利用WGCNA進(jìn)行玉米花期基因共表達(dá)模塊鑒定

楊宇昕 桑志勤,2 許 誠(chéng) 代文雙 鄒 棖,*

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利用WGCNA進(jìn)行玉米花期基因共表達(dá)模塊鑒定

楊宇昕1桑志勤1,2許 誠(chéng)1代文雙1鄒 棖1,*

1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 北京 100081;2新疆農(nóng)墾科學(xué)院, 新疆石河子 832000

權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(weighted gene co-expression network analysis, WGCNA)是系統(tǒng)生物學(xué)的一種研究方法, 在挖掘生物學(xué)數(shù)據(jù)與特定性狀之間的生物學(xué)關(guān)系方面具有十分重要的作用。本研究利用玉米(L.)自交系B73的14份不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù), 篩選掉低表達(dá)豐度的基因, 最終得到了22,426個(gè)高表達(dá)的基因用于創(chuàng)建基因表達(dá)矩陣; 利用不同組織作為性狀, 創(chuàng)建表型矩陣。然后利用R軟件中的WGCNA包建立了共表達(dá)網(wǎng)絡(luò), 共得到20個(gè)模塊。本研究將與組織相關(guān)性高于0.65的模塊定義為組織特異性模塊, 最終鑒定到14個(gè)組織特異性模塊。利用在線網(wǎng)站Agrigo對(duì)組織特異性模塊中的基因進(jìn)行GO (gene ontology)富集分析, 發(fā)現(xiàn)14個(gè)模塊中均可以得到富集種類(lèi)。開(kāi)花作為玉米生育周期中的一個(gè)重要生理過(guò)程, 不僅代表著植物從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變, 也關(guān)系到產(chǎn)量、株高和抗逆性等農(nóng)藝性狀。本研究發(fā)現(xiàn)8個(gè)組織特異性模塊中的基因可以富集到與開(kāi)花調(diào)控的代謝通路。此外, 有17個(gè)已經(jīng)報(bào)道過(guò)的開(kāi)花時(shí)間調(diào)控基因存在于共表達(dá)模塊中, 并且主要分布在Blue模塊和Darkmagenta模塊, 因此本研究重點(diǎn)關(guān)注了這2個(gè)模塊內(nèi)部的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本研究通過(guò)計(jì)算不同組織中的基因表達(dá)豐度, 并聯(lián)合權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析的方法, 鑒定到了具有生物學(xué)意義的共表達(dá)基因模塊, 挖掘到了數(shù)個(gè)開(kāi)花相關(guān)的模塊, 有助于揭示玉米開(kāi)花調(diào)控的遺傳機(jī)制。

玉米; 權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò); 發(fā)育調(diào)控; 開(kāi)花; 轉(zhuǎn)錄組

近年來(lái), 隨著高通量測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展與成本不斷的降低, 越來(lái)越多的研究人員采用多樣本的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序進(jìn)行生物學(xué)問(wèn)題的研究。用多樣本的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可以系統(tǒng)地研究復(fù)雜條件下(例如多個(gè)組織、多個(gè)環(huán)境、多試驗(yàn)變量)的生物學(xué)問(wèn)題, 然而傳統(tǒng)的兩個(gè)樣本的相關(guān)性比較方法已經(jīng)不能有效的處理海量的生物學(xué)數(shù)據(jù)。面對(duì)這個(gè)問(wèn)題, 網(wǎng)絡(luò)研究的方法脫穎而出, 當(dāng)前生物學(xué)研究中廣泛應(yīng)用的網(wǎng)絡(luò)研究方法有基因網(wǎng)絡(luò)[1]、蛋白質(zhì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[2]和代謝網(wǎng)絡(luò)[3]等。借助于基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的快速發(fā)展, 基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在理論和實(shí)踐層面都取得了較快的發(fā)展。在基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中, 應(yīng)用較廣泛的是權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。前人研究指出, 權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部的基因聯(lián)通符合無(wú)尺度的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu), 即網(wǎng)絡(luò)中少數(shù)基因作為網(wǎng)絡(luò)中的核心節(jié)點(diǎn)與大部分基因具有聯(lián)系, 該過(guò)程的實(shí)現(xiàn)依賴(lài)于對(duì)基因間的連接系數(shù)進(jìn)行冪函數(shù)處理, 使網(wǎng)絡(luò)逐漸趨向無(wú)尺度分布[4]。因此借助網(wǎng)絡(luò)分析, 可以有效地利用海量的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù), 將眾多基因劃分為相似的基因表達(dá)模塊進(jìn)行研究。權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(weighted gene co-expression network analysis, WGCNA)根據(jù)基因表達(dá)水平的不同將基因聚類(lèi), 具有相似表達(dá)模式的基因被劃分到同一個(gè)模塊中。其目的在于研究共表達(dá)模塊和目標(biāo)性狀之間的生物學(xué)相關(guān)性、鑒定組織特異性模塊并研究模塊內(nèi)的核心基因。WGCNA作為一種系統(tǒng)生物學(xué)方法, 已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多樣本的生物學(xué)問(wèn)題研究當(dāng)中。例如在動(dòng)物中, 研究人員利用四個(gè)年齡段的恒河猴[5](L.), 分別選取8個(gè)組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序, 通過(guò)將不同的lncRNA和mRNA分為不同的模塊, 闡釋了lncRNA-lncRNA, lncRNA-mRNA基因間的共表達(dá)關(guān)系。WGCNA也廣泛應(yīng)用在植物研究中, 為了研究油菜(L.)在干旱處理?xiàng)l件下的mRNA的表達(dá)模式[6], 研究人員利用干旱和對(duì)照處理下的48個(gè)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建, 進(jìn)一步鑒定到與干旱處理相關(guān)的生物學(xué)模塊, 并且挖掘了目標(biāo)模塊內(nèi)的核心基因。在對(duì)草莓(L.)花的研究中[7], 研究者選取了6個(gè)組織, 12個(gè)發(fā)育時(shí)期的樣品, 進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序進(jìn)而得到了共表達(dá)網(wǎng)絡(luò), 在特異性模塊中鑒定到了大量的轉(zhuǎn)錄因子作為模塊中的核心基因, 對(duì)促進(jìn)花芽分化具有重要的作用, 此外該研究還表明WGCNA比K-MEAN聚類(lèi)更具有特異性, 這是因?yàn)閃GCNA構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)符合無(wú)尺度拓?fù)浞植? 因此可以得到更多的具有生物學(xué)意義的模塊。

