CRISPR／Cas9技術(shù)及其在非編碼RNA編輯中的應(yīng)用

王 瑚 夏紅飛 馬 旭

1.國家衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所遺傳優(yōu)生中心（北京，100081）；2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院

基因的定點(diǎn)修飾一直以來都是研究基因功能的重要手段之一，也注定會(huì)成為現(xiàn)代分子遺傳學(xué)的研究熱點(diǎn)。早期的基因定點(diǎn)修飾技術(shù)是基因打靶，一種基于同源重組的低效的基因修飾技術(shù)。此后，人工核酸內(nèi)切酶的出現(xiàn)改變了這一局面。目前為止，研究者共發(fā)現(xiàn)了三代人工核酸內(nèi)切酶。鋅指核酸內(nèi)切酶（ZFN）是其中的第一代，是由鋅指蛋白（一種可與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)）與核酸內(nèi)切酶FokⅠ兩部分融合形成的［1］，可在基因組的特定位置切割DNA雙鏈，但繁復(fù)的操作和昂貴的成本限制了廣泛應(yīng)用。第二代人工核酸內(nèi)切酶被稱作類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALEN），其原理與ZFN類似，均由DNA結(jié)合蛋白與FokⅠ兩部分融合而成，操作較ZFN更簡便、特異性更高，在酵母細(xì)胞中應(yīng)用成功后，迅速擴(kuò)展到植物、動(dòng)物以及人類細(xì)胞［2－3］。上述兩種人工核酸內(nèi)切酶均為DNA導(dǎo)向。此后，一種操作簡便、成本低廉、作用高效的RNA導(dǎo)向的人工核酸內(nèi)切酶 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（CRISPR）／CRISPR-associated（Cas）出現(xiàn)［4］，并迅速如狂風(fēng)暴雨般席卷整個(gè)基因編輯領(lǐng)域。

1 CRISPR／Cas技術(shù)

CRISPR／Cas是一種細(xì)菌和古細(xì)菌的獲得性免疫系統(tǒng)（約90%的古細(xì)菌和40%的細(xì)菌具有該系統(tǒng)［5］），在RNA的介導(dǎo)下，可以特異性切割外源遺傳物質(zhì)，用以抵御噬菌體或質(zhì)粒的入侵。該系統(tǒng)的基因座由tracrRNA（crRNA）基因、Cas核酸酶編碼基因和CRISPR基因座三部分構(gòu)成。其中，CRISPR基因座首先被轉(zhuǎn)錄成前體CRISPR RNA（pre-crRNA），然后在Cas核酸酶的作用下形成成熟的crRNA，由一個(gè)間隔序列和部分重復(fù)序列組成；tracrRNA基因轉(zhuǎn)錄出的tracrRNA用于指導(dǎo)crRNA成熟；Cas核酸酶主要用于靶DNA的定點(diǎn)切割，也會(huì)參與crRNA的成熟。

在行使功能時(shí)，CRISPR／Cas系統(tǒng)可分為兩部分：一是處理外來信息，獲取新的間隔序列，主要由核心蛋白Cas1和Cas2完成；二是CRISPR RNA的轉(zhuǎn)錄和加工，以及識(shí)別和降解外源遺傳物質(zhì)的過程，據(jù)此又可將CRISPR／Cas系統(tǒng)分為TypeⅠ、TypeⅡ、TypeⅢ3種類型［6］。3種類型所含的標(biāo)志性Cas蛋白種類有所不同，在crRNA的加工和目標(biāo)DNA雙鏈的切割過程以及分布中也略有差異：TypeⅠ含標(biāo)志性蛋白Cas3，同時(shí)具備解旋酶和核酸酶功能，此外還含有Cas5、Cas6e、Cas7等蛋白，他們主要參與crRNA的加工，在細(xì)菌和古細(xì)菌中均有分布；TypeⅡ系統(tǒng)僅存在于細(xì)菌中，含有標(biāo)志性蛋白Cas9，既能參與crRNA的加工，也能降解外來遺傳物質(zhì)；而TypeⅢ的標(biāo)志性蛋白Cas10同樣可以參與crRNA成熟及靶序列降解，其余蛋白如Cas6等可參與crRNA的成熟，該型大多數(shù)存在于古細(xì)菌中，只有少數(shù)細(xì)菌擁有此型［7］。

