM460細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞相對(duì)存活率與LPS誘導(dǎo)組相比沒(méi)有明顯差異(P>0.05，見(jiàn)圖1)。

2.2 Res對(duì)NCM460細(xì)胞培養(yǎng)液中炎性因子釋放的影響 ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：LPS干預(yù)能明顯促使NCM460細(xì)胞分泌炎性因子IL-6、IL-1β及TNF-α，細(xì)胞培養(yǎng)液中炎性因子水平顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)；NCM460細(xì)胞經(jīng)過(guò)低、高劑量Res處理后培養(yǎng)液中IL-6、IL-1β及TNF-α水平相對(duì)LPS誘導(dǎo)組顯著降低(P<0.05)；而經(jīng)Res和NSC共同干預(yù)后培養(yǎng)液中炎性因子水平與LPS誘導(dǎo)組相比沒(méi)有顯著差異(P>0.05，見(jiàn)表1)。

與空白對(duì)照組比較，*:P<0.05；與LPS誘導(dǎo)組比較，#:P<0.05；與LPS+高劑量Res組比較，+:P<0.05。圖1 各組細(xì)胞相對(duì)存活率比較

表1各組炎性因子水平比較

組別IL-6(pg/mL)IL-1β(pg/mL)TNF-α(pg/mL)空白對(duì)照612.6±104.760.8±11.486.3±12.4LPS誘導(dǎo)1526.4±295.4?156.4±28.6?182.6±17.3?LPS+低劑量Res1131.5±253.9#116.3±21.5#136.1±15.2#LPS+高劑量Res825.7±185.6#76.4±14.6#103.8±12.7#LPS+高劑量Res+NSC1452.8±305.7+160.8±31.4+195.6±20.7+

與空白對(duì)照組比較，*：P<0.05；與LPS誘導(dǎo)組比較，#：P<0.05；與LPS+高劑量Res組比較，+：P<0.05。

2.3 Res對(duì)NCM460細(xì)胞iNOS及COX-2蛋白表達(dá)的影響 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：LPS干預(yù)能明顯促使NCM460細(xì)胞表達(dá)炎性蛋白iNOS及COX-2，細(xì)胞中炎性蛋白iNOS及COX-2表達(dá)顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)；NCM460細(xì)胞經(jīng)過(guò)低、高劑量Res處理后細(xì)胞中炎性蛋白iNOS及COX-2表達(dá)相對(duì)LPS誘導(dǎo)組顯著降低(P<0.05)；而經(jīng)Res和NSC共同干預(yù)后細(xì)胞中炎性蛋白iNOS及COX-2表達(dá)與LPS誘導(dǎo)組相比沒(méi)有顯著差異(P>0.05，見(jiàn)圖2)。

與空白對(duì)照組比較，*：P<0.05；與LPS誘導(dǎo)組比較，#：P<0.05；與LPS+高劑量Res組比較，+：P<0.05；A:Western blot檢測(cè)iNOS、COX-2、β-actin蛋白的表達(dá)水平;B：各組iNOS/β-actin蛋白的表達(dá)比較;C:各組COX-2/β-actin蛋白的表達(dá)比較。圖2 各組間iNOS及COX-2蛋白表達(dá)比較

2.4 Res對(duì)NCM460細(xì)胞Notch1、Hes-1及Math-1蛋白表達(dá)的影響 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：LPS干預(yù)能明顯促使NCM460細(xì)胞表達(dá)Notch1和Hes-1、抑制Math-1蛋白表達(dá)(P<0.05)；NCM460細(xì)胞經(jīng)過(guò)低、高劑量Res處理后細(xì)胞中Notch1和Hes-1表達(dá)相對(duì)LPS誘導(dǎo)組顯著降低，而Math-1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；而經(jīng)Res和NSC共同干預(yù)后細(xì)胞中Notch1、Hes-1及Math-1蛋白表達(dá)與LPS誘導(dǎo)組相比沒(méi)有顯著差異(P>0.05，見(jiàn)圖3)。

與空白對(duì)照組比較，*:P<0.05；與LPS誘導(dǎo)組比較，#:P<0.05；與LPS+高劑量Res組比較，+:P<0.05；A：Western blot檢測(cè)Notch1、Hes-1、Math-1、β-actin蛋白的表達(dá)水平;B：各組Notch1/β-actin蛋白的表達(dá)比較;C:各組Hes-1/β-actin蛋白的表達(dá)比較;D:各組Math-1/β-actin蛋白的表達(dá)比較。圖3 各組間Notch1、Hes-1及Math-1蛋白表達(dá)比較