玉米開(kāi)花是一個(gè)多基因控制的數(shù)量性狀, 代表了玉米從生殖生長(zhǎng)到營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變。開(kāi)花是玉米生育周期中的重要農(nóng)藝性狀, 關(guān)系到葉片數(shù)量、產(chǎn)量、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值以及抗逆性等性狀。近年來(lái), 研究人員利用分子生物學(xué)的方法, 已經(jīng)在玉米中鑒定到了數(shù)十個(gè)開(kāi)花調(diào)控基因。例如, 通過(guò)數(shù)量性狀位點(diǎn)定位, 已經(jīng)克隆了數(shù)個(gè)開(kāi)花調(diào)控基因, 包括[8]、[9]和[10]。研究人員結(jié)合突變體分析和轉(zhuǎn)基因技術(shù)鑒定到了在玉米中的同源基因[11], 研究結(jié)果表明是一個(gè)開(kāi)花促進(jìn)因子, 該基因在葉片中表達(dá)并通過(guò)韌皮部運(yùn)送到玉米的頂端分生組織, 在頂端分生組織中與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合, 進(jìn)而激活開(kāi)花促進(jìn)因子[12], 而的表達(dá)則標(biāo)志著玉米開(kāi)始從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變到生殖生長(zhǎng)。此外, 有研究使用5000份重組玉米自交系進(jìn)行巢式關(guān)聯(lián)分析, 鑒定到數(shù)十個(gè)參與光周期調(diào)控的候選基因[13]。隨著玉米參考基因組以及單倍型圖譜的相繼構(gòu)建完成, 利用重測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組和代謝組等生物信息學(xué)手段研究玉米的農(nóng)藝性狀已經(jīng)成為一個(gè)有力的手段, 然而前人的研究著眼于單個(gè)調(diào)控因子(如順式表達(dá)元件, 反式作用因子), 鮮有利用網(wǎng)絡(luò)分析的方法解析玉米開(kāi)花遺傳機(jī)制的報(bào)道。

本研究利用玉米14個(gè)不同組織的RNA-seq數(shù)據(jù), 計(jì)算得到全基因組水平上的基因表達(dá)量, 進(jìn)而構(gòu)建了具有高度拓?fù)湫再|(zhì)的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò), 得到了基因共表達(dá)模塊, 并進(jìn)一步篩選到了與組織高度關(guān)聯(lián)的共表達(dá)模塊。通過(guò)對(duì)組織特異性模塊的基因富集分析發(fā)現(xiàn)了具有生物學(xué)功能的模塊。此外, 結(jié)合富集分析的結(jié)果, 鑒定到了數(shù)個(gè)與開(kāi)花調(diào)控相關(guān)的模塊。本研究利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)得到了開(kāi)花相關(guān)的共表達(dá)模塊, 挖掘了模塊內(nèi)的開(kāi)花相關(guān)的調(diào)控基因, 為玉米開(kāi)花的遺傳機(jī)制解析提供了新的研究思路和實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 玉米轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲取與分析

玉米不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來(lái)源于NCBI(national center for biotechnology information)的SRA (Sequence Read Archive)數(shù)據(jù)庫(kù), 獲取碼為PRJNA171684[14]。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來(lái)源于葉片、頂端分生組織、花絲、花藥、果穗等組織。首先利用SRAtoolkit軟件的fast-dump參數(shù)將高通量測(cè)序數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)變?yōu)镕astq文件, 利用FastQC[15]軟件對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估, 接著利用Trimmomatic軟件去除接頭、低質(zhì)量和未知堿基數(shù)目過(guò)多的reads, 得到clean reads。參考Pertea流程[16], 利用Hisat2軟件將clean reads比對(duì)到玉米B73參考基因組。玉米參考基因組序列和注釋信息下載自ensemble數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)布的玉米基因組信息(ftp://ftp.ensemblgenomes.org/ pub/plants/release-27/genbank/zea_mays/), 利用Stringtie軟件對(duì)轉(zhuǎn)錄本組裝, 之后采用R軟件的Ballgown包計(jì)算基因在每一個(gè)組織中的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量。使用FPKM (fragments per kilobase of exon per million fragments mapped, 每千堿基外顯子百萬(wàn)片段數(shù))值來(lái)衡量基因的表達(dá)水平。