CRISPR／Cas系統(tǒng)在發(fā)揮作用時(shí)，主要包括如下三個(gè)階段［6］。

第一，間隔序列的獲得。本質(zhì)上就是外源遺傳物質(zhì)的一小段DNA整合到宿主菌基因組CRISPR基因座中的過程。外源噬菌體或質(zhì)粒上與間隔序列所對應(yīng)的序列被稱作protospacer，其5’或3’端2～5個(gè)保守的堿基被稱作前間隔序列鄰近基序（PAM）區(qū)［8］。宿主菌首先識(shí)別外源核酸并掃描潛在的PAM，將臨近PAM的序列作為候選protospacer，隨后在CRISPR基因座的5’端合成重復(fù)序列，最后將新合成的間隔序列整合到重復(fù)序列之間；這樣，宿主菌便獲得了間隔序列并能在該外源核酸再次入侵時(shí)發(fā)揮作用。

第二，CRISPR基因座的表達(dá)。CRISPR基因座首先被轉(zhuǎn)錄成pre－crRNA，之后經(jīng)過一系列的剪切最終形成成熟的crRNA，這個(gè)過程需要多種Cas蛋白和核酸內(nèi)切酶的參與［9］。CRISPR基因座在正常情況下表達(dá)水平很低［10］，一旦有外源遺傳物質(zhì)入侵，其表達(dá)水平會(huì)被迅速上調(diào)［11］。

第三，干擾外來遺傳物質(zhì)。成熟的crRNA形成之后，與特定的Cas蛋白形成復(fù)合物，復(fù)合物結(jié)合并掃描外源DNA，crRNA的間隔序列利用堿基互補(bǔ)配對與靶序列結(jié)合，之后復(fù)合物能在配對的特定位置將靶序列切割。值得一提的是，在這個(gè)過程中PAM序列發(fā)揮了很重要的作用，如果沒有PAM序列或PAM序列突變，即使crRNA與靶序列完美配對，復(fù)合物也無法發(fā)揮作用［12］。這也是CRISPR／Cas系統(tǒng)能夠避免發(fā)生自身免疫的手段之一。

2 CRISPR／Cas9技術(shù)的發(fā)展進(jìn)程

在上述提及的3種CRISPR／Cas系統(tǒng)中，由于其簡易性和可操作性，TypeⅡ得到了最廣泛的應(yīng)用，被改造成迄今為止最有力的基因編輯工具—CRISPR／Cas9。CRISPR／Cas9來源于SF370釀膿鏈球菌株（SF370），Cas9蛋白是一種核酸內(nèi)切酶，包括RuvC和HNH兩個(gè)活性中心，在crRNA的指導(dǎo)下可以分別切割DNA的一條鏈，最終造成DNA雙鏈斷裂（DSB）。TypeⅡ型基因座上游還會(huì)表達(dá)tracrRNA，用于參與crRNA的成熟加工［13］。為了操作方便，現(xiàn)在普遍使用的是crRNA和tracrRNA嵌合在一起的一條RNA鏈，稱之為單鏈向?qū)NA（sgRNA）。

在造成靶序列DSB后，細(xì)胞會(huì)利用體內(nèi)的修復(fù)機(jī)制修復(fù)損傷的DNA，在修復(fù)過程中會(huì)造成堿基的突變、插入或缺失，進(jìn)而有造成該基因失活的可能。利用CRISPR／Cas9的特性，研究者很快就在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中成功實(shí)現(xiàn)了基因編輯［14－15］，隨后該技術(shù)又在多種生物體內(nèi)得到了應(yīng)用，成功獲得了多種基因修飾后的生物［16］。

利用CRISPR／Cas9系統(tǒng)除了能進(jìn)行單基因敲除外，如向動(dòng)物細(xì)胞或受精卵中同時(shí)注射多個(gè)sgRNA，就能得到多個(gè)基因敲除的細(xì)胞系或個(gè)體，相較單基因敲除后再進(jìn)行交配的辦法，大大節(jié)約了時(shí)間和成本。例如Zhou等［17］一次注射靶向5個(gè)免疫相關(guān)的sgRNA，一步得到不同免疫基因缺陷的小鼠。利用該系統(tǒng)造成DSB后，如同時(shí)提供一段攜帶同源臂的供體DNA，利用體內(nèi)的同源重組機(jī)制，可以在基因組中定點(diǎn)插入一段外源序列［18］。除此之外，在基因調(diào)控、基因修復(fù)、文庫篩選等領(lǐng)域，CRISPR／Cas9系統(tǒng)均發(fā)揮著重要作用。

