兔眼藍(lán)莓組培體系建立及多倍體誘導(dǎo)研究

何夢(mèng)鈴 楊娜 劉小珍

摘要 ? ?藍(lán)莓具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，但其繁殖速度慢、果實(shí)較小、采摘成本高，優(yōu)化現(xiàn)有的藍(lán)莓品種具有良好的發(fā)展前景。本文以兔眼藍(lán)莓燦爛幼嫩莖段為試驗(yàn)材料開展組織培養(yǎng)研究，采用不同的培養(yǎng)基配比激素以及設(shè)置不同濃度用以研究出最適合兔眼藍(lán)莓燦爛生長的、穩(wěn)定的、可重復(fù)性強(qiáng)的培養(yǎng)基配方，建立葉片再生體系，并采用秋水仙素培養(yǎng)基添加法對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)。在無菌條件下切取由葉片再生形成的長勢較好苗的帶葉莖尖（長約0.5 cm），接種到秋水仙素濃度為10、20、30、40、50、60 mg/L的6種培養(yǎng)基中。結(jié)果表明，最適兔眼藍(lán)莓燦爛腋芽啟動(dòng)培養(yǎng)基是配方WPM+0.005 mg/L NAA+2.0 mg/L ZT+20 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂，誘導(dǎo)效果最佳，發(fā)芽率高達(dá)93%以上;取離體葉片再生芽苗的莖尖進(jìn)行共培養(yǎng)誘導(dǎo)多倍體，50 mg/L秋水仙素處理50 d和60 mg/L秋水仙素處理30 d或40 d時(shí)，誘導(dǎo)植株變異的效果最佳，變異率均達(dá)30%以上。

關(guān)鍵詞 ? ?兔眼藍(lán)莓;組織培養(yǎng);秋水仙素;培養(yǎng)基添加法;多倍體

中圖分類號(hào) ? ?S663.9 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ? ?A

文章編號(hào) ? 1007-5739（2019）23-0059-03 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）

Abstract ? ?Blueberry has high nutritional value and economic value，but its propagation speed is slow，the fruit is small，the harvesting cost is high，so the optimization of existing blueberry varieties has a good development prospect. In this study，the young stem segment of Vaccinium ashei ′Brilliant′ was used as the experimental material to carry out tissue culture research. Different ratios and concentrations of hormones were used to develop the most suitable component for the stable and reproducible culture medium of V. ashei ′Brilliant′.The leaf regeneration system and polyploidy induction system were established，and it was induced by colchicine medium addition method. Under sterile conditions，the leaf tips of the growing seedlings （about 0.5 cm long） formed by leaf regeneration were inoculated into 6 mediums containing colchicine concentration of 10，20，30，40，50，60 mg/L. The results showed that the optimal axillary bud initiation medium for V. ashei ′Brilliant′ was WPM+0.005 mg/L NAA+2.0 mg/L ZT+20 g/L sucrose+6 g/L agar，the inducing effect was the best，and the germination rate was over 93%. The leaf tips of the growing seedlings formed by leaf regeneration in vitro was co-cultured to induce polyploidy，when treated with 50 mg/L colchicine for 50 d and 60 mg/L colchicine for 30 d or 40 d，the plant variation effect was the best，the variation rate was over 30%.

Key words ? ?Vaccinium ashei;tissue culture;colchicine;medium addition method;polyploidy

藍(lán)莓為杜鵑花科（Vacciniaceae）越橘屬（Vaccinium）植物，是一種多年生灌木小漿果果樹[1]。藍(lán)莓是越橘屬中經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的一種，其生態(tài)適應(yīng)性、長勢和抗病蟲性較強(qiáng)，且品質(zhì)佳，口感好，主要優(yōu)良品種有杰兔、燦爛、園藍(lán)、巨豐等[2]。其果實(shí)中含有豐富的營養(yǎng)成分，具有增強(qiáng)人機(jī)體免疫、軟化血管、抗癌、強(qiáng)心、保護(hù)視力、防止腦神經(jīng)老化等功能。作為一種新的經(jīng)濟(jì)類型水果，也被廣泛用于鮮果、飲料、保健用品等食用形式，需求量較大。因此，藍(lán)莓具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，有較好的經(jīng)濟(jì)發(fā)展前景。