1.2 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

基因的表達(dá)譜矩陣來(lái)自所有樣本的基因表達(dá)量?？紤]到在各個(gè)組織中均低表達(dá)的基因不具有生物學(xué)意義, 在后續(xù)的計(jì)算中還會(huì)增加運(yùn)算量, 因此為了保證共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的特異性和快捷性, 基因在各個(gè)組織中的最大FPKM值小于5的將被過(guò)濾[17-18]。首先, 構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)需要計(jì)算每2個(gè)基因間的相關(guān)系數(shù), 進(jìn)而得到相似矩陣。使用公式表示如下: Smn=cor(xm, xn), S=[Smn], 式中Smn表示基因m和基因n之間的皮爾森相關(guān)系數(shù), S表示相似矩陣。

R軟件中的WGCNA包提供了一系列函數(shù)用來(lái)構(gòu)建權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)[19-20]。為了使網(wǎng)絡(luò)符合無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)分布, 需要選擇合適的權(quán)重值, 利用WGCNA包中的函數(shù)pickSoftThreshold計(jì)算權(quán)重值。根據(jù)圖1的結(jié)果, 選擇軟閾值β=14用來(lái)構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò), 在該參數(shù)下每個(gè)基因的平均鄰接系數(shù)是280, 中位數(shù)是165, 最大連接系數(shù)是1140。鄰接矩陣的計(jì)算公式為Amn=[(1+Smn)/2]β, 為了清除背景噪音和偽關(guān)聯(lián)帶來(lái)的誤差, 將鄰接矩陣轉(zhuǎn)為拓?fù)渲丿B矩陣(Topological Overlap Matrix, TOM), 同時(shí)利用函數(shù)dissTom=1–TOM對(duì)拓?fù)渲丿B矩陣取逆得到相異性矩陣。利用函數(shù)hclust對(duì)相異矩陣進(jìn)行層次聚類(lèi)。針對(duì)產(chǎn)生的聚類(lèi)樹(shù), 采用動(dòng)態(tài)切割 (Dynamic Tree Cut) 法切割基因聚類(lèi)樹(shù), 相關(guān)參數(shù)為minModuleSize=30, 該過(guò)程可以把表達(dá)模式相近的基因合并在同一個(gè)分支, 每一個(gè)分支代表一個(gè)共表達(dá)模塊(圖2)。

圖1 軟閾值確定

圖中的橫軸均代表軟閾值(β)。A: 縱坐標(biāo)對(duì)應(yīng)的是無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)模型指數(shù); B: 每一個(gè)軟閾值對(duì)應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)平均連接程度。

The abscissa represents the soft threshold (β). A: ordinate corresponds to the index of scale free network model; B: the average link degree of each soft threshold.

1.3 組織特異性模塊鑒定

具有相似表達(dá)模式的基因被認(rèn)為是具有類(lèi)似的生物學(xué)功能。模塊是一組表達(dá)模式高度相似的基因集合。為了深入研究與組織高度相關(guān)聯(lián)的模塊, 計(jì)算了模塊特征向量(module eigengene, ME)和不同組織之間的相關(guān)系數(shù), 相關(guān)系數(shù)越大, 該模塊與組織間關(guān)聯(lián)度越高, 而相關(guān)系數(shù)值越小, 模塊與組織間關(guān)聯(lián)度低。為了研究具有高度生物學(xué)特性的模塊, 本研究定義相關(guān)系數(shù)的閾值為0.65, 即任何模塊與組織的相關(guān)系數(shù)高于0.65將被定義為組織特異性模塊[21]。

1.4 模塊基因的富集分析

首先提取出組織特異性模塊中的基因, 再將模塊基因提交到Agrigo[22](GO Analysis Toolkit and Database for Agricultural Community)(http://bioinfo. cau.edu.cn/agriGO/index.php)在線分析工具, 采用奇異富集分析(singular enrichment analysis, SEA)法進(jìn)行富集分析。使用玉米參考基因組B73作為參考數(shù)據(jù)庫(kù), 利用Fisher’s校驗(yàn)和Bonferronni多重校驗(yàn)來(lái)進(jìn)行顯著GO類(lèi)型的篩選。

1.5 玉米開(kāi)花調(diào)控通路的相關(guān)模塊

開(kāi)花作為一個(gè)復(fù)雜的農(nóng)藝性狀, 不僅與外界環(huán)境信號(hào)有關(guān), 同時(shí)也涉及到內(nèi)源性的信號(hào)調(diào)控[23]。根據(jù)已有的文獻(xiàn)報(bào)道, 玉米開(kāi)花受到日照、赤霉素以及DNA的甲基化修飾等因素的調(diào)控。利用開(kāi)花調(diào)控相關(guān)的一些關(guān)鍵詞例如開(kāi)花(flower)、光(light)、赤霉素(gibberellin)、甲基化(methylation)、分生組織(meristem)等, 在組織特異性模塊中查找參與調(diào)控開(kāi)花的模塊與基因。

