熊膽粉對運(yùn)動性疲勞大鼠的抗疲勞作用研究

黃春艷 周微 劉金麗 佟雷 王妍 邵麗麗 史嘉翊

【摘要】 目的：分析熊膽粉用于運(yùn)動性疲勞大鼠抗疲勞作用及其作用機(jī)理，旨在為開發(fā)緩解疲勞和提高運(yùn)動能力的系列天然產(chǎn)品提供可靠的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。方法：將50只wistar大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為五組，每組各10只，分別為空白對照組（未給藥未運(yùn)動）、疲勞模型組（未給藥的運(yùn)動大鼠）、高劑量給藥組[2.8 g/（kg·d）熊膽粉]、中劑量給藥組[1.4 g/（kg·d）熊膽粉]、低劑量給藥組[0.7 g/（kg·d）熊膽粉]。空白對照組和疲勞模型組大鼠每日給予相應(yīng)劑量的蒸餾水。末次灌胃給予熊膽粉溶液后，將各組大鼠分別置于段氏實(shí)驗(yàn)跑臺，觀察其初始時(shí)刻狀態(tài)，記錄并對比各組大鼠跑臺運(yùn)動時(shí)間;取血，檢測并對比各組大鼠血清血乳酸（BLA）、尿素氮（BUN）表達(dá)及乳酸脫氫酶（LDH）活力;取血后將大鼠處死，取大鼠肝臟，精密稱取100 mg，另取各實(shí)驗(yàn)組大鼠后肢大腿內(nèi)側(cè)肌肉組織100 mg，檢測并對比其肝糖原（LG）、肌糖原（MG）含量。結(jié)果：五組運(yùn)動大鼠中，高劑量給藥組運(yùn)動時(shí)間>中劑量給藥組>低劑量給藥組>疲勞模型組，組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。五組大鼠中，空白對照組血清BLA、BUN表達(dá)、LDH活力最低，后依次為高劑量給藥組、中劑量給藥組、低劑量給藥組，疲勞模型組最高。血清BLA、BUN表達(dá)五組組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;中劑量給藥組與高劑量給藥組LDH活力比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），其他組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。五組大鼠中，高劑量給藥組大鼠LG、MG表達(dá)均最高，后依次為中劑量給藥組、低劑量給藥組，疲勞模型組表達(dá)均最低;各組MG含量組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;中劑量給藥組與低劑量給藥組LG含量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;其他組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：熊膽粉能夠提高運(yùn)動性疲勞大鼠LDH活力，增加其LG與MG含量，使大鼠BLA含量降低，運(yùn)動耐力大大增強(qiáng)，藥物抗運(yùn)動性疲勞效果理想。

【關(guān)鍵詞】 運(yùn)動性疲勞 熊膽粉 抗疲勞作用

[Abstract] Objective： To analyze the anti-fatigue effect of bear bile powder in rats with exercise-induced fatigue and its mechanism of action， and to provide reliable laboratory basis for the development of a range of natural products that relieve fatigue and improve athletic performance. Method： A total of 50 wistar rats were divided into 5 groups according to random number table， with 10 rats in each group， they were blank control group （without administration and exercise）， fatigue model group （exercised rats were without administration）， high-dose administration group （exercised rats were given 2.8 g/kg Bear Bile Powder）， middle-dose administration group （exercised rats were given 1.4 g/kg Bear Bile Powder）， low-dose administration group （exercised rats were given 0.7 g/kg Bear Bile Powder）. The rats in blank control group and fatigue model group were given same dose of distilled water each day. After the last gavage with Bear Bile Powder solution， each group of rats was placed on the Duans experimental treadmill， the initial time state was observed， and the treadmill running time of each group of rats were recorded and compared. The blood of rats were taken， the blood lactic acid （BLA）， blood urea nitrogen （BUN） expression and lactate dehydrogenase （LDH） activity in each group were detected and compared. After taking the blood， the rats were sacrificed and the liver of the rats were taken. 100 mg inner thigh muscle tissue of the hind limbs of rats were taken， and the contents of liver glycogen （LG） and muscle glycogen （MG） were detected and compared. Result： Among five groups of exercised rats， the exercise time of high-dose administration group was longer than that of middle-dose administration group， low-dose administration group and fatigue model group， and the difference was statistically significant between two groups （P<0.05）. Among five groups of rats， the serum BLA， BUN expression and LDH activity in blank control group were the lowest， followed by high-dose administration group， middle-dose administration group， and low-dose administration group， and fatigue model group was the highest. The statistical analysis found that there was statistical difference in the expression of serum BLA and BUN among five groups （P<0.05）. There was no statistical difference in the LDH activity between middle-dose administration group and high-dose administration group （P>0.05）， but there was statistical difference between other two groups （P<0.05）. Among five groups of rats， the expression of LG and MG were the highest in the high-dose administration group， followed by the middle-dose administration group and low-dose administration group， and the expression of fatigue model group was the lowest. The statistical analysis found that there was significant difference in the content of MG between two groups （P<0.05）; There was no statistical difference in the content of LG between middle-dose administration group and high-dose administration group （P>0.05）， but there was statistical difference between other two groups （P<0.05）. Conclusion： Bear Bile Powder for rats with exercise-induced fatigue can increase LDH activity， increase LG and MG contents， decrease BLA in rats， enhance exercise tolerance， and achieve ideal anti-fatigue effect.

