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    葛芪平渴丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

    2019-01-16 08:06辛玲歌趙銳
    關(guān)鍵詞:薄層色譜高效液相色譜質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

    辛玲歌 趙銳

    【摘?要】?目的:探討葛芪平渴丸的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。方法:采用薄層色譜定性鑒別法(TCL)對(duì)葛芪平渴丸處方中葛根、薏苡仁、黃連進(jìn)行薄層色譜定性鑒別;采用高效液相色譜法(HPLC),建立制劑中葛根素含量的測(cè)定方法。結(jié)果:薄層色譜(TCL)特征斑點(diǎn)清晰,專屬性強(qiáng),陰性無干擾;葛根素含量在0.196~0.980?μg范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積線性關(guān)系良好(r=0.9998,n=6),平均回收率為98.68%(RSD=0.68%,n=6)。結(jié)論:所建立的方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定,可用于葛芪平渴丸的質(zhì)量控制。

    【關(guān)鍵詞】?葛芪平渴丸;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);薄層色譜;高效液相色譜

    【中圖分類號(hào)】R284.1?【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】?A【文章編號(hào)】1007-8517(2019)21-0021-05

    Study?on?Quality?Standard?of?Geqipingke?Pilula

    XIN?Lingge?ZHAO?Rui*

    The?Second?Affiliated?Hospital?of?Shaanxi?University?of?Chinese?Medicine,Xianyang?712000,China

    Abstract:Objective?To?establish?a?quality?standar?for?Hospital?preparation?Geqipingke?Pilula.?Methods?The?kudzu?root,coicis?semen?and?coptis?chinensis?in?Geqipingke?Pilula?were?identified?by?thin?layer?chromatography(TLC),while?the?content?of?puerarin?in?Geqipingke?Pilula?were?determinated?by?high?performance?liquid?chromatography(HPLC).Results?TLC?results?were?clear,specific,negative?and?without?interference;?puerarin?showed?a?good?linear?relationship?in?the?range?of?0.196~0.980μg?(r=0.9998,n=6).The?average?recovery?was?98.68%(RSD=0.68%,n=6).Conclusion?The?method?is?accurate?and?stable,which?is?suitable?for?the?quality?control?of?Geqipingke?Pilula.

    Keywords:Geqipingke?Pilula;?Quality?Standard;?TLC;?HPLC

    “葛芪平渴丸”是我院脾胃腎病科名老中醫(yī)以辨證論治為基礎(chǔ),根據(jù)中醫(yī)藥理論,結(jié)合臨床實(shí)踐,總結(jié)多年的經(jīng)驗(yàn)組方,由葛根、黃連、薏苡仁、熟地黃等14味中藥材組成,具有益氣健脾、清熱生津、活血化瘀的功效,臨床上多用于Ⅱ型糖尿病合并肥胖、血脂異常、胰島素抵抗屬氣陰兩虛,熱毒夾瘀者,可有效控制Ⅱ型糖尿病及其并發(fā)癥。通過長(zhǎng)期的臨床應(yīng)用和對(duì)患者的隨訪,該方療效顯著,不良反應(yīng)及毒副作用小,使用安全,且價(jià)格低廉,深受廣大患者的好評(píng)。方中葛根為君藥,為豆科植物野葛?Pueraria?lobata(Willd.)?Ohwi的干燥根,多于秋、冬二季采挖。味甘、辛,性涼。歸脾胃肺經(jīng),具有解肌退熱、生津止渴、透疹、升陽止瀉的功效。臨床多用于外感發(fā)熱、口渴、消渴等癥[1]?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,葛根素能夠減少Ⅱ型糖尿病模型小鼠體內(nèi)蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)、真核起始因子?2a(eIF2a)和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)含量,降低腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性,達(dá)到降低血糖作用[2]。葛根總黃酮通過降低Ⅱ型糖尿病模型大鼠體內(nèi)血清中還原型谷胱甘肽(GSH)、一氧化氮合成酶(NOS)等含量,提升胰腺組織相關(guān)蛋白酶表達(dá),達(dá)到降低血糖、血脂作用[3]。

