家兔CETP基因多態(tài)性與肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析

王 杰，黨樹璋，羅 剛，賈先波， 陳仕毅， 賴松家*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物遺傳研究所，成都 611130）

CETP基因編碼血漿膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白（cholesteryl ester transfer protein，CETP），參與了膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)和高密度脂蛋白-膽固醇（HDL-C）的代謝，被認(rèn)為是影響人類健康長壽的重要候選基因[1]。研究表明[2-4]，豬的CETP基因位于6號染色體，在脂肪代謝轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中具有重要作用，被認(rèn)為是影響動物體脂沉積、生產(chǎn)性能的候選基因。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織調(diào)查，兔肉在歐洲許多國家，如意大利、捷克、西班牙、比利時(shí)、盧森堡、葡萄牙、法國，還有一些北非國家（埃及、阿爾及利亞）受到消費(fèi)者的青睞，兔肉生產(chǎn)在國民經(jīng)濟(jì)中發(fā)揮著重要作用[5-6]。兔肉能提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，首先蛋白含量很高，尤其是限制性氨基酸水平較高。家兔背最長肌和后腿的蛋白含量高達(dá)22%。同時(shí)礦物質(zhì)、維生素、抗氧化因子含量高，而兔肉膽固醇和脂肪含量低，被認(rèn)為是消費(fèi)者首選的功能性食品[5]。但是，家兔育種，尤其是我國的肉質(zhì)育種方向研究滯后，國外優(yōu)良的家兔配套系在我國未得到大面積推廣，國內(nèi)也未見培育效果好的配套系，家兔的分子育種研究少之又少[7]。迄今為止，未見CETP基因在家兔育種方面的研究報(bào)道。為此，本研究以3個家兔品種為材料，采用PCR產(chǎn)物直接測序技術(shù)，探討CETP基因?qū)彝萌赓|(zhì)性狀的影響，以期為家兔肉質(zhì)早期育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)356份兔耳組織樣品（伊拉兔124只，香檳兔143只，天府黑兔89只）采集于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)家兔實(shí)驗(yàn)場，并于-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩１緦?shí)驗(yàn)家兔在70日齡屠宰，耳組織樣品按試劑盒（Axygen，USA）提供的方法提取全基因組DNA，并將其保存于-20℃冰箱，實(shí)驗(yàn)所用家兔背最長肌和后腿肌樣品保存于4℃冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 肉質(zhì)性狀測定的方法

家兔屠宰率按常規(guī)方法計(jì)算。pH值測定采用pH儀（Model PH-STAR CPU，MeisterR，Germany）完成，測定探針深入肌肉3cm；肉色測定采用R.L.Van Laack等報(bào)道的比色體系[8]，數(shù)據(jù)由亮度（L*），紅度（a*）和黃度（b*）組成。pH和肉色測定兩次，分別為剛屠宰的肉和屠宰后24 h的肉。肌內(nèi)脂肪（intermucal fat，IMF）采用矯正的Soxhlet方法[9]測定剛屠宰的肌肉。

1.2.2 PCR 與測序

根據(jù)Ensembl報(bào)道的家兔CETP基因序列NO.ENSOCUG00000013137采用Premier 5軟件設(shè)計(jì)一對引物：CETP-F：TCCACTTGTTCCCTCAGCCTC 和CETP-R：CAGCGGCTGTGTACTCACTCG。PCR反應(yīng)采用25 μL反應(yīng)體系：50 ng全基因組DNA，上下游引物各 1 μmol/L，1.5 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTPs（dATP，dTTP，dCTP 和 dGTP），0.4 個單位的 Taq DNA聚合酶（MBI），2.5 μL 的 100×buffer。PCR 擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性 5 min；40個循環(huán)，94℃ 45 s，56℃ 45 s；72℃ 40 s；最后72℃延長10 min。PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。擴(kuò)增效果良好的PCR產(chǎn)物送上海英駿生物技術(shù)有限公司純化測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 基因多態(tài)性分析

采用DNAstar軟件進(jìn)行序列對比判斷突變位點(diǎn)及其基因型，并進(jìn)一步計(jì)算得到基因型和基因型頻率。利用POPGENE軟件測試哈溫平衡的χ2值。多態(tài)信息含量（PIC）通過下列公式計(jì)算得到。PIC＞0.5為高度多態(tài)；0.25＜PIC＜0.5 為中度多態(tài)；PIC＜0.25 為低度多態(tài)。

1.3.2 基因型與家兔屠體性狀關(guān)聯(lián)分析

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS 21（IBM，Armonk，NY，USA）中一般線性模型（GLM）進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，分析的線性模型為：Yijk=μ+Gi+Sj+eijk，Yijk為個體性狀觀測值，μ為個體性狀均值，Gi為基因型效應(yīng)，Sj為個體性別效應(yīng)，eijk為隨機(jī)誤差效應(yīng)。數(shù)據(jù)計(jì)算方式均采用最小二乘法和標(biāo)準(zhǔn)誤，并用Bonferroni T檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 家兔CETP基因多態(tài)性