[Key words] Exercise-induced fatigue Bear Bile Powder Anti-fatigue effect

First-authors address： Mudanjiang Medical University， Mudanjiang 157011， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.31.007

運(yùn)動性疲勞是指運(yùn)動導(dǎo)致的肌肉最大輸出功率或最大收縮暫時(shí)性下降的一種生理現(xiàn)象，肌肉運(yùn)動能力下降是其主要標(biāo)志與本質(zhì)特性[1]。隨著現(xiàn)代競技體育發(fā)展，人們運(yùn)動強(qiáng)度越來越大，尤其是青壯年人群，運(yùn)動性疲勞發(fā)生率越來越受人們重視，現(xiàn)已成為運(yùn)動醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究熱點(diǎn)[2]。正常情況下，運(yùn)動性疲勞只是一種生理現(xiàn)象，是機(jī)體的自我保護(hù)，屬于超量恢復(fù)的一個(gè)良性過程。適度的運(yùn)動性疲勞若施以合理干預(yù)，能夠幫助機(jī)體機(jī)能水平恢復(fù)與提高，反之若未及時(shí)恢復(fù)或治療，不斷累積的疲勞會引起過度疲勞導(dǎo)致力竭，生理性的運(yùn)動性疲勞會轉(zhuǎn)變?yōu)椴±硇赃\(yùn)動性疲勞，嚴(yán)重傷害運(yùn)動機(jī)體[3-4]?？梢?，給予運(yùn)動性疲勞患者早期合理治療干預(yù)的重要性。