在多次入選《Science》年度十大科學(xué)突破之后，近年來全世界的研究者對CRISPR／Cas9技術(shù)的關(guān)注達(dá)到了前所未有的高度，各項(xiàng)新進(jìn)展、新突破也如雨后春筍般層出不窮。許多研究者的目光聚焦于編輯的精確性。不可避免的一個(gè)問題是，CRISPR／Cas9系統(tǒng)會(huì)有脫靶現(xiàn)象發(fā)生［19］。為解決這一問題，研究者發(fā)現(xiàn)，首先突變Cas9的RuvC活性中心，使之成為切口酶（Cas9-D10A，切割sgRNA的互補(bǔ)鏈而不是雙鏈），配合兩條距離足夠近但是結(jié)合在不同DNA鏈上的sgRNA；這樣兩個(gè)相距很近的單鏈斷裂就會(huì)造成DSB［20］，而在脫靶序列處只會(huì)造成DNA單鏈斷裂，這個(gè)修復(fù)過程很少發(fā)生突變。

同樣是利用Cas9切口酶，目前已有研究者得到了單核苷酸編輯的轉(zhuǎn)基因小鼠［21］，他們使Cas9切口酶與胞苷脫氨酶（CD）融合在一起，復(fù)合體CRISPR－nCas9－CD能將一種核苷酸替換為另一種核苷酸，這一復(fù)合體因此也被稱作堿基編輯器。這一成果在精準(zhǔn)醫(yī)療逐步推進(jìn)的今天，無疑具有里程碑式的意義。

對Cas9蛋白的改造不止于此，還有研究者通過突變Cas9令其“死亡”（dCas9），即能夠靶向結(jié)合基因組中的特定位點(diǎn)，但是不再切割DNA；這就使其與靶基因的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（TAD，起分子開關(guān)作用）結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄（卻不會(huì)損傷靶基因）成為可能［22］。Harrington等［23］則發(fā)現(xiàn)了兩種Cas9抑制蛋白AcrIIC1和AcrIIC3，AcrIIC1可以結(jié)合Cas9中的HNH活性中心，將Cas9限制在一種可以與DNA結(jié)合但沒有內(nèi)切酶活性的狀態(tài)；而AcrIIC3會(huì)誘導(dǎo)Cas9形成二聚體，阻止Cas9結(jié)合到靶DNA上。

雖然CRISPR／Cas9系統(tǒng)已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，但對其探索從未停止。CRISPR系統(tǒng)最初是來自于細(xì)菌和古細(xì)菌，而現(xiàn)在卻很少有研究者再將其應(yīng)用于古細(xì)菌中。原核生物中DNA損傷修復(fù)主要是靠同源重組（HDR）來完成，而非同源末端連接（NHEJ）非常罕見。事實(shí)上，HDR確實(shí)更為精密，但如果是為了突變這個(gè)基因，NHEJ會(huì)更加高效。有研究者在模式古細(xì)菌乙酸甲烷八疊球菌中引入了NHEJ機(jī)制，大大提高了利用CRISPR／Cas9對古細(xì)菌遺傳學(xué)的研究效率［24］。

Cas9蛋白找到靶序列需要花多長時(shí)間，通過熒光標(biāo)記Cas9分子的研究結(jié)果表明，一個(gè)Cas9分子搜索完成一個(gè)細(xì)菌基因組（400萬個(gè)堿基對）需要花費(fèi)6小時(shí)［25］，意味著為了更快地發(fā)現(xiàn)靶序列，需要更多的Cas9分子。

CRISPR／Cas9系統(tǒng)在被應(yīng)用于定點(diǎn)敲入時(shí)，需要提供一段每個(gè)末端都存在同源臂的供體DNA，以便封閉切割所造成的空隙。有研究者利用攜帶綠色熒光蛋白的donor DNA轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，研究同源臂的長度與編輯成功率的關(guān)系。結(jié)果表明，長度為33～38nt的同源臂與長度為518nt的同源臂的編輯成功率相同，均為10%～20%；而同源臂縮短至15～16nt后，成功率下降了50%。而donor DNA（不含同源臂）的長度在57～993nt時(shí)，編輯成功率在10%～50%，長度越短編輯成功率越高；超過1000nt后，成功率會(huì)降至0.5%左右［26］。

