王 杰, 鄭亦舟, 姜 凱, 施凡凡, 袁靜蕓, 王靜彥,趙 渝*, 矯 強(qiáng)

(1.上海師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 植物種質(zhì)資源開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心,上海 200234;2.上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院,上海 201114; 3.上海師范大學(xué)附屬中學(xué),上海 200124;4.貝克曼庫兒特商貿(mào)(中國)有限公司,上海 200235)

0 引 言

流式細(xì)胞術(shù)(FCM)具有檢測速度快,收集數(shù)據(jù)量大,分析全面,方法靈活等特點(diǎn),已經(jīng)成為液體商品生產(chǎn)企業(yè)用來進(jìn)行微生物在線監(jiān)測、產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)控的重要手段[1],也被應(yīng)用于乳制品、飲料、化妝品、制藥等工業(yè)領(lǐng)域[2].相較于傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法[3],FCM所用實(shí)驗(yàn)樣品體積極小,操作方法簡便,檢測結(jié)果一致性較好[4].流式細(xì)胞儀由液流系統(tǒng)、光學(xué)檢測系統(tǒng)、數(shù)據(jù)存儲及分析系統(tǒng)構(gòu)成.進(jìn)行FCM測量時(shí),采用前向和側(cè)向兩種方向的散射光進(jìn)行基本的判定和選擇,前向散射光可以區(qū)別細(xì)胞大小,側(cè)向散射光可以區(qū)分細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度,進(jìn)而初步區(qū)分細(xì)胞與其他非生物顆粒,選出目標(biāo)細(xì)胞群落.但對于大小與細(xì)胞相差不多的干擾顆粒還需借助熒光染料染色,根據(jù)熒光信號進(jìn)一步區(qū)分測試.FCM無需對細(xì)胞進(jìn)行增菌,可直接對單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),能夠檢測活性細(xì)胞的比例以及總菌數(shù),還能對菌種的質(zhì)量進(jìn)行評估[5].本文作者以市售發(fā)酵乳飲料及發(fā)酵乳中的乳酸菌作為研究對象,利用FCM對乳酸菌活菌數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù),并將計(jì)數(shù)結(jié)果與平板計(jì)數(shù)法所得結(jié)果進(jìn)行比對,以期為產(chǎn)品儲藏時(shí)間較短,放行壓力較大的乳制品產(chǎn)業(yè)提供一種可行的檢測方法和手段.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

本實(shí)驗(yàn)所用發(fā)酵乳飲料和發(fā)酵乳均為市售產(chǎn)品,6份發(fā)酵乳樣品分別編號為R1～R6,10份發(fā)酵乳飲料樣品編號為Y1～Y10(為了避免產(chǎn)生影響,此處不列出樣品廠商與型號),重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)中相同濃度的保加利亞乳桿菌懸液分別編號為1～10.

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

核酸染色劑(SYTO?24溶液,碘化丙錠PI):Thermofisher 公司;乳酸菌(MRS)肉湯:Thermofisher 公司;MRS瓊脂:Thermofisher 公司;乳酸鏈球菌瓊脂(M17):青島海博生物技術(shù)有限公司;MC培養(yǎng)基:青島海博生物技術(shù)有限公司;營養(yǎng)肉湯(NB):青島海博生物技術(shù)有限公司.

1.1.3 工作液

將100 mg PI溶于1000 mL超純水,得到質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL-1的PI工作液(PI質(zhì)量分?jǐn)?shù)需控制在0.002%的潛在毒性以下).

將物質(zhì)的量濃度為5 mmol·L-1的SYTO?24溶液用超純水稀釋,得到物質(zhì)的量濃度為0.1 mmol·L-1的SYTO?24工作液;

將9 g NaCl晶體,795 mg Na2HPO4·7H2O,144 mg KH2PO4溶于1000 mL超純水中,調(diào)節(jié)pH值至7.4±0.5,121 ℃下滅菌20 min,得到磷酸緩沖鹽溶液(PBS).