目前，運(yùn)動性疲勞治療主要方法包括心理療法、藥物療法、物理療法等手段，主要是為了緩解患者運(yùn)動疲勞，提高其機(jī)體運(yùn)動能力，但治療效果均無法達(dá)到預(yù)期[5]。隨著人們對中醫(yī)藥的重視，加之其治療的特性，越來越多的研究證實(shí)，中藥干預(yù)運(yùn)動性疲勞效果理想，且具有安全性[6]。運(yùn)動性疲勞在祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中類似于“勞損”“勞倦”“虛勞”，藥物治療方面有活血行氣藥、補(bǔ)虛藥等[7]。熊膽粉是人工引流熊膽干燥品，現(xiàn)已被國家衛(wèi)生部批準(zhǔn)作為新藥使用，其性寒、味苦，入脾、肝、膽、大腸、胃經(jīng)，具有平肝明目之功。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，熊膽粉化學(xué)成分復(fù)雜，經(jīng)其制作而成的熊膽粉制劑有一定抗疲勞之效，加之該藥能保肝利膽，故可考慮將其運(yùn)用至運(yùn)動性疲勞的治療中[8-9]。但目前并無研究證實(shí)其用于運(yùn)動性疲勞的價(jià)值。本研究通過分析熊膽粉的抗疲勞作用及其作用機(jī)理，旨在為開發(fā)緩解疲勞和提高運(yùn)動能力的系列天然產(chǎn)品提供可靠的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 于2017年10月12日購入50只雄性Wister大鼠，大鼠日齡3～7 d，平均（5.0±2.0）d;體重230～270 g，平均（250.0±20.0）g。隨機(jī)將50只大鼠分為五組，每組各10只，分別為空白對照組、疲勞模型組、高劑量給藥組、中劑量給藥組、低劑量給藥組。各組大鼠常規(guī)分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水，自然光照?？瞻讓φ战M大鼠日齡3～5 d，平均（4.0±1.0）d;體重230～250 g，平均（240.0±10.0）g。疲勞模型組大鼠日齡4～6 d，平均（5.0±1.0）d;體重240～260 g，平均（250.0±10.0）g。高劑量給藥組大鼠日齡3～7 d，平均（5.0±2.0）d;體重230～260 g，平均（245.0±15.0）g。中劑量給藥組日齡3～6 d，平均（5.5±1.5）d;體重230～270 g，平均（250.0±20.0）g。低劑量給藥組大鼠日齡3～5 d，平均（4.0±1.0）d;體重240～260 g，平均（250.0±10.0）d。各組大鼠一般資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法 空白對照組未運(yùn)動。建立疲勞模型大鼠，建模方法：在22～25 ℃的室溫下，將40只需要制備模型的大鼠放置在直徑為150 cm，高為60 cm，水深為40 cm，水溫為25～30 ℃的Morris水迷宮水槽中進(jìn)行游泳訓(xùn)練，在大鼠下腹部掛10 g鉛團(tuán)負(fù)重游泳，每次將同組的大鼠一起放入，以大鼠口鼻被水淹沒7 s中為宜，后撈起。撈起后續(xù)迅速將大鼠吹干。訓(xùn)練時(shí)間：1次/d，6次/周，間隔1 d休息，共訓(xùn)練5周。給藥方法：空白對照組未給藥，疲勞模型組為運(yùn)動大鼠但未給藥，高劑量給藥組給予熊膽粉2.8 g/（kg·d），中劑量給藥組給予熊膽粉1.4 g/（kg·d），低劑量給藥組給予熊膽粉0.7 g/（kg·d），其中空白對照組與疲勞模型組每日給予對應(yīng)劑量的蒸餾水。大鼠跑臺運(yùn)動時(shí)間測定：末次灌胃給予熊膽粉溶液后，將疲勞模型組、高劑量給藥組、中劑量給藥組及低劑量給藥組大鼠分別置于段氏實(shí)驗(yàn)跑臺，觀察大鼠初始時(shí)刻狀態(tài)，此時(shí)大鼠應(yīng)激性表現(xiàn)強(qiáng)烈，經(jīng)過在跑臺的運(yùn)動后，大鼠體現(xiàn)出疲勞狀態(tài)，此時(shí)大鼠應(yīng)激性反應(yīng)與逃避反應(yīng)能力均顯著下降，出現(xiàn)此狀態(tài)后分別記錄各組大鼠跑臺運(yùn)動時(shí)間。全部大鼠給藥干預(yù)觀察時(shí)間均為5周。

1.3 觀察指標(biāo)與檢測方法 （1）運(yùn)動時(shí)間：檢測記錄并對比五組大鼠運(yùn)動時(shí)間，即開始運(yùn)動至力竭時(shí)間。（2）大鼠血清中血乳酸（Blood lactic acid，BLA）、尿素氮（Urea nitrogen，BUN）表達(dá)及乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）活力測定：使用0.25 mL/100 g 3%戊巴比妥鈉腹腔注射，麻醉跑步運(yùn)動后疲勞大鼠，將其固定于解剖臺上，將其腹腔剪開并扒開內(nèi)臟，經(jīng)其腹主動脈采血4 mL，各組大鼠血液樣本經(jīng)2 000 r/min離心后，使用吸管收集上清液，使用Olympus Au400型全自動生化分析儀檢測大鼠BLA、BUN含量;使用深圳晶美生物工程有限公司提供的乳酸脫氫酶試劑盒，經(jīng)分光光度法檢測其表達(dá)。（3）大鼠肝糖原（Liver Glycogen，LG）、肌糖原（Muscle glycogen，MG）貯備量檢測：每只大鼠在完成取血后，將其處死，立即取肝臟與骨骼肌組織各100 mg，使用0.95%冰生理鹽水洗凈，使用濾紙將水分吸干，向內(nèi)投入10%中性福爾馬林溶液固定1～2 d，切片后制作組織切片。使用深圳深圳晶美生物工程有限公司提供的試劑盒檢測大鼠肝臟LG與肌肉MG。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，以（x±s）表示計(jì)量資料，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 五組運(yùn)動大鼠運(yùn)動時(shí)間比較 疲勞模型組、高劑量給藥組、中劑量給藥組、低劑量給藥組運(yùn)動大鼠運(yùn)動時(shí)間分別為（5.26±0.48）、（9.03±0.56）、（8.69±0.71）、（8.12±0.65）min，高劑量給藥組運(yùn)動時(shí)間>中劑量給藥組>低劑量給藥組>疲勞模型組，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=62.229，P<0.001）。