吸引最多目光的自然還是與人類健康相關(guān)領(lǐng)域。Tmc1是內(nèi)耳中檢測聲波的毛細(xì)胞發(fā)揮功能所必須的一個(gè)基因，若其發(fā)生突變會(huì)導(dǎo)致進(jìn)行性聽力喪失。有研究者已利用CRISPR／Cas9技術(shù)使該突變版本失活，成功在小鼠中降低了這種聽力喪失［27］。一些更為激進(jìn)的科學(xué)家已經(jīng)在人胚胎中開展了相關(guān)研究，MYBPC3基因突變會(huì)導(dǎo)致心臟病，他們成功校正了這一突變［28］。這使我們相信，利用CRISPR／Cas9技術(shù)校正人胚胎中的致病性突變已成為可能。

3 CRISPR／Cas9技術(shù)在非編碼RNA編輯中的應(yīng)用

非編碼RNA（ncRNAs）指不具有蛋白編碼功能的RNA，早期的研究者認(rèn)為非編碼基因不具備生物學(xué)功能，后來的研究發(fā)現(xiàn)這些“垃圾DNA”是具有生物學(xué)功能的。有生物學(xué)功能的ncRNA主要包括核不均一RNA（hnRNA）、核內(nèi)小RNA（snRNA）、小核仁RNA（snoRNA）、微小RNA（miRNA）和長非編碼RNA（lncRNA）等［29］。這些占轉(zhuǎn)錄組中絕大多數(shù)的ncRNA參與了生物體內(nèi)包括分化、凋亡、免疫等在內(nèi)的幾乎所有生理、病理過程［30］。其中miRNA和lncRNA研究較多，但是利用CRISPR／Cas9技術(shù)對ncRNA編輯的報(bào)道卻相對較少。

我們知道，在CRISPR／Cas9系統(tǒng)編輯編碼基因的CDS區(qū)時(shí)，只要有個(gè)別堿基的插入或缺失，就會(huì)影響到開放閱讀框，進(jìn)而產(chǎn)生錯(cuò)義突變或無義突變，使整個(gè)基因失活。而在編輯ncRNA的DNA時(shí)，個(gè)別堿基的缺失可能不會(huì)使ncRNA整個(gè)失活，進(jìn)而會(huì)影響到編輯效果，這也無疑增加了編輯ncRNA的難度。為解決這個(gè)問題，研究者主要采用設(shè)計(jì)兩條sgRNA進(jìn)行片段敲除的辦法。

3.1 CRISPR／Cas9技術(shù)在miRNA編輯中的應(yīng)用

miRNA是一類長約22nt，具有廣泛生物活性的ncRNA，成熟過程主要為：首先，在細(xì)胞核中轉(zhuǎn)錄形成pri-miRNA，并由核糖核酸酶Drosha加工成pre－miRNA，隨后進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，再在核糖核酸酶Dicer的剪切作用下形成成熟的miRNA［31］。

成熟的miRNA主要通過與靶基因3’UTR上的靶點(diǎn)進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對實(shí)現(xiàn)對靶基因的表達(dá)調(diào)控，當(dāng)它與靶點(diǎn)完全互補(bǔ)時(shí)，RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）使mRNA降解；而當(dāng)miRNA與靶點(diǎn)序列不完全互補(bǔ)時(shí)，RISC則對mRNA翻譯起到抑制作用［32－33］。也有研究表明，miRNA 也會(huì)通過結(jié)合來降低lncRNA的表達(dá)量［34］。哺乳動(dòng)物中，大多數(shù)編碼蛋白質(zhì)的mRNA都會(huì)受到miRNA的調(diào)控。

之前已有報(bào)道證實(shí)，可以利用CRISPR／Cas9系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)多基因的敲除［17］。利用該辦法，有研究者在斑馬魚中注射Cas9蛋白mRNA和位于pre－miR?126a兩側(cè)的兩條sgRNA；還在其中注射Cas9蛋白mRNA和位于一個(gè)含有6個(gè)miRNA的基因簇兩側(cè)的兩條sgRNA。雖然效率還不甚理想，但均實(shí)現(xiàn)了對單個(gè)miRNA和miRNA簇的全部敲除［35］。

