TNF-α、FoxM1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性分析

眭文妍 范曉慧 陳麗紅 趙文麗 彭曉峰

【摘要】 目的：研究在結(jié)直腸癌（CRC）組織中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）與叉頭框轉(zhuǎn)錄因子M1（FoxM1）的表達(dá)情況并分析其相關(guān)性。方法：選取2017年10月-2018年10月本院收治的CRC患者60例。所有患者均經(jīng)手術(shù)治療，術(shù)后均留取病灶標(biāo)本（CRC組織），并取遠(yuǎn)離癌組織中心5 cm以上的組織為對照標(biāo)本（癌旁組織）。以Western blot法檢測CRC組織與癌旁組織TNF-α與FoxM1中的表達(dá)情況，并分析TNF-α與FoxM1在CRC組織中的相關(guān)性。結(jié)果：CRC組織TNF-α、FoxM1蛋白相對表達(dá)量均高于癌旁組織（P<0.05）;組織分化程度Ⅲ、Ⅳ級和Dukes C、D期，以及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵及漿膜層及以外的CRC組織TNF-α與FoxM1蛋白相對表達(dá)量均分別高于組織分化程度Ⅰ、Ⅱ級和Dukes A、B期，以及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及未侵及漿膜層的CRC組織（P<0.05）;TNF-α與FoxM1呈正相關(guān)（r=0.587，P<0.05）。結(jié)論：TNF-α、FoxM1的高表達(dá)與CRC的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，且兩者有明顯的正相關(guān)，可為CRC的診斷及預(yù)后判斷提供指導(dǎo)，并能作為新的治療研究靶點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】 結(jié)直腸癌; 腫瘤壞死因子-α; 叉頭框轉(zhuǎn)錄因子M1; 相關(guān)性

Expression and Correlation Analysis of TNF-α and FoxM1 in Colorectal Cancer Tissues/SUI Wenyan，F(xiàn)AN Xiaohui，CHEN Lihong，et al.//Medical Innovation of China，2019，16（26）：119-122

【Abstract】 Objective：To study the expression of TNF-α and FoxM1 in colorectal cancer（CRC）and to analyze their correlation.Method：60 patients with CRC admitted to our hospital from October 2017 to October 2018 were selected.All patients were treated with surgery，and all lesions were collected postoperatively（CRC tissue），and tissues more than 5 cm away from the center of cancer tissue were taken as control specimens（adjacent tissue）.The expression of TNF-α and FoxM1 in CRC tissues and adjacent tissues were detected by Western blot，and the correlation between TNF-α and FoxM1 in CRC tissues was analyzed.Result：The relative expression of TNF-α and FoxM1 protein in CRC tissues were higher than those in adjacent tissues（P<0.05）.The relative expression of TNF-α and FoxM1 protein in CRC tissues with differentiation degree Ⅲ，Ⅳ level，Dukes C，D period，lymph node metastasis，invasion into serous layer and beyond were higher than those in CRC tissues with differentiation degree Ⅰ，Ⅱ level，Dukes A，B period，no lymph node metastasis and no serous layer invasion，respectively（P<0.05）.TNF-α was positively correlated with FoxM1（r=0.587，P<0.05）.Conclusion：The high expression of TNF-α and FoxM1 is related to the occurrence and development of CRC，and they are positively correlated.They can provide guidance for the diagnosis and prognosis of CRC，and can be used as new therapeutic research targets.

【Key words】 Colorectal cancer; Tumor necrosis factor-α; Fork frame transcription factor M1; Correlation

First-authors address：Huizhou First Peoples Hospital，Huizhou 516003，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.26.032