2.2 五組大鼠血清中BLA、BUN表達(dá)及LDH活力比較 五組大鼠中，空白對照組血清BLA、BUN表達(dá)、LDH活力最低，后依次為高劑量給藥組、中劑量給藥組、低劑量給藥組，疲勞模型組最高。血清BLA、BUN表達(dá)五組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;中劑量給藥組與高劑量給藥組LDH活力比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），其他組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.3 五組大鼠LG、MG含量比較 五組大鼠中，高劑量給藥組大鼠LG、MG表達(dá)均最高，后依次為中劑量給藥組、低劑量給藥組，疲勞模型組表達(dá)均最低。各組MG含量組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;中劑量給藥組與低劑量給藥組LG含量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），其他組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

3 討論

運(yùn)動性疲勞是一種常見生理反應(yīng)，可直接影響機(jī)體運(yùn)動水平正常發(fā)揮，影響運(yùn)動性疲勞的因素多樣，其中代謝性產(chǎn)物的堆積帶來的影響最為劇烈，如蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物尿素氮與糖酵解代謝產(chǎn)物乳酸等[4]。

短時(shí)間劇烈運(yùn)動后，受到心肺功能的限制，短時(shí)間內(nèi)無法滿足糖完全氧化需要的氧供，肌肉細(xì)胞將處于缺氧狀態(tài)，此時(shí)主要依靠機(jī)體內(nèi)糖的無氧酵解途徑提供給運(yùn)動需要的能量，乳酸是糖酵解后主要產(chǎn)物，此時(shí)大量的乳酸會堆積于骨骼中，并釋放進(jìn)入血液中，大大增加機(jī)體內(nèi)血乳酸含量[10-11]。機(jī)體在正常的狀態(tài)下，其乳酸的合成分泌及清除是一個(gè)動態(tài)平衡的狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體內(nèi)乳酸的合成分泌量超出清除量時(shí)，大量累積的乳酸將對內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定產(chǎn)生影響，降低機(jī)體運(yùn)動能力，最終誘發(fā)運(yùn)動疲勞[12]。應(yīng)曉明等[13]在2009年的研究中發(fā)現(xiàn)，疲勞大鼠血乳酸表達(dá)顯著高于健康對照組，該研究認(rèn)為乳酸的累積是產(chǎn)生運(yùn)動性疲勞的一大外周機(jī)制。還有研究認(rèn)為，運(yùn)動組大鼠血漿乳酸含量較安靜組大鼠高，減少乳酸堆積后可改善疲勞狀態(tài)[14]。本研究結(jié)果顯示，較空白對照組，疲勞模型組大鼠BLA含量更高，該結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，提示乳酸堆積可能是誘發(fā)運(yùn)動性疲勞的主要機(jī)制，在干預(yù)時(shí)可由此機(jī)制著手。在正常的生理?xiàng)l件下，蛋白質(zhì)基本不參與提供能量，若長時(shí)間劇烈運(yùn)動，將破壞體內(nèi)能量系統(tǒng)，此時(shí)氨基酸與蛋白質(zhì)分解代謝增強(qiáng)，氨將在肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)槟蛩氐?，并向血液?nèi)滲透增加血液內(nèi)尿素氮含量，最終誘發(fā)運(yùn)動性疲勞[15]。本研究結(jié)果顯示，較空白對照組，疲勞模型組大鼠血清BUN水平更高，可見降低機(jī)體尿素氮水平是提高機(jī)體抗運(yùn)動性疲勞的關(guān)鍵所在。肝臟是機(jī)體重要器官，在運(yùn)動期間起到關(guān)鍵作用，肝臟耗氧量在大腦之后，對缺氧敏感度極高。肝臟在機(jī)體處于有氧代謝時(shí)，肝糖原每摩爾會合成并分泌38 mol ATP，但若在無氧代謝情況下，合成并分泌的ATP僅有3 mol，劇烈運(yùn)動會大量消耗掉肝糖原，導(dǎo)致機(jī)體缺氧，此時(shí)肝臟的有氧代謝出現(xiàn)異常，其所需來源主要依賴于肝細(xì)胞無氧酵解，ATP生成降低對機(jī)體運(yùn)動能力產(chǎn)生影響，故誘發(fā)疲勞[16]。