    中藥方劑大多以傳統(tǒng)的湯劑劑型為主,然而湯劑在煎煮前需浸泡,煎煮過程中需控制煎煮時(shí)間及次數(shù),遇到特殊中藥材需用特殊的方法進(jìn)行煎煮,并且湯劑在服用時(shí)具有口感差、服用量大、易變質(zhì)、攜帶不便等缺點(diǎn),給現(xiàn)代生活節(jié)奏越來越快的人們帶來了諸多不便。為了方便患者服用,適應(yīng)時(shí)代的發(fā)展,我院藥劑科制劑室對(duì)湯劑劑型進(jìn)行改良,研制了葛芪平渴丸,方便患者的服用與攜帶,市場(chǎng)前景廣闊,具有開發(fā)意義。為保證葛芪平渴丸的質(zhì)量,本研究從薄層色譜法、高效液相色譜法兩方面入手,制定該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),為臨床安全用藥提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

    1?儀器與試藥

    1.1?儀器?Agilent?1260高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司)、YP5002電子天平(瑞士梅特勒儀器有限公司)、DYQC型醫(yī)用超聲波提取器(連云港歐倍潔醫(yī)療設(shè)備有限公司)、DHG-9140型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司)、HH-2電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)、ZF-20D型暗箱式紫外分析儀(上海光豪分析儀器有限公司)。

    1.2?試藥?葛根素對(duì)照品(批號(hào):110752-201514)。葛根對(duì)照藥材(批號(hào):121551-201601)、薏苡仁對(duì)照藥材(批號(hào):121254-201203)、黃連對(duì)照藥材(批號(hào):120913-201109)均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。甲醇為色譜純(天津歐密科試劑公司)、其他所用化學(xué)試劑均為分析純、娃哈哈純凈水。

    1.3?葛芪平渴丸?由陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院制劑室提供,規(guī)格為:?每45丸約重6?g。批號(hào)為:150112、150114、150116。

    2?方法與結(jié)果

    2.1?薄層色譜鑒別[4]

    2.1.1?葛根[5-7]?取適量葛芪平渴丸置于研缽中,研細(xì),稱取粉末10.7?g,置于具塞的錐形瓶中,量取并加入甲醇30?mL,放入超聲儀,20?min后取出,取濾液蒸干,精密量取甲醇0.5?mL使殘?jiān)芙?,即為供試品溶液。稱取葛根對(duì)照藥材0.8?g,葛根對(duì)照藥材溶液的制備方法同上。再取不含葛根的其他藥材,同樣品制備工藝制備葛根陰性對(duì)照樣品,稱取陰性對(duì)照品10.5?g,同法制成葛芪平渴丸葛根陰性對(duì)照品溶液。參照(《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0502),精密吸取供試品溶液、葛根對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照品溶液各10?μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,展開劑的比例為:三氯甲烷-甲醇-水(7∶2.5∶0.25),展開,取出,晾干,置紫外光燈(365?nm)下檢視。供試品色譜中,在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。結(jié)果如圖1所示。

    2.1.2?薏苡仁[8]?葛芪平渴丸放于研缽中,研細(xì),準(zhǔn)確稱取粉末?25.3?g,置于具塞的錐形瓶中,量取并加入石油醚(60~90?℃)100?mL,超聲儀?30?min后取出,取濾液蒸干,精密加入石油醚(60~90?℃)1?mL使殘?jiān)芙猓礊楣┰嚻啡芤?。稱取薏苡仁對(duì)照藥材1.2?g,薏苡仁對(duì)照藥材溶液制備方法同上。再取除薏苡仁藥材外的其他藥材,按處方中藥味比例及葛芪平渴丸的工藝制成陰性對(duì)照品,稱取陰性對(duì)照品25.6?g,同葛芪平渴丸供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0502)試驗(yàn),準(zhǔn)確吸取上述三種溶液各10?μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以石油醚(60~90?℃)-乙酸乙酯-醋酸(25∶5∶1)為展開劑,展開,取出,晾干,置紫外光燈(365?nm)下檢視。供試品色譜中,在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn)。如圖2所示。

    2.1.3?黃連[9-10]?葛芪平渴丸研細(xì),稱取粉末20.3?g,放入具塞的錐形瓶中,量取并加入50?mL甲醇,冷浸1?h后,取濾液低溫蒸干,精密加入甲醇1?mL溶解殘?jiān)?,即為供試品溶液。稱取黃連對(duì)照藥材2.4?g,黃連對(duì)照藥材制備方法同上。再取不含黃連的其余藥材,按處方中藥味比例、工藝制成不含黃連的陰性樣品,稱取陰性對(duì)照品20.6?g,同葛芪平渴丸供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0502)試驗(yàn),分別吸取供試品溶液、黃連對(duì)照藥材溶液、陰性對(duì)照品溶液各5?μL,分別點(diǎn)于同一高效硅膠G薄層板上,以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇(6∶3∶1.5∶1.5∶0.5)為展開劑,在另側(cè)槽中加入與展開劑等體積的濃氨試液,預(yù)平衡15??min,展開,取出,晾干,置紫外光燈(365?nm)下檢視。供試品色譜中,在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn)。結(jié)果如圖3所示。