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

流式細(xì)胞儀(CytoFLEXS):貝克曼庫爾特商貿(mào)有限公司;均質(zhì)拍打器 (JT-10):杭州聚同電子有限公司;生物安全柜 (ZHJH-C1109B):上海智城分析儀器制造有限公司;滅菌鍋(LDZF30KBII):上海申安醫(yī)療器械廠;電熱恒溫培養(yǎng)箱 (DHP-9015B):上海一恒科學(xué)儀器有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 FCM的重現(xiàn)性

取保加利亞乳桿菌粉溶解于PBS中配制成相同濃度的菌懸液各100 μL,分別加入5 μL PI工作液和5 μL SYTO?24工作液,在37 ℃下孵育3 min后上機(jī)(流式細(xì)胞儀)檢測,該步驟重復(fù)10次,計(jì)算變異系數(shù)

(1)

其中,S為標(biāo)準(zhǔn)偏差,M為平均數(shù).

1.2.2 樣品前處理

對發(fā)酵乳制品樣品(發(fā)酵乳飲料或發(fā)酵乳)進(jìn)行稀釋后直接上樣,上樣結(jié)果如圖1所示,其中,ASSC為側(cè)向散射光強(qiáng)度,AFSC為前向散射光強(qiáng)度,AFITC為綠色熒光通道熒光強(qiáng)度.在散射光通道,發(fā)酵乳制品中的干擾比較嚴(yán)重,雜質(zhì)顆粒的側(cè)向散射光強(qiáng)度較高,如圖1(a)所示.而在熒光通道,細(xì)菌顆粒和雜質(zhì)顆粒能被很好地區(qū)分,這是因?yàn)殡s質(zhì)顆粒不具備生物活性,所以無法與熒光染料結(jié)合,而細(xì)菌顆粒結(jié)合了熒光染料之后,會發(fā)出特定波長的熒光信號,如圖1(b)所示.因此酵乳制品樣品只需要進(jìn)行稀釋即可上機(jī)檢測.

圖1 發(fā)酵乳制品樣品上樣結(jié)果

1.2.3 乳酸菌的計(jì)數(shù)

分別利用FCM、平板計(jì)數(shù)法對各樣品進(jìn)行計(jì)數(shù),并對比計(jì)數(shù)結(jié)果.

1) FCM.取25 g樣品加入225 mL滅菌PBS緩沖液中,用均質(zhì)拍打器拍打1～2 min,然后進(jìn)行梯度稀釋,取100 μL的稀釋液,加入10 μL的PI工作液和10 μL的SYTO?24工作液,再用滅菌PBS緩沖液定容到1 mL,在37 ℃下避光染色和孵育3 min后,上樣讀取120 s.用流式細(xì)胞儀圈出SYTO陽性,PI陰性區(qū)域作為活菌計(jì)數(shù)群落,讀取所圈門內(nèi)的活菌顆粒數(shù),乘以稀釋倍數(shù),即得到樣品中的活菌顆粒數(shù).每個(gè)樣品做3次平行實(shí)驗(yàn),以其平均數(shù)作為計(jì)數(shù)結(jié)果.

2) 平板計(jì)數(shù)法.取25 g樣品加入225 mL滅菌生理鹽水中,按照菌種的添加量適當(dāng)稀釋后,取1 mL 連續(xù)梯度(2～3個(gè))的稀釋液,加入空的平皿中,倒入15 mL MC培養(yǎng)基,在37 ℃下培養(yǎng)72 h,挑取紅色菌落進(jìn)行計(jì)數(shù),此為嗜熱鏈球菌數(shù).再從上述稀釋液中取1 mL,加入空的平皿,倒入MRS培養(yǎng)基15 mL,在37 ℃下培養(yǎng)72 h并計(jì)數(shù),此為保加利亞乳桿菌數(shù).乳酸菌的總數(shù)為嗜熱鏈球菌菌數(shù)和保加利亞乳桿菌菌數(shù)之和,每個(gè)稀釋度的平皿做2次平行實(shí)驗(yàn),以其平均數(shù)作為計(jì)數(shù)結(jié)果.

2 結(jié)果與分析

2.1 流式細(xì)胞儀的重現(xiàn)性結(jié)果

流式細(xì)胞儀的重現(xiàn)性結(jié)果如表1所示.