結(jié)直腸癌（CRC）是臨床常見的消化道腫瘤，也是全球三大最常見的癌癥之一，其死亡率居于惡性腫瘤死亡的第4位，近年來我國的結(jié)直腸癌發(fā)病率呈逐年升高，已經(jīng)成為威脅我國居民健康的常見腫瘤[1]。目前手術(shù)輔助放化療是CRC的主要治療方式，但患者的5年生存率仍較低，隨著臨床對腫瘤標(biāo)志物研究的深入，通過尋找CRC的特異性標(biāo)志物進(jìn)行精確的靶向治療成為臨床的重要研究內(nèi)容[2]。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）由脂肪組織中的單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)分泌，也是發(fā)現(xiàn)最早的能使腫瘤組織發(fā)生出血性壞死的細(xì)胞因子，已經(jīng)成為腫瘤靶向治療的新靶點(diǎn)之一[3]。叉頭框轉(zhuǎn)錄因子M1（FoxM1）是一種與增殖相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，是預(yù)測CRC患者無瘤生存期及總生存期的重要指標(biāo)[4]。本研究主要對CRC組織中TNF-α、FoxM1的表達(dá)及相關(guān)性進(jìn)行分析，為CRC的靶向治療策略提供理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年10月-2018年10月本院收治的60例CRC患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：均為原發(fā)性結(jié)直腸癌，且經(jīng)結(jié)腸鏡活檢、臨床病理切片證實(shí)，符合《中國結(jié)直腸癌診療規(guī)范（2015版）》中對結(jié)直腸癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴有心、肝、腎等重要器官功能異常、伴有急慢性感染性疾病者;在病理檢查及手術(shù)治療前接受過相關(guān)放療、化療及其他輔助治療者。60例CRC患者中男34例，女26例;年齡42～85歲，平均（65.2±7.5）歲;組織分化程度：Ⅰ級10例、Ⅱ級26例、Ⅲ級20例、Ⅳ級4例;Dukes分期：A期12例、B期25例、C期15例、D期8例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例、未轉(zhuǎn)移22例;浸潤漿膜層及以外35例、未侵及至漿膜層25例。所有患者入院后均經(jīng)手術(shù)治療，術(shù)后均留取病灶標(biāo)本（CRC組織），并取遠(yuǎn)離癌組織中心5 cm以上的組織為對照標(biāo)本（癌旁組織）。所有患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法 試劑：兔抗人FoxM1多克隆抗體為圣克魯斯生物技術(shù)（上海）有限公司（SANTA CRUZ Biotechnology Inc）產(chǎn)品，EN Vision免疫組化檢測試劑盒[由賽默飛世爾（中國）科技有限公司]。方法：CRC組織與癌旁組織TNF-α、FoxM1蛋白表達(dá)檢測：以10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，4 μm厚度連續(xù)切片。Western blot檢測TNF-α、FoxM1蛋白表達(dá)情況，取適量組織加入裂解液和苯甲基磺酰氟（PMSF）勻質(zhì)裂解后反復(fù)離心，取上層清液提取蛋白，以BCA蛋白定量法進(jìn)行蛋白濃度檢測，100 ℃水浴鍋中煮沸5 min使蛋白質(zhì)變性，配置10%聚丙烯酰胺凝膠（SDA-PAG），每孔中加入蛋白與加樣緩沖混合液適量，垂直電泳分離，將含TNF-α、FoxM1與內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的膠段切下移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，以5%脫脂奶粉密封6 min后分別加入20 mL FoxM1（1︰300）與GAPDH（1︰3 000）一抗稀釋液，于4 ℃環(huán)境下過夜，次日洗膜完全后加入二抗稀釋液（1︰3 000）室溫下孵育1 h，洗膜完全后以ECL發(fā)光液進(jìn)行顯影，以Image J進(jìn)行灰度值分析，目的蛋白灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值記為相對表達(dá)量。

1.3 觀察指標(biāo) （1）對比CRC組織與癌旁組織的TNF-α、FoxM1蛋白相對表達(dá)量。（2）比較不同病理參數(shù)的TNF-α、FoxM1蛋白表達(dá)情況。主要比較不同組織分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤程度患者的TNF-α及FoxM1蛋白表達(dá)情況。（3）分析TNF-α與FoxM1在CRC組織中的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 23.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn)，使用Pearson相關(guān)性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TNF-α及FoxM1表達(dá)情況比較 CRC組織中TNF-α與FoxM1蛋白的蛋白相對表達(dá)量均高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.2 不同病理參數(shù)的CRC組織中TNF-α、FoxM1蛋白表達(dá)情況比較 組織分化程度Ⅲ、Ⅳ級TNF-α蛋白與FoxM1蛋白相對表達(dá)量高于Ⅰ、Ⅱ級，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），Dukes分期C、D期TNF-α蛋白與FoxM1蛋白相對表達(dá)量高于A、B期（P<0.05），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的TNF-α蛋白與FoxM1蛋白相對表達(dá)量高于未轉(zhuǎn)移（P<0.05），侵及漿膜層及以外的TNF-α蛋白與FoxM1蛋白相對表達(dá)量高于未侵及漿膜層，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.3 相關(guān)性分析 經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，在CRC組織中TNF-α與FoxM1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.587，P=0.010）。