    2.2?含量測(cè)定[11-15]

    2.2.1?色譜條件?色譜柱:Thermo?C18(5μm,250?mm×4.6?mm);流動(dòng)相:甲醇-水(25∶75);檢測(cè)波長(zhǎng):250?nm;流速:1.0?mL/min;柱溫:25?℃;理論板數(shù)按葛根素計(jì)算應(yīng)不低于:3000。

    2.2.2?制備葛根素對(duì)照品溶液?精密稱取葛根素對(duì)照品2.45?mg,置于25?mL容量瓶中,30%乙醇溶解,定容至刻度,制成每50?mL含4.92?mg的對(duì)照品溶液。

    2.2.3?供試品溶液的制備?取適量樣品研成細(xì)粉,精密稱取1.0275?g,放于具塞錐形瓶中,精密移取并加入50?mL?30%乙醇溶液,密塞,準(zhǔn)確稱量并記錄,放入超聲儀中,30?min后,取出,放至室溫,稱量并記錄,用30%乙醇溶液補(bǔ)足超聲損失的重量,充分搖勻,取續(xù)濾液,即為供試品溶液。

    2.2.4?陰性干擾試驗(yàn)?取不含葛根的其余藥材,按處方中藥味比例、工藝制成不含葛根的陰性樣品。再根據(jù)“2.2.3”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照品溶液。精密量取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液各10?μL,分別注入高效液相色譜儀,設(shè)定方法,測(cè)定。根據(jù)液相色譜圖,陰性對(duì)照品在葛根素相對(duì)保留時(shí)間處未見色譜峰,陰性対照液色譜中則無此峰,結(jié)果顯示陰性樣品對(duì)該方法檢測(cè)幾乎無干擾,如圖4所示。

    2.2.5?線性關(guān)系考察?分別精密吸取葛根素對(duì)照品溶液(C=0.098?mg/mL)1、2、3、4、5?mL,置于5?mL容量瓶中,以30%乙醇溶解并定容至刻度。分別精密吸取10?μL注入液相色譜儀,按上述色譜條件測(cè)定峰面積。以葛根素的進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo),峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程Y=4976.5X-40.04,r?=0.9998(n=6),結(jié)果表明,葛根素在0.196~0.980?μg范圍內(nèi),峰面積線性關(guān)系良好,線性回歸曲線如圖5所示。

    2.2.6?穩(wěn)定性試驗(yàn)?取批號(hào)為150112的葛芪平渴丸,制備供試品溶液,分別于?0?h、4?h及?8?h,精密吸取供試品溶液?10?μL,按擬定色譜條件,測(cè)定葛芪平渴丸中葛根素的峰面積,結(jié)果葛根素峰面積值的RSD%=1.51%。結(jié)果表明,葛芪平渴丸供試品溶液在?8?h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    2.2.7?精密度試驗(yàn)?取供試品(批號(hào):150112),按上述供試品制備方法制備供試品溶液,精密吸取10?μL,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄峰面積,RSD%=0.29%。

    2.2.8?重復(fù)性試驗(yàn)?取同一批號(hào)樣品(批號(hào)150112),按擬定的樣品制備方法制備6份供試品溶液,依法測(cè)定含量,RSD%=1.46%。結(jié)果表明,本方法重復(fù)性良好。

    2.2.9?回收率試驗(yàn)?按加樣回收法進(jìn)行試驗(yàn),取樣品(批號(hào)150112)已知含量(葛根素3.1504?mg/g)的供試品適量,分別加入適量的葛根素對(duì)照品,按供試品制備方法制備,測(cè)定峰面積,以下式計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

    2.2.10?樣品測(cè)定?取葛芪平渴丸三批樣品(批號(hào)分別為:150112、150114、150116),按照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,依照上述色譜條件測(cè)定其含量。結(jié)果見表2。