為解決同時(shí)導(dǎo)入兩條sgRNA效率不高的問題，Ho等［36］提出了將雙sgRNA構(gòu)建在同一個(gè)載體上的辦法，他們在同一載體上分別引入了U6和H1兩個(gè)啟動(dòng)子，使兩條sgRNA同時(shí)表達(dá)，成功且高效地在細(xì)胞系中切除了一段長約5.6kb的片段。同時(shí)，他們還在HEK293、HEK293T、HCT116等細(xì)胞系中實(shí)現(xiàn)了Cas9和供體質(zhì)粒共同敲除miRNA。他們構(gòu)建了一個(gè)包括同源臂，且在同源臂之間含有為loxP－GFP－PU－TK－loxP序列的供體質(zhì)粒，將該質(zhì)粒與傳統(tǒng)的表達(dá)sgRNA和Cas9蛋白的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，利用綠色熒光蛋白（GFP）和嘌呤霉素（PU）進(jìn)行篩選，得到了loxP－GFP－PU－TK－loxP序列成功置換pre－miR－21的細(xì)胞系，再引入Cre重組酶，將loxP位點(diǎn)之間的序列刪去，成功得到了premiR－21完全敲除的細(xì)胞系。

CRISPR／Cas9切割的是雙鏈DNA，但是當(dāng)編碼miRNA的序列被編輯后，能否長期穩(wěn)定地存在下去，有研究者就將敲除miR－17的表達(dá)載體和對照載體分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 HT－29和 HCT116細(xì)胞，10，20，30天之后分別檢測miR－17的表達(dá)量。盡管載體逐漸消失，但是miR－17的表達(dá)量在整個(gè)過程中持續(xù)下調(diào)，這個(gè)結(jié)果在裸鼠體內(nèi)也得到了驗(yàn)證［37］，證實(shí)CRISPR／Cas9技術(shù)編輯miRNA是可靠而穩(wěn)定的。

miRNA發(fā)揮生物學(xué)功能主要依賴于靶向一個(gè)或多個(gè)mRNA的“種子序列”，有研究證實(shí)在同一個(gè)miRNA家族內(nèi)，數(shù)個(gè)miRNA即使擁有相同的種子序列也會(huì)有各異的生物學(xué)功能。而CRISPR／Cas9則將單獨(dú)研究每個(gè)miRNA的生物學(xué)功能成為可能。miR－106a，miR－17以及 miR－93均能靶向心臟抑制基因Fog2，但是當(dāng)每個(gè)miRNA單獨(dú)被敲除時(shí)，便可發(fā)現(xiàn)它們針對Fog2的靶向效力不同，進(jìn)而導(dǎo)致不同程度的心臟分化［38］。

此前，已有不少研究者利用CRISPR／Cas9技術(shù)構(gòu)建了文庫用于蛋白質(zhì)功能的規(guī)?；Y選；現(xiàn)在，也有研究者構(gòu)建了針對miRNAs的CRISPR／Cas9文庫，可以靶向1594（85%）的人miRNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，每個(gè)miRNA都會(huì)被4～5條sgRNA靶向。利用該文庫，研究者篩選出了5種在宮頸癌中上調(diào)的miRNAs和6種在胃癌中上調(diào)的miRNAs，其中有的miRNA是已知與腫瘤發(fā)生有關(guān)的，也有的是此前未知功能的［39］。

3.2 CRISPR／Cas9技術(shù)在lncRNA編輯中的應(yīng)用

lncRNA長度在200nt以上，但保守性較差。lncRNA結(jié)構(gòu)與mRNA類似，含有多個(gè)外顯子，大多也會(huì)有5’端“帽子”結(jié)構(gòu)和3’端多聚腺苷酸“尾巴”［30］。lncRNA可以作為信號分子在信號通路中起到調(diào)控作用，也可以引導(dǎo)蛋白招募到特定靶點(diǎn)，還可以與蛋白形成核糖核蛋白復(fù)合物，使多種蛋白協(xié)同發(fā)揮作用［40］。現(xiàn)已證實(shí)lncRNA與多種疾病均有密切關(guān)系。與miRNA相同，研究者利用同時(shí)顯微注射兩條sgRNA的辦法，得到了一條23kb片段缺失的小鼠，缺失部分包括一條lncRNA［41］。已證明lncRNA與多種疾病有關(guān)，因此大多數(shù)研究者的目光投向了借助CRISPR／Cas9技術(shù)治療疾病。兩種lncRNA，PVT1和ANRIL被認(rèn)為與膀胱癌有關(guān)，而四環(huán)素可以誘導(dǎo)Cas9的表達(dá)。故研究者設(shè)計(jì)靶向這兩條lncRNA的CRISPR／Cas9系統(tǒng)，并采用四環(huán)素誘導(dǎo)，可以顯著抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖和遷移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［42］。