1.6 基因互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

根據(jù)拓?fù)渲丿B矩陣計(jì)算出模塊中不同基因間的權(quán)重值, 權(quán)重值越高, 代表基因間的關(guān)聯(lián)程度越高。篩選出模塊間相關(guān)系數(shù)排名較高的基因, 同時(shí)挑選出模塊中已經(jīng)報(bào)道過(guò)的開(kāi)花基因, 利用這些基因進(jìn)行互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建, 網(wǎng)絡(luò)中每一個(gè)節(jié)點(diǎn)代表一個(gè)基因, 連接線兩端的基因具有相似的生物學(xué)功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過(guò)數(shù)據(jù)分析共獲得39,625個(gè)基因的表達(dá)譜數(shù)據(jù), 過(guò)濾低表達(dá)量的基因, 獲得22,426個(gè)高表達(dá)基因。計(jì)算得到了基因表達(dá)水平的樣本聚類(lèi)和性狀關(guān)聯(lián), 圖3的結(jié)果表明每一個(gè)組織的基因聚類(lèi)樹(shù)可以和組織很好地對(duì)應(yīng)。通過(guò)對(duì)權(quán)重值篩選, 最終選擇β=14來(lái)構(gòu)建網(wǎng)絡(luò), 采用動(dòng)態(tài)剪切樹(shù)法合并表達(dá)相似的模塊, 共獲得20個(gè)共表達(dá)模塊(圖2), 不同的顏色代表不同的模塊。模塊中的基因數(shù)目分配根據(jù)其表達(dá)量進(jìn)行一個(gè)相關(guān)度的聚類(lèi), 聚類(lèi)度較高的基因被分配到一個(gè)模塊中, 其中Black模塊包含的基因數(shù)目最多, 是8492個(gè)基因, Floralwhite模塊內(nèi)的基因數(shù)量最少, 含87個(gè)基因, 平均每個(gè)模塊包含的基因數(shù)目是1123, Grey模塊是一組未分配到其他模塊的基因集合(圖2)。

圖2 基因聚類(lèi)樹(shù)和模塊切割

A: 基于拓?fù)渲丿B構(gòu)建的基因聚類(lèi)樹(shù)。B: 動(dòng)態(tài)混合切割法得到的基因模塊, 顏色代表模塊。C: 合并相似表達(dá)模式的基因模塊。

A: clustering of genes based on the topological overlap. B: the gene modules obtained from the dynamic tree cut. C: the merged modules with similar expression pattern.

圖3 樣本層次聚類(lèi)樹(shù)及對(duì)應(yīng)的組織信息

A: 基于歐氏距離得到的基因聚類(lèi)樹(shù)。橫軸表示不同的玉米組織, 縱軸代表基因間的聚類(lèi)高度。B: 性狀與基因聚類(lèi)樹(shù)關(guān)聯(lián)熱圖。白色的代表低關(guān)聯(lián)度, 紅色的代表高關(guān)聯(lián)度。

A: the gene cluster tree based on the Euclidean distance. The abscissa represents the different tissues. The ordinate represents the cluster height of genes. B: the association trait heatmap, the white means a low correlation, the red means a high correlation.

圖4 共表達(dá)模塊中基因數(shù)目分布

橫軸代表模塊, 縱軸代表模塊中的基因數(shù)目。

The abscissa represents the modules and the vertical ordinate represents the gene number of each module.

2.2 組織特異性模塊鑒定

在20個(gè)模塊中有14個(gè)與組織存在高度特異性(圖5)。大多數(shù)組織都有與其高度相關(guān)聯(lián)的模塊, 例如Blue模塊與13葉期葉片存在高度相關(guān)性(=0.96,=6E–08), Darkmagenta與v18雄穗連接度較高(=0.98,=2E–09)。14個(gè)組織特異性模塊中沒(méi)有任何一個(gè)模塊和v18未成熟果穗與授粉前果穗兩個(gè)組織存在高度相關(guān)性。我們推測(cè)這兩個(gè)時(shí)期組織中的基因主要進(jìn)行常規(guī)的生命活動(dòng), 因此沒(méi)有組織特異性的模塊與之對(duì)應(yīng)。

圖5 模塊與性狀關(guān)聯(lián)熱圖

橫軸表示不同的性狀, 縱軸表示每一個(gè)模塊的特征向量。紅色的格子代表性狀與模塊具有正相關(guān)性, 綠色的格子代表性狀與模塊具有負(fù)相關(guān)性。

Each column represents the co-expression module. Red color of each box represents the positive correlation between module and trait. Green color of each box represents the negative relationships between module and trait.