實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在CETP基因的第4外顯子的第11 bp處發(fā)生了單核苷酸變異，產(chǎn)生3種基因型為AA、GG和AG，見圖1。3個家兔群體的基因多態(tài)性分析結(jié)果，見表1。由表1可以看出，GG為優(yōu)勢基因型，G為優(yōu)勢基因。最小等位基因頻率變化范圍為：0.363 6～0.421 3，表示該突變位點(diǎn)較多態(tài)。多態(tài)信息含量PIC結(jié)果顯示，本研究的3個家兔群體均處于中度多態(tài)，能表現(xiàn)出明顯的群體特征。而且χ2檢測結(jié)果顯示家兔群體偏離哈溫平衡，表示3個家兔群體均未達(dá)到遺傳平衡的狀態(tài)。

圖1 家兔CETP基因型測序圖譜Figure 1 Sequencing map of three genotypes of the rabbit CETP gene

2.2 家兔CETP基因多態(tài)與屠體性狀的關(guān)聯(lián)分析

3個家兔群體不同基因型與屠宰率的相關(guān)分析結(jié)果，見表2。可以看出，不同基因型家兔全凈膛屠宰率差異不顯著（P＞0.05），但 GG 和 AG 基因型的全凈膛屠宰率數(shù)值高于AA基因型。GG基因型家兔的半凈膛屠宰率最高，與AA和AG基因型差異顯著（P＜0.05）。

不同基因型與家兔背最長肌肉質(zhì)性狀的相關(guān)分析結(jié)果，見表3?？梢钥闯觯珹A基因型的新鮮兔肉的紅度最高，與GG和AG基因型的紅度差異顯著（P＜0.05）。而且，AA 基因型的 24 h 肉的紅度也最高，與 AG 基因型差異不明顯（P＞0.05），但與 GG 基因型差異顯著（P＜0.05）。AG基因型的兔背最長肌肌內(nèi)脂肪含量最高，而且與AA基因型差異顯著（P＜0.05）。

表3 家兔CETP基因多態(tài)性與背最長肌肉質(zhì)性狀的相關(guān)分析Table 3 Association between SNP of CETP gene and meat traits in rabbit longissimus dorsi muscle

不同基因型與家兔后腿肌肉質(zhì)性狀的相關(guān)分析結(jié)果，見表4?？梢钥闯觯珹G基因型新鮮兔肉亮度最大，與 AA、GG 基因型亮度差異顯著（P＜0.05）。AA基因型24 h兔肉紅度最大，與GG和AG基因型差異顯著（P＜0.05）。AA基因型的家兔后腿肌內(nèi)脂肪含量最高，與 AG 基因型差異顯著（P＜0.05），但與 GG基因型差異不顯著（P＞0.05）。

表4 家兔CETP基因多態(tài)性與后腿肌肉質(zhì)性狀的相關(guān)分析Table 4 Association between SNP of CETP gene and meat traits in rabbit biceps femoris muscle

3 討論

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，家兔CETP基因的3種基因型明顯影響了屠宰率。無論是全凈膛屠宰率還是半凈膛屠宰率，GG基因型的數(shù)值都是最高的。說明了GG基因型可有效提高家兔的屠宰率，G等位基因可能具有提高屠宰率的作用。pH值、肉色和肌內(nèi)脂肪是衡量肉質(zhì)最重要的標(biāo)準(zhǔn)。無論是新鮮的還是儲存24 h的背最長肌和后腿肌，其pH值不受核苷酸變異的影響（P＞0.05），但儲存 24 h 的肉，pH 值均會下降，這與F.Hulot和J.Ouhayoun研究結(jié)果[10]一致，家兔剛屠宰時(shí)兔肉pH值接近中性，但屠宰后會迅速下降。而且，C.P.Zeferino等[11]發(fā)現(xiàn)儲存24小時(shí)和48小時(shí)的兔肉pH值沒有顯著變化。肉色研究結(jié)果與 G.A.María 等[12]的研究一致，本研究只是發(fā)現(xiàn)CETP基因顯著影響了家兔的兩個時(shí)間的背最長肌紅度（P＜0.05），且 AA 基因型紅度最大，AG 型次之，GG型最小。CETP基因只對后腿肌的L*0h和a*24h有顯著影響（P＜0.05）。與豬肉相比，無論是背最長肌還是后腿肌的肌內(nèi)脂肪都是最低的[13]，本研究發(fā)現(xiàn)CETP基因變異對家兔背最長肌和后腿肌的肌內(nèi)脂肪均有顯著影響（P＜0.05），值得一提的是，家兔背最長肌AG基因型肌內(nèi)脂肪數(shù)值最高，與AA基因型差異顯著（P＜0.05），后腿肌卻相反，AA 基因型肌內(nèi)脂肪數(shù)值最高，與AG基因型差異顯著（P＜0.05），其原因有待于進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)CETP基因第4外顯子第11 bp處有3個基因型，且G為優(yōu)勢等位基因。該變異位點(diǎn)顯著影響了家兔半凈膛屠宰率，背最長肌的紅度。同時(shí)，該變異位點(diǎn)顯著影響了家兔背最長肌和后腿肌的肌內(nèi)脂肪含量。由此可以推測，CETP基因可能是影響家兔肉質(zhì)性狀育種的候選基因。