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎屬于常見(jiàn)的消化道疾病，主要表現(xiàn)為結(jié)腸粘膜持續(xù)性損傷，其可能的病理機(jī)制與腸上皮細(xì)胞分化異常有關(guān)。因此，本文采用NCM460細(xì)胞株為模型探討了白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞炎性損傷及相關(guān)分化蛋白表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)Res能促使NCM460細(xì)胞增殖，并降低細(xì)胞培養(yǎng)液中炎性因子IL-6、IL-1β及TNF-α的釋放，并抑制細(xì)胞中炎癥蛋白iNOS及COX-2表達(dá)。

早期報(bào)道腸道上皮細(xì)胞分化受多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)影響，主要包括Notch、Wnt及BMP等[10]，然而研究證實(shí)Notch1蛋白是結(jié)腸上皮層分化、再生的關(guān)鍵性解控因子，在調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞增殖、分化、維持上皮層微環(huán)境穩(wěn)定及維持上皮層抗菌信號(hào)通路的活性等方面具有重大作用[11]。研究發(fā)現(xiàn)Notch1基因表達(dá)水平能夠關(guān)鍵性調(diào)控腸道上皮細(xì)胞中分泌型及吸收型細(xì)胞的命運(yùn)[12]。Notch1作用的下游靶基因?qū)儆趬A式螺旋-環(huán)-螺旋家族轉(zhuǎn)錄因子，而Hes-1及Math-1屬于介導(dǎo)人類腸道上皮細(xì)胞分化方向的關(guān)鍵因子[13]，Hes-1蛋白高表達(dá)可誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞分化為吸收型細(xì)胞，Math-1蛋白高表達(dá)可誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞分化為分泌型細(xì)胞。當(dāng)Notch1信號(hào)傳導(dǎo)活化時(shí)可誘導(dǎo)Hes-1蛋白表達(dá)升高、Math-1蛋白表達(dá)降低，從而誘導(dǎo)吸收型細(xì)胞增多、分泌型細(xì)胞減少，改變了腸上皮細(xì)胞功能[14]。分泌型細(xì)胞可分泌黏蛋白、上皮結(jié)膜蛋白、三葉因子多肽及抵抗素樣因子β、Fc-γ結(jié)合蛋白等，這些因子在腸道上皮層起著防御作用，可抵制腸道內(nèi)微生物的侵害[15]。研究發(fā)現(xiàn)在潰瘍性結(jié)腸炎部位分泌型細(xì)胞數(shù)明顯減少，而且上述因子表達(dá)水平也明顯降低，破壞了上皮層正常的防御功能，從而引起微生物入侵導(dǎo)致炎性反應(yīng)[16]。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，Res對(duì)Notch1信號(hào)通路有一定的調(diào)節(jié)作用，能夠抑制Notch1的活化，進(jìn)一步抑制Hes-1蛋白表達(dá)、誘導(dǎo)Math-1蛋白表達(dá)，從而促使細(xì)胞向分泌型分化，降低LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。并且采用Notch1激動(dòng)劑與Res共同干預(yù)細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)Notch1激動(dòng)劑能夠逆轉(zhuǎn)Res對(duì)Notch1蛋白表達(dá)的抑制作用，說(shuō)明Res可能通過(guò)Notch1信號(hào)通路調(diào)節(jié)結(jié)腸上皮細(xì)胞的分化及炎癥反應(yīng)。激動(dòng)劑誘導(dǎo)Notch1信號(hào)通路活化及相關(guān)蛋白表達(dá)，Res能夠抑制Notch1信號(hào)通路活化及相關(guān)蛋白表達(dá)，可能是二者競(jìng)爭(zhēng)性與Notch1結(jié)合，哪個(gè)結(jié)合能力更強(qiáng)，那么發(fā)揮的相關(guān)作用就越顯著。本文發(fā)現(xiàn)Notch1激動(dòng)劑能夠逆轉(zhuǎn)Res對(duì)Notch1蛋白表達(dá)的抑制作用，說(shuō)明該激動(dòng)劑與Notch1相互作用的強(qiáng)度更強(qiáng)。綜上所述，Res可通過(guò)Notch1信號(hào)通路調(diào)節(jié)人結(jié)腸上皮細(xì)胞的增殖和分化，對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎具有保護(hù)作用。