2.3 組織特異性模塊的功能富集分析

具有相似表達(dá)模式的基因可能具有相同的生物學(xué)功能, 通過(guò)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的模塊在很大程度上與特定的生物組織相聯(lián)系, 而特定的生物組織又與特定生命活動(dòng)存在高度協(xié)同性[4]。為了進(jìn)一步解析組織特異性模塊的生物學(xué)功能, 本研究利用Agrigo工具對(duì)模塊基因進(jìn)行富集分析, 表明這14個(gè)模塊都可以富集得到顯著的GO通路, 這些GO通路涉及到生物學(xué)過(guò)程(biological process, BP), 分子功能 (molecular function, MF)以及細(xì)胞組分(cellular component, CC)。與根發(fā)育高度關(guān)聯(lián)Darkgrey模塊可以富集得到水轉(zhuǎn)運(yùn)(GO:0006833), 流體運(yùn)送(GO:0042044)等調(diào)控通路, 表明WGCNA可以構(gòu)建到具有生物學(xué)意義的共表達(dá)模塊。通過(guò)對(duì)開(kāi)花發(fā)育與調(diào)控的關(guān)鍵字進(jìn)行檢索發(fā)現(xiàn), Blue、Darkmagenta、Darkred、Darkslateblue、Orange、Plum2、Yellow和Bisuqe4模塊都富集到了與開(kāi)花相關(guān)的調(diào)控通路(圖6), 這些通路主要是響應(yīng)光照刺激的調(diào)控通路(GO:0009416)、頂端分生組織形態(tài)保持(GO:0010073)和花器官發(fā)育(GO:0048437)等。Blue模塊與13葉期葉片存在最高的相關(guān)性(=0.96,=6E–08), Darkmagenta模塊和v18雄穗具有最高的相關(guān)性(=0.98,=2E–09), 這兩個(gè)模塊對(duì)應(yīng)的組織是葉片和雄穗, 是和開(kāi)花密切相關(guān)的組織, 此外, Blue模塊包含了7個(gè)已經(jīng)報(bào)道的開(kāi)花基因, Darkmagenta模塊也包含6個(gè)已經(jīng)報(bào)道的開(kāi)花基因, 雖然富集得到了開(kāi)花調(diào)控通路, 但是開(kāi)花基因數(shù)目較少或者沒(méi)有已知開(kāi)花基因存在于這些模塊, 因此本研究重點(diǎn)關(guān)注了Blue模塊(圖7)和Darkmagenta (圖8)模塊, 篩選出模塊中高連通性的基因, 利用Cytoscape[24]軟件對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了可視化處理, 處于網(wǎng)絡(luò)中的基因是該模塊中的高連接度的基因。

2.4 開(kāi)花基因互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

考慮到開(kāi)花時(shí)間調(diào)控基因主要分布在Blue和Darkmagenta模塊, 因此利用這2個(gè)模塊中已經(jīng)報(bào)道的開(kāi)花基因構(gòu)建基因互作網(wǎng)絡(luò)。Blue模塊中共發(fā)現(xiàn)7個(gè)報(bào)道過(guò)的開(kāi)花基因, 其中、[25]和[26]3個(gè)基因的連通性在模塊排名為前1%, 可以作為模塊中的核心基因,和作為開(kāi)花促進(jìn)因子, 是開(kāi)花調(diào)控通路中的重要基因。此外[27]、[28-29]、[30]和[31]基因在模塊中聯(lián)通性排名靠后, 但是這些基因被證明是玉米開(kāi)花調(diào)控通路中關(guān)鍵基因, 推測(cè)WGCNA構(gòu)建的模塊中, 基因的連通性基于基因間表達(dá)量, 而基因間表達(dá)量受多種因素影響, 導(dǎo)致關(guān)鍵調(diào)控基因在模塊中的相關(guān)性較低。因此, 本研究以、、、、、、等基因作為樞紐基因, 篩選與開(kāi)花基因高連通性的基因, 將其定義為候選開(kāi)花基因, 利用開(kāi)花基因和候選花期基因構(gòu)建局部調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(圖9), 在該網(wǎng)絡(luò)中, 每一個(gè)節(jié)點(diǎn)代表一個(gè)基因, 節(jié)點(diǎn)間通過(guò)連接線相聯(lián)系, 處于連接線兩端的基因被認(rèn)為具有相同生物功能。與v18雄穗高度關(guān)聯(lián)的Darkmagenta模塊包含6個(gè)開(kāi)花調(diào)控基因, 即[32]、[33]、[32]、[34]、[34]和[35], 在該模塊中有2個(gè)基因的連通性排名前10%, 分別是和, 參照Blue模塊的研究思路, 利用Darkmagenta已經(jīng)報(bào)道過(guò)的開(kāi)花基因構(gòu)建Darkmagenta模塊內(nèi)的局部調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(圖10)。此外, 檢索了候選開(kāi)花基因在擬南芥中的同源基因, 并借助TAIR (https://www.arabidopsis.org/)網(wǎng)站注釋了擬南芥同源基因的功能(表1)。

圖6 開(kāi)花富集通路

每一行代表開(kāi)花富集通路, 每一列代表組織特異性模塊。點(diǎn)的大小代表多重校驗(yàn)的值大小, 點(diǎn)的顏色表示輸入基因與背景基因的比值。

Each row corresponds to a GO enrichment pathway, column to a tissue specific module. The point size is calculated by the-value of multiple check. The Richfactor represent the ratio of input genes to the background genes.