隨著我國對(duì)藍(lán)莓引種栽培規(guī)模日益擴(kuò)大，優(yōu)良種苗需求量急劇增加。藍(lán)莓的傳統(tǒng)繁殖方法主要是扦插法繁殖和嫁接繁殖法，這種方法繁殖速度慢，其種苗生產(chǎn)仍然供不應(yīng)求。而組織培養(yǎng)可以在藍(lán)莓的任意生長階段進(jìn)行擴(kuò)繁，可以迅速去除藍(lán)莓中病毒，變異性小，且可在較小空間內(nèi)快速地獲得大量無性系組培苗。因此，組織培養(yǎng)更能滿足快速發(fā)展藍(lán)莓栽培的需要。

關(guān)于藍(lán)莓的組織培養(yǎng)擴(kuò)大繁殖，國外已有大量的報(bào)道。目前，已經(jīng)在高叢、矮叢及兔眼藍(lán)莓的多個(gè)類群中進(jìn)行了離體再生的研究[3-11]。

目前普遍栽培的兔眼藍(lán)莓為二倍體，存在營養(yǎng)物質(zhì)含量和產(chǎn)量相對(duì)較低、果實(shí)較小的缺陷，而多倍體藍(lán)莓不僅生長勢和抗性強(qiáng)，且果實(shí)產(chǎn)量高、品質(zhì)好、果大。多倍體育種對(duì)于兔眼藍(lán)莓的耐貯性、抗逆性和增大果個(gè)等特性有很大的提高[12]，能培育出更有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的品種。

藍(lán)莓品種的多倍體誘導(dǎo)是多倍體離體誘導(dǎo)的重要研究對(duì)象且藍(lán)莓果實(shí)較小，不適宜機(jī)械采收，人工采收費(fèi)用高，而多倍體植株在遺傳學(xué)上具有巨大性。為解決繁殖系數(shù)低、果小、病毒等問題，本研究擬以兔眼藍(lán)莓優(yōu)良單株進(jìn)行組織培養(yǎng)，確立最適合兔眼藍(lán)莓生長的、穩(wěn)定的、可重復(fù)性強(qiáng)的培養(yǎng)基配方，建立組培體系，進(jìn)而對(duì)長勢較好的莖尖進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)，獲得的變異植株可用作于兔眼藍(lán)莓的多倍體研究從而解決果個(gè)小等問題。

1 ? ?材料與方法

1.1 ? ?供試材料

采用生長旺盛的燦爛品種的嫩枝作為試驗(yàn)材料，所有的外植體材料均采自西南林業(yè)大學(xué)優(yōu)良藍(lán)莓種質(zhì)資源圃。

1.2 ? ?兔眼藍(lán)莓葉片再生體系建立

1.2.1 ? ?外植體的選擇與消毒。選取燦爛的當(dāng)年生嫩莖，去除葉柄和葉片，用肥皂水洗凈，在線狀自來水下沖洗1～2 h，剪成1～2 cm長、含1～2個(gè)葉腋的莖段，放于滅過菌的外植體缸內(nèi)，移至超凈工作臺(tái)上，并設(shè)計(jì)不同處理時(shí)間、不同濃度組合處理的消毒方法，放于滅過菌的墊有濾紙的接種盤內(nèi)，使濾紙能夠吸干外植體表面的殘留水分。在接種7 d后統(tǒng)計(jì)污染率。每個(gè)處理組合接種30瓶，重復(fù)3次。最終確定處理組合5（75%酒精18 s、0.1%升汞10 min、暗培養(yǎng)7 d）為最優(yōu)消毒方案，污染率僅為3.3%，發(fā)芽率高達(dá)93%。

1.2.2 ? ?腋芽誘導(dǎo)與增殖培養(yǎng)。不定芽增殖正交實(shí)驗(yàn)，影響因素包括ZT、NAA。具體方案如表1所示。將莖段兩端分別切去2～4 mm，平放在啟動(dòng)培養(yǎng)基上，葉腋朝上，接種在各種不同激素組合的培養(yǎng)基中，其中含20 g/L蔗糖、6 g/L瓊脂，pH值為5.7～6.0。置于暗培養(yǎng)環(huán)境即培養(yǎng)溫度（25±3）℃、暗培養(yǎng)8～10 d，再置于晝培養(yǎng)環(huán)境即培養(yǎng)溫度（25±3）℃、光照16 h/d、光照度為2 000 lx培養(yǎng)8周后，統(tǒng)計(jì)腋芽數(shù)量。每個(gè)處理組合接種30瓶，重復(fù)3次。最終確定最佳腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為5號(hào)處理，即WPM+0.005 mg/L NAA+2.0 mg/L ZT，誘導(dǎo)率為93%以上。