既往開展的物理、藥物治療等干預(yù)手段用于運(yùn)動性疲勞雖有一定效果，但應(yīng)用價(jià)值未能達(dá)到預(yù)期，現(xiàn)有研究認(rèn)為可采取中醫(yī)藥干預(yù)。運(yùn)動性疲勞在中醫(yī)學(xué)中無概念，根據(jù)其臨床表現(xiàn)，現(xiàn)代醫(yī)家將其歸屬于“勞倦”等范疇，認(rèn)為其發(fā)生發(fā)展主要因氣血虧損導(dǎo)致對應(yīng)臟腑生理功能失調(diào)或功能障礙引起，可為其選擇保肝抗疲勞之藥[17]。熊膽是熊科動物棕熊或黑熊的干燥膽囊，熊膽粉作為熊科動物黑熊經(jīng)膽囊手術(shù)引流膽汁而得的干燥品，其性寒、味苦，入肝、膽、脾、大腸、胃經(jīng)，具有平肝、清熱、名目之功，現(xiàn)代藥理學(xué)證實(shí)，熊膽粉化學(xué)成分復(fù)雜，主要有鵝去氧膽酸、熊去氧膽酸、膽酸、去氧膽酸、膽色素、膽固醇等，其中熊去氧膽酸是其重要成分[18]。瞿鳳國[19]發(fā)現(xiàn)，復(fù)方熊膽粉制劑能通過延長爬桿時(shí)間與游泳時(shí)間來提高運(yùn)動耐力，提高肝糖原含量，降低BLA與BUN含量，從而提高乳酸脫氫酶活力，為機(jī)體提供更多能力，增強(qiáng)抗疲勞能力，延緩運(yùn)動性疲勞產(chǎn)生，進(jìn)一步提高機(jī)體對運(yùn)動負(fù)荷適應(yīng)能力?；诖私Y(jié)論，本研究對比分析了不同組別大鼠未使用/使用不同劑量熊膽粉后運(yùn)動各血清學(xué)指標(biāo)水平結(jié)果顯示，疲勞模型組運(yùn)動時(shí)間最短，高劑量給藥組最長，且疲勞模型組血清BLA、BUN表達(dá)最高，LG、MG表達(dá)最低，而其他各組運(yùn)動大鼠在接受不同劑量熊膽粉治療后，血清BLA、BUN表達(dá)降低，LG、MG表達(dá)升高，該結(jié)果與上述研究結(jié)果基本一致，提示熊膽粉可通過降低血清BLA、BUN表達(dá)，提高LG、MG表達(dá)，增強(qiáng)大鼠運(yùn)動耐力與抗運(yùn)動性疲勞能力。

綜上所述，熊膽粉能夠提高運(yùn)動性疲勞大鼠LDH活力，增加其LG與MG含量，使大鼠BLA含量降低，運(yùn)動耐力增強(qiáng)，藥物抗運(yùn)動性疲勞效果理想，為下一步探討熊膽粉對運(yùn)動性疲勞的效果與機(jī)制提供了良好的運(yùn)動性疲勞動物模型。

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（收稿日期：2019-04-29） （本文編輯：周亞杰）