圖7 Blue模塊內(nèi)的基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)

圖8 Darkmagenta模塊內(nèi)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)

3 討論

傳統(tǒng)的生物學(xué)研究側(cè)重于從分子水平闡釋單個(gè)功能元件(如DNA、mRNA和蛋白質(zhì))對(duì)生命活動(dòng)的影響, 雖然該方法對(duì)于揭示具體性狀的遺傳機(jī)理具有非常重要的意義, 但只能局部地解釋某一生命活動(dòng)發(fā)生的原因。隨著測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展, 傳統(tǒng)的生物學(xué)研究不能充分有效地挖掘海量數(shù)據(jù)中蘊(yùn)含的生物學(xué)意義。網(wǎng)絡(luò)作為系統(tǒng)生物學(xué)的一種研究手段, 借助基因組、轉(zhuǎn)錄組和代謝組的數(shù)據(jù), 廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)的探索中。相比于其他調(diào)控網(wǎng)絡(luò), WGCNA可以特異地篩選出與性狀相關(guān)的基因, 并進(jìn)行模塊化分類(lèi), 得到具有高度生物學(xué)意義的共表達(dá)模塊, 已經(jīng)被證明是一種高效的數(shù)據(jù)挖掘手段[36]。

本研究通過(guò)對(duì)14個(gè)組織特異性模塊進(jìn)行富集分析, 發(fā)現(xiàn)這14個(gè)模塊均可以得到具有生物學(xué)意義的調(diào)控通路(附表1)。例如在與根高度關(guān)聯(lián)的Darkgrey模塊, 富集分析的GO term包含水轉(zhuǎn)運(yùn)(GO:0006833)、流體運(yùn)輸(GO:0042044)等通路, 這些通路和根部所具有的生物功能高度吻合, 該結(jié)果證明了共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建模塊的特異性。本研究直接利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)的組織, 例如根、葉片和花藥等作為研究的性狀, 該方法在前人的研究中已有過(guò)相關(guān)報(bào)道, 如在黃瓜(L.) 10個(gè)組織的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建中, 研究人員成功鑒定到數(shù)個(gè)與黃瓜苦味合成代謝相關(guān)的模塊[18]。

表1 Darkmagenta模塊和Blue模塊中候選開(kāi)花基因的功能注釋。

本研究重點(diǎn)關(guān)注了開(kāi)花這個(gè)重要的農(nóng)藝性狀。開(kāi)花作為玉米生命活動(dòng)的中心環(huán)節(jié), 對(duì)其遺傳機(jī)制的解析雖然取得了一定的進(jìn)展, 例如通過(guò)數(shù)量性狀位點(diǎn)定位和關(guān)聯(lián)分析等方法鑒定了許多重要的開(kāi)花基因, 但是這些研究手段都有一定的局限性, 例如數(shù)量性狀定位不能反映參考群體較為廣泛的遺傳異質(zhì)性[37], 此外, 許多復(fù)雜的農(nóng)藝性狀是一個(gè)與群體結(jié)構(gòu)存在高度相關(guān)的性狀, 例如開(kāi)花, 而且利用關(guān)聯(lián)分析鑒定控制目標(biāo)性狀相關(guān)的調(diào)控基因容易受到群體結(jié)構(gòu)的影響[38]。權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)則通過(guò)共表達(dá)模塊化處理, 將成千上萬(wàn)的基因分配到模塊中, 通過(guò)研究模塊蘊(yùn)含的生物學(xué)意義進(jìn)一步挖掘相應(yīng)基因的功能, 因此較好地解決了對(duì)復(fù)雜性狀解析能力不足的問(wèn)題, 被廣泛地應(yīng)用于基因組學(xué)的研究之中。

圖9 Blue模塊開(kāi)花相關(guān)的基因網(wǎng)絡(luò)

紅色節(jié)點(diǎn)是參與開(kāi)花調(diào)控通路的基因。

Each node corresponding to a gene, the red node is the hub gene of the network and is the flowering time gene which had reported.