    薄層色譜(TCL)葛根、黃連、薏苡仁特征斑點(diǎn)清晰,專屬性強(qiáng),陰性無干擾;葛根素含量在0.196~0.980?μg范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積線性關(guān)系良好(r=0.9998,n=6),平均回收率為98.68%(RSD=0.68%,n=6)。

    根據(jù)樣品測(cè)定結(jié)果,結(jié)合本制劑工藝及藥材含量,暫定本品每克含葛根以葛根素(C21H20O9)計(jì),不得少于2.50?mg。

    3?討論

    本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇、50%乙醇、30%乙醇等不同溶劑提取效果[16-18],結(jié)果顯示:甲醇、50%乙醇、30%乙醇超聲30?min,制備的供試品中葛根素的含量幾乎相同,依照優(yōu)化工藝及節(jié)省資源的原則,結(jié)合《中國(guó)藥典》2015年版一部,選用30%乙醇作為供試品的制備溶劑。

    本實(shí)驗(yàn)還考察了15?min、30?min、45?min等不同超聲時(shí)長(zhǎng)的影響因素,結(jié)果顯示:超聲30?min制備的供試品中葛根素的含量最高,故確定30%乙醇超聲30?min作為制備葛芪平渴丸供試品溶液的方法。

    本試驗(yàn)對(duì)處方中葛根、黃連、薏苡仁三味中藥材進(jìn)行薄層色譜鑒別,對(duì)處方中君藥葛根指標(biāo)性成分葛根素進(jìn)行含量測(cè)定,從而建立該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。該試驗(yàn)方法操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性高,結(jié)果穩(wěn)定,可用于同種劑型中藥制劑的質(zhì)量檢測(cè)。目前大多數(shù)中藥制劑主要從薄層色譜定性鑒別和高效液相色譜法含量檢測(cè)兩方面入手,選取制劑處方中的部分藥材進(jìn)行檢測(cè),制定其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

    近年來,隨著中藥制劑的現(xiàn)代化發(fā)展及院內(nèi)制劑的開發(fā),高效液相色譜法廣泛用于中藥材有效成分的含量檢測(cè),但該方法并不是檢測(cè)藥品有效成分含量的唯一方法,氣相色譜法、液-質(zhì)聯(lián)用法、GC-MS聯(lián)用法、薄層色譜掃描法、核磁共振波普法等檢測(cè)方法逐漸運(yùn)用到中藥有效成分含量的檢測(cè)當(dāng)中,各種方法均具有其優(yōu)缺點(diǎn);中藥制劑主要為復(fù)方制劑,以辨證論治為基礎(chǔ),根據(jù)中醫(yī)藥理論組方而成,大多數(shù)的院內(nèi)制劑,為臨床使用的經(jīng)驗(yàn)方,長(zhǎng)期臨床應(yīng)用療效顯著,不良反應(yīng)小,深受患者的好評(píng),為了方便患者的服用及攜帶,中藥湯劑被逐漸改良為現(xiàn)代劑型,這就對(duì)中藥制劑的質(zhì)量要求也越來越高,由于中藥材成分復(fù)雜,檢測(cè)過程中易產(chǎn)生干擾,中成藥中有效成分的檢測(cè)更是如此,要求我們優(yōu)化供試品的制備方法,以節(jié)省資源、降低干擾成分、易操作為原則,采用不同的方法,檢測(cè)中藥制劑中有效成分及其含量范圍,對(duì)確保中藥制劑的質(zhì)量及穩(wěn)定性生產(chǎn)具有重要意義。

    葛芪平渴丸是我院脾胃腎病科名老中醫(yī)的經(jīng)驗(yàn)方,由葛根、黃連、薏苡仁、熟地黃等十四味中藥材組成,其作用是處方中各味中藥材共同作用的結(jié)果,且中藥有效成分復(fù)雜多樣,為了更進(jìn)一步研究發(fā)揮作用的有效成分及物質(zhì)基礎(chǔ),在今后的試驗(yàn)研究中,應(yīng)從處方中各味中藥材入手,根據(jù)中醫(yī)藥理論及藥物之間的配伍關(guān)系,運(yùn)用多種檢測(cè)方法對(duì)其進(jìn)行研究,從而制定更完善的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),為臨床安全使用提供可靠的數(shù)據(jù)和試驗(yàn)研究資料。

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    (收稿日期:2019-08-26?編輯:程鵬飛)

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