3 討論

隨著社會的發(fā)展進(jìn)步，人們的生活水平逐漸提高，各種高糖、高脂肪及高熱量食物的攝入量增多，另外受吸煙、肥胖及缺乏鍛煉等因素影響，結(jié)直腸癌的發(fā)病率逐漸增加[6]。結(jié)直腸癌早期的癥狀并不明顯，多數(shù)患者就診時已進(jìn)入晚期，其病情進(jìn)展快，預(yù)后差，病死率高，因此如何提高對結(jié)直腸癌的診斷、治療效果具有重要意義[7-8]。已知結(jié)直腸癌發(fā)生涉及眾多因子的相互作用，并與基因突變有一定的關(guān)系，因此分析靶向治療成為本病治療的新途徑，探討結(jié)直腸癌的新型腫瘤標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)成為結(jié)直腸癌治療的研究熱點(diǎn)[9-10]。

本研究結(jié)果顯示CRC組織中的TNF-α及FoxM1蛋白相對表達(dá)量均高于癌旁組織（P<0.05），說明TNF-α與FoxM1蛋白的高表達(dá)與CRC的發(fā)生有關(guān);組織分化程度Ⅲ、Ⅳ級和Dukes C、D期，以及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵及漿膜層及以外的CRC組織TNF-α與FoxM1蛋白相對表達(dá)量分別高于組織分化程度Ⅰ、Ⅱ級和Dukes分期A、B期，以及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、未侵及漿膜層的CRC組織（P<0.05），且經(jīng)Pearson相關(guān)性分析TNF-α與FoxM1蛋白相對表達(dá)呈正相關(guān)（P<0.05），說明TNF-α與FoxM1的蛋白表達(dá)水平與臨床病理特征有關(guān)，參與CRC的病理發(fā)展過程，兩者可相互影響。有研究表明，腫瘤的微環(huán)境由腫瘤細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞（炎性細(xì)胞、成纖維細(xì)胞）、趨化因子等共同參與，而炎癥細(xì)胞是其重要組部分，因此在結(jié)腸癌的發(fā)展、發(fā)展過程中起到促進(jìn)作用[11-12]。TNF-α作為與腫瘤相關(guān)的細(xì)胞巨噬細(xì)胞分泌的因子，可啟動機(jī)體的慢性炎癥，通過激活和轉(zhuǎn)錄因子κB和活化蛋白1兩種炎性信號通路關(guān)鍵因子，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和逃逸，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的定植[13-14]，還能穩(wěn)定腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移[15-17]。有研究顯示內(nèi)源性分泌的TNF-α可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞分泌蛋白酶，破壞間皮表層，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤，破壞間皮表層導(dǎo)致腫瘤發(fā)生浸潤，并能通過調(diào)控中性粒細(xì)胞的基因表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移和生長。FoxM1是叉頭盒蛋白家族的重要成員，在結(jié)腸、小腸、睪丸、胸腺等成人組織分裂活躍的細(xì)胞中均有表達(dá)，在靜止期活分化的細(xì)胞中幾乎不表達(dá)，能通過激活尿激酶型纖溶酶原激活劑受體促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲、分化、轉(zhuǎn)移及浸潤[18-19]。因此相較于組織分化程度Ⅰ、Ⅱ級和Dukes A、B期，以及未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及未侵及漿膜層的CRC組織中，組織分化程度Ⅲ、Ⅳ級和Dukes C、D期，以及發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵及漿膜層及以外的CRC組織中的TNF-α與FoxM1蛋白相對表達(dá)量更高。而TNF-α蛋白表達(dá)的異常升高，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、浸潤、定植，從而使FoxM1的表達(dá)量增加，因此兩者有正相關(guān)的關(guān)系[20]。

綜上所述，TNF-α與FoxM1均參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，且兩者呈正相關(guān)，可成為CRC的診斷、預(yù)后監(jiān)測因子及新型的治療靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2019-02-18） （本文編輯：田婧）