在本研究中的富集分析結(jié)果中, 8個(gè)組織特異性模塊包含開(kāi)花的調(diào)控通路(圖6), 例如Blue模塊中的響應(yīng)光刺激調(diào)控通路(GO:0009416), Darkolivegreen模塊中的頂端分生組織形態(tài)維持(GO:0010022)和Plum2模塊的花器官發(fā)育(GO:0048437)。此外, 結(jié)合已經(jīng)報(bào)道過(guò)的開(kāi)花基因, 進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Blue模塊和Darkmagenta模塊含有較多開(kāi)花相關(guān)的調(diào)控基因, 而且這些開(kāi)花基因的連通性在模塊中很高, 處于樞紐地位, 例如Blue模塊中的和基因是開(kāi)花激活因子, Darkmagenta模塊中的和基因, 是時(shí)鐘通路的重要參與基因。通過(guò)對(duì)模塊中基因的局部網(wǎng)絡(luò)化, 挖掘到了與開(kāi)花基因連接程度較高的基因, 這些基因可以作為開(kāi)花候選基因被進(jìn)一步研究。例如在Blue模塊中, 與8高連通性的基因, 其在擬南芥中的同源基因是,基因編碼一個(gè)調(diào)節(jié)開(kāi)花的小蛋白質(zhì), 并且參與赤霉素調(diào)控通路, 在光照誘導(dǎo)后該基因在頂端分生組織表達(dá),的高連接度基因在擬南芥中的同源基因是, 通過(guò)功能注釋發(fā)現(xiàn)這個(gè)基因編碼葉綠素結(jié)合蛋白D1, 屬于光系統(tǒng)II反應(yīng)中心, 參與光周期調(diào)控通路。在Darkmagenta模塊中,的高連接度基因是, 其在擬南芥中的同源基因是, 該基因編碼一個(gè)F-box蛋白, 響應(yīng)光照刺激, 參與光周期途徑;是的高連接度基因, 該基因在擬南芥中的同源基因是, 主要參與花粉管生長(zhǎng)和受精。以上結(jié)果表明, 在WGCNA中, 與目標(biāo)基因存在高連通性的基因具有與其相似的生物學(xué)意義, 這可以為挖掘目標(biāo)基因提供新的研究思路。在本研究中, 重點(diǎn)關(guān)注了Blue和Darkmagenta兩個(gè)開(kāi)花相關(guān)的調(diào)控模塊, 其余6個(gè)開(kāi)花相關(guān)的基因模塊雖然沒(méi)有被詳細(xì)的論述, 但是其包含開(kāi)花富集通路, 可進(jìn)一步挖掘其蘊(yùn)含的生物學(xué)意義。

圖10 Darkmagenta模塊的開(kāi)花相關(guān)的基因網(wǎng)絡(luò)

紅色節(jié)點(diǎn)基因參與開(kāi)花調(diào)控通路。

Each node corresponding to a gene, the red node is the hub gene of the network and is the flowering time gene which had reported.

本研究鑒定到的組織特異性模塊對(duì)應(yīng)的組織都是玉米開(kāi)花調(diào)控和發(fā)育的重要參與器官, 因此, 利用共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)解析具體的農(nóng)藝性狀, 分析模塊的生物功能, 挖掘模塊中的目標(biāo)基因, 將為解析復(fù)雜的農(nóng)藝性狀提供重要的參考依據(jù)。

4 結(jié)論

構(gòu)建了與性狀相關(guān)聯(lián)的權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò), 得到了14個(gè)組織特異性模塊。揭示了組織特異性模塊蘊(yùn)含的生物學(xué)意義, 鑒定了開(kāi)花相關(guān)的調(diào)控基因, 并用其構(gòu)建了局部的具有生物學(xué)意義的網(wǎng)絡(luò)。本研究結(jié)果可為后續(xù)解析玉米發(fā)育的遺傳機(jī)理提供重要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。

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附表1 組織特異性模塊的GO富集分析結(jié)果(部分)

Supplementary table 1 GO enrichment analysis results of tissue specific module (part)

模塊ModuleGO條目GO term本體Ontology描述DescriptionP值P-value Darkorange2GO: 0009889BP生物合成過(guò)程調(diào)節(jié)Regulation of biosynthetic process6.90E–07 Darkorange2GO: 0006355BPDNA依賴(lài)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)Regulation of transcription, DNA-dependent4.40E–07 Darkorange2GO: 0015267MF通道活性Channel activity0.00068 Darkorange2GO: 0022838MF底物特異性通道活性Substrate-specific channel activity0.00068 BlueGO: 0009628BP非生物刺激的反應(yīng)Response to abiotic stimulus3.60E–10 BlueGO: 0009416BP光刺激響應(yīng)Response to light stimulus1.60E–08 BlueGO: 0003700MF轉(zhuǎn)錄因子活性Transcription factor activity0.00017 BlueGO: 0009535CC葉綠體類(lèi)囊體膜Chloroplast thylakoid membrane0.00022 DarkredGO: 0051186BP輔因子代謝過(guò)程Cofactor metabolic process1.20E–19 DarkredGO: 0004252MF絲氨酸型肽鏈內(nèi)切酶活性Serine-type endopeptidase activity0.00015 DarkredGO: 0009543CC葉綠體類(lèi)囊體腔 Chloroplast thylakoid lumen4.40E–13 DarkslateblueGO: 0016051BP碳水化合物生物合成過(guò)程Carbohydrate biosynthetic process5.60E–05 DarkslateblueGO: 0016830MF碳-碳裂解酶活性Carbon-carbon lyase activity3.40E–06 DarkslateblueGO: 0042651CC類(lèi)囊體膜Thylakoid membrane0.00013 TurquoiseGO: 0060560BP形態(tài)發(fā)生發(fā)育Developmental growth involved in morphogenesis1.70E–11 TurquoiseGO: 0015299MF溶質(zhì): 氫反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性Solute: hydrogen antiporter activity4.60E–05 TurquoiseGO: 0031224CC內(nèi)膜Intrinsic to membrane8.50E–06 DarkmagentaGO: 0010927BP涉及形態(tài)發(fā)生的內(nèi)膜組裝Cellular component assembly involved in morphogenesis4.10E–09 DarkmagentaGO: 0004553MF水解酶活性, 水解O-糖基化合物Hydrolase activity, hydrolyzing O-glycosyl compounds7.60E–06 DarkmagentaGO: 0030312CC高爾基體Golgi apparatus0.0004 Bisque4GO: 0042180BP細(xì)胞酮代謝過(guò)程Cellular ketone metabolic process3.00E–08 Bisque4GO: 0044281BP小分子代謝過(guò)程Small molecule metabolic process9.90E–06 Bisque4GO: 0042221BP相應(yīng)化學(xué)刺激Response to chemical stimulus0.00032 DarkgreyGO: 0010033BP對(duì)有機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)Response to organic substance1.60E–07 DarkgreyGO: 0004553MF水解酶活性, 水解O-糖基化合物Hydrolase activity, hydrolyzing O-glycosyl compounds4.40E–10 DarkgreyGO: 0005740CC線粒體包膜Mitochondrial envelope7.40E–05 FloralwhiteGO: 0006412BP蛋白質(zhì)翻譯Translation9.10E–07 FloralwhiteGO: 0005198MF結(jié)構(gòu)分子活性Structural molecule activity5.80E–08 FloralwhiteGO: 0043227CC膜有界細(xì)胞器Membrane-bounded organelle0.0085 DarkolivegreenGO: 0010022BP分生組織決定Meristem determinacy6.10E–07