表1 流式細(xì)胞儀的重現(xiàn)性結(jié)果

由表1可知,在相同的細(xì)胞濃度和實(shí)驗(yàn)條件下,活性細(xì)菌的變異率為3.46%,非活性細(xì)菌的變異率為3.56%,均在5.00%以內(nèi),具有較好的重現(xiàn)性.

2.2 發(fā)酵乳飲料中FCM與平板計(jì)數(shù)法活菌計(jì)數(shù)對比

市售發(fā)酵乳飲料中活菌用FCM和平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)結(jié)果如表2所示.

表2 市售發(fā)酵乳飲料中活菌用流式細(xì)胞法和平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)結(jié)果

注:-表示產(chǎn)品標(biāo)簽未標(biāo)注,數(shù)據(jù)按照國標(biāo)方法(n=2)計(jì)算得出,最終結(jié)果為2次平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的算術(shù)平均,下同

發(fā)酵乳飲料中添加的都是活菌FCM和平板計(jì)數(shù)法檢測結(jié)果間存在較顯著的相關(guān)性(P=0.9014).

2.3 發(fā)酵乳中FCM與平板計(jì)數(shù)法活菌計(jì)數(shù)對比

市售發(fā)酵乳中活菌用FCM和平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)結(jié)果如表3所示.

表3 市售發(fā)酵乳中活菌用FCM和平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)結(jié)果

發(fā)酵乳樣品中R4、R6、R8 三個(gè)樣品為滅菌型發(fā)酵乳,通過平板計(jì)數(shù)法未檢出菌落,但是用FCM檢出了非活性的菌落群體.而活菌型的發(fā)酵乳產(chǎn)品的各組中,兩種方法的檢測結(jié)果也呈現(xiàn)明顯的相關(guān)性(P=0.9653).

使用FCM和平板計(jì)數(shù)法對發(fā)酵乳制品中的乳酸菌進(jìn)行計(jì)數(shù),比較計(jì)數(shù)結(jié)果,兩者之間呈現(xiàn)明顯的正相關(guān),且流式細(xì)胞術(shù)的計(jì)數(shù)結(jié)果略高于平板計(jì)數(shù)法,其主要原因是FCM是對單個(gè)細(xì)菌顆粒進(jìn)行計(jì)數(shù),而平板計(jì)數(shù)法是對可培養(yǎng)的細(xì)菌形成的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù),理論上FCM的計(jì)數(shù)精確度高于平板計(jì)數(shù)法.

流式細(xì)胞術(shù)是非特異性的檢測方法,在食品生產(chǎn)監(jiān)測中的應(yīng)用越來越廣泛.在本研究的檢測結(jié)果中還包含了除乳酸菌以外的其他細(xì)菌的數(shù)量,雖然乳酸菌的代謝產(chǎn)物——乳酸會抑制一部分微生物的生長,但是不排除有其他耐酸性微生物生長的情況,如何提高檢測的特異性,如何對不同微生物進(jìn)行區(qū)分,還有待進(jìn)一步研究.

3 結(jié) 論

通過染色劑膜透性的差異將發(fā)酵乳及發(fā)酵乳制品中的活性乳酸菌和非活性乳酸菌加以區(qū)分,再經(jīng)過FCM的熒光檢測分別得到活性和非活性乳酸菌的數(shù)量,達(dá)到對發(fā)酵乳制品中活菌進(jìn)行計(jì)數(shù)的目的.將FCM計(jì)數(shù)結(jié)果與平板計(jì)數(shù)法結(jié)果相比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者之間有明顯的正相關(guān)性,說明流式細(xì)胞儀對于細(xì)菌活性判定具有準(zhǔn)確性,可以作為一種對活性乳酸菌快速計(jì)數(shù)的有效方法.該方法克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)法工作量大,培養(yǎng)時(shí)間長,計(jì)數(shù)結(jié)果不穩(wěn)定且只能計(jì)算活菌的缺點(diǎn),為產(chǎn)品儲藏時(shí)間較短,放行壓力較大的乳制品產(chǎn)業(yè)提供了一種快速可行的檢測方法.