除癌癥外，CRISPR／Cas9也被用于研究其它疾病。Pax1和Pax9均為生骨節(jié)的早期標(biāo)志，此外，lnRNA PEAT（Pax1增強(qiáng)子反義轉(zhuǎn)錄物）位于Pax1基因的上游，對該基因的表達(dá)起調(diào)控作用。利用CRISPR／Cas9技術(shù)敲除lnRNA PEAT后，突變體胚胎中骨形態(tài)發(fā)生蛋白靶基因的表達(dá)得到了適度增加，同時(shí)也上調(diào)了核糖體蛋白的表達(dá)［43］。內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成受到很多因素調(diào)控，lncRNA是其中重要因素。研究者綜合利用了質(zhì)譜、免疫共沉淀以及CRISPR／Cas9等技術(shù)，在肺和腫瘤患者樣品中尋找調(diào)控血管生成相關(guān)的lncRNA。結(jié)果顯示，MANTIS是其中調(diào)控作用最強(qiáng)烈的lncRNA，在組蛋白去甲基化酶JARID1B的調(diào)控下，MANTIS在特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓患者和用野百合堿處理過的大鼠中表達(dá)量下調(diào)，而在人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者和被動(dòng)脈粥樣硬化食物飼喂過的食蟹猴的頸動(dòng)脈中分離出來的內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)量上調(diào)［44］。

除人類疾病外，CRISPR／Cas9技術(shù)編輯lncRNA還有其他方面的應(yīng)用。植物中l(wèi)ncRNA的功能大多是未知的，利用CRISPR／Cas9技術(shù)在番茄中構(gòu)建lncRNA 1459的缺失突變體，與野生型相比，突變個(gè)體在果實(shí)成熟過程受到顯著抑制，其中與乙烯和類胡蘿卜素產(chǎn)生相關(guān)的基因表達(dá)量顯著下調(diào)，揭示了lncRNA 1459在番茄成熟過程中的作用［45］。

同時(shí)，也不可忽略CRISPR／Cas9技術(shù)在面對lncRNA編輯時(shí)所面臨的挑戰(zhàn)。因許多l(xiāng)ncRNA由雙向啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，或者其可能與編碼基因發(fā)生重合。有研究者采用全基因組分析，系統(tǒng)分析了CRISPR技術(shù)是否適用于全部lncRNA。結(jié)果顯示，15925個(gè)lncRNA位點(diǎn)中僅有38%可以安全使用CRISPR技術(shù)進(jìn)行基因編輯，近2／3的位點(diǎn)存在各種各樣的風(fēng)險(xiǎn)或問題［46］。為使CRISPR／Cas技術(shù)更廣泛、更安全地應(yīng)用于lncRNA編輯中，還需更多的努力和探索。

4 總結(jié)與展望

CRISPR／Cas技術(shù)自問世以來就成為了生物學(xué)研究者的“寵兒”，今天仍在迅速發(fā)展和不斷完善的過程中。占轉(zhuǎn)錄組中絕大多數(shù)的ncRNA參與了生物體內(nèi)幾乎所有生理、病理過程，但是相比較編碼基因，我們對ncRNA的了解仍嫌不足。作為研究ncRNA功能的重要手段之一，利用CRISPR／Cas技術(shù)構(gòu)建ncRNA敲除模型必將起著不可或缺的作用。越來越多研究者的目光正在聚焦于此，相信CRISPR／Cas技術(shù)在研究ncRNA功能中注定會(huì)有著廣泛的應(yīng)用和重要的價(jià)值，越來越多的ncRNA也會(huì)褪去神秘面紗展現(xiàn)在我們面前。