(附續(xù)表1)

模塊ModuleGO條目GO term本體Ontology描述DescriptionP值P-value DarkolivegreenGO: 0003700MF轉(zhuǎn)錄因子活性Transcription factor activity5.50E–05 OrangeGO: 0042542BP過(guò)氧化氫反應(yīng)Response to hydrogen peroxide2.90E–05 OrangeGO: 0009526CC質(zhì)體Plastid9.60E–09 YellowGO: 0009605BP響應(yīng)外界刺激Response to external stimulus8.40E–10 YellowGO: 0022892MF底物特異性轉(zhuǎn)運(yùn)體活性Substrate-specific transporter activity0.00013 Plum2GO: 0048437BP花器官發(fā)育Floral organ development9.20E–05 Plum2GO: 0005576CC胞外區(qū)Extracellular region9.70E–05 GreenyellowGO: 0034220BP離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)Ion transmembrane transport5.00E–13 GreenyellowGO: 0032561MF鳥(niǎo)苷酸核糖核酸結(jié)合Guanyl ribonucleotide binding2.40E–10 GreenyellowGO: 0043231CC內(nèi)細(xì)胞器膜Organelle inner membrane1.20E–17

Identification of maize flowering gene co-expression modules by WGCNA

YANG Yu-Xin1, SANG Zhi-Qin1,2, XU Cheng1, DAI Wen-Shuang1, and ZOU Cheng1,*

1Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;2Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Science, Shihezi 832000, Xinjiang, China

Weighted gene co-expression network analysis (WGCNA) is one of the research methods in systematic biology. It can effectively analyze the complex samples, and has been extensively used in the analysis of complicated traits for many samples. Weighted gene co-expression network has the characteristics of scale-free distribution and could construct the scale free network. The genes with similar expression level can be clustered and assigned to a module, then the relationships between co-expression modules and specific tissues can be furtherly analyzed. Our research utilized the transcriptome data of 14 different tissues of maize (L.) inbred line B73, and calculated the gene expression level of the whole genome. Through filtering out the genes with low expression level we finally got 22,426 genes with high expression level to construct the gene expression matrix. We utilized the different tissues as the trait to construct the trait matrix. The weighted gene co-expression network analysis packages of R software was used to perform the co-expression network analysis, and 20 co-expression modules were identified. We finally obtained 14 tissue specific modules which were highly correlated with traits (> 0.65). The enrichment analysis tool Agrigo was taken to perform the GO enrichment of the tissue specific module genes, all the 14 tissues could be enriched in GO terms. Flowering is one of the important agronomic traits in the life cycle of maize controlled by external environment signals and genetic factors. Maize flowering not only represents the transition from the vegetative growth to reproductive growth, also relates to grain yield, plant height and resistance. In our research, we detected eight tissue specific modules, which could be obtained within flowering time related pathways. In addition, 17 flowering genes which have been reported in the literatures were assigned to the co-expression modules, and mainly assigned to the Blue and Darkmagenta modules. Therefore, we focused on the network of Blue and Darkmagenta modules. Our research calculated the gene expression abundances, and detected several flowering time related modules, which will contribute to revealing the genetic mechanism of maize flowering time regulation.

maize; weighted gene co-expression network; development regulation; flowering; transcriptome

2018-07-17;

2018-10-08;

2018-11-08.

10.3724/SP.J.1006.2019.83053

鄒棖，E-mail: zoucheng@caas.cn

E-mail: yyx0719@126.com

本研究由國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016YFD0100303)和國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31371638)資助。

This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2016YFD0100303), the National Natural Science Foundation of China (31371638).

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20181105.0933.004.htm