待腋芽發(fā)出時(shí)，將外植體轉(zhuǎn)到繼代培養(yǎng)基上，用于芽的伸長生長，繼代培養(yǎng)基的配方為：WPM+0.05 mg/L NAA+2.0 mg/L ZT+20 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂，pH值為5.7～6.0。置于晝溫（25±3）℃、光照16 h/d、光照度為2 000 lx培養(yǎng)的條件下培養(yǎng)3周后，腋芽長出2～3 cm高腋芽，同時(shí)剪下腋芽進(jìn)行增殖培養(yǎng)，建立組培體系。

1.3 ? ?多倍體誘導(dǎo)

采用陳冰心[2]的多倍體誘導(dǎo)方法（培養(yǎng)基添加法）并稍作改變，設(shè)秋水仙素的濃度為10、20、30、40、50、60 mg/L，不同濃度下分別處理10、20、30、40、50 d。首先，在無菌條件下切取由葉片再生形成的長勢較好苗的帶葉莖尖（長約0.5 cm），接種到秋水仙素濃度為10、20、30、40、50、60 mg/L的6種培養(yǎng)基中，以不含秋水仙素的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組。在溫度（25±3）℃、光強(qiáng)2 000 lx、光周期16 h光照/8 h黑暗的環(huán)境中，受不同濃度秋水仙素處理的莖尖，每種濃度分別進(jìn)行10、20、30、40、50 d的共培養(yǎng)（即不包括空白對(duì)照有30個(gè)處理），每個(gè)培養(yǎng)瓶中接種7個(gè)左右的莖尖，每個(gè)處理重復(fù)3次。共培養(yǎng)結(jié)束后，在超凈工作臺(tái)上將莖尖取出，接種到不含秋水仙素的WPM培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)期間，每隔10 d觀察1次，并統(tǒng)計(jì)其存活率[13-14]，計(jì)算公式如下：

存活率（%）=（存活個(gè)數(shù)/接種個(gè)數(shù)）×100

經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)，對(duì)比未經(jīng)過秋水仙素處理的植株生長情況，觀察并統(tǒng)計(jì)經(jīng)過秋水仙素共培養(yǎng)處理后出現(xiàn)明顯變異的植株，如具有植株表皮毛較多、葉片更厚、顏色更濃綠、莖桿較為粗壯、分枝能力增強(qiáng)、節(jié)間變短等特征的植株，以便進(jìn)行初步的加倍植株的篩選，統(tǒng)計(jì)變異率[15-16]。計(jì)算公式如下：

變異率（%）=（出現(xiàn)形態(tài)變異的個(gè)數(shù)/接種個(gè)數(shù)）×100

2 ? ?結(jié)果與分析

2.1 ? ?秋水仙素處理濃度和時(shí)間對(duì)兔眼藍(lán)莓外植體存活率和形態(tài)變化的影響

適宜濃度的秋水仙素能夠破壞分裂中期的紡錘絲，導(dǎo)致復(fù)制的染色體不能向兩極移動(dòng)，從而使細(xì)胞中染色體組加倍[2]。

本試驗(yàn)用培養(yǎng)基添加秋水仙素的方法誘導(dǎo)多倍體苗，在誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，處理相同時(shí)間的情況下，秋水仙素濃度越高的苗生長越緩慢，如圖1所示。在10 mg/L秋水仙素處理40 d的培養(yǎng)條件下，幼苗生長較快，莖較細(xì);而在50 mg/L秋水仙素處理50 d的培養(yǎng)條件下，幼苗生長較緩慢，并出現(xiàn)了莖加粗的幼苗。

從表2可以看出，隨著處理濃度的增大，外植體的平均存活率越低，當(dāng)處理濃度為10 mg/L時(shí)，作用效果不明顯，平均存活率為99.42%;當(dāng)處理濃度為60 mg/L時(shí)，平均存活率則只有75.42%。而隨著處理時(shí)間的延長，存活率有下降的趨勢，但是影響效果不是特別明顯。