分米波治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎抗炎作用的機(jī)制研究

鐘聲 張鐵慧 梁武 任遠(yuǎn)飛 董玉金 楊文峰 尚耀華 徐連春 大連市中心醫(yī)院手足外一科 （遼寧 大連 116033）

內(nèi)容提要： 目的：使用大鼠動(dòng)物模型探討分米波對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。方法：選用雄性SD大鼠48只，隨機(jī)平均分為觀察組和對照組，所有造大鼠右踝關(guān)節(jié)注射尿酸鈉懸液誘導(dǎo)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型，術(shù)后30d內(nèi)觀察組行分米波治療，對照組不行分米波治療。每組動(dòng)物分別于術(shù)后、進(jìn)行大體觀察和關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)評價(jià)，光鏡觀察及ELISA法測定大鼠血清及關(guān)節(jié)液中所含白介素-1β含量以及圖像分析觀測大鼠踝關(guān)節(jié)軟骨組織腫瘤壞死因子-α蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與對照組相比，分米波處理組造模后10d關(guān)節(jié)腫脹有減輕緩解的趨勢，15d關(guān)節(jié)腫脹減輕，關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)有差異（P＜0.05），鏡下見滑膜炎癥減輕，炎細(xì)胞浸潤明顯減少。造模后30d關(guān)節(jié)腫脹顯著減輕（均P＜0.01）。鏡下見滑膜細(xì)胞增生及炎細(xì)胞浸潤明顯減輕，新生小血管及成纖維細(xì)胞增生較少。兩者之間有明顯差異（P＜0.05）。處理組大鼠關(guān)節(jié)液IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)水平明顯低于對照組（P＜0.05）。而血清IL-1β水平兩組無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論：分米波對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎有顯著的抗炎作用，其機(jī)制可能與降低關(guān)節(jié)組織局部的炎癥因子IL-1β和TNF-α水平有關(guān)，為急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的臨床治療提供新方法。

急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是痛風(fēng)典型的表現(xiàn)形式，在就診的痛風(fēng)患者中所占比例最大，患者常反復(fù)發(fā)作，受累關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅、腫、熱、痛，如不積極治療極易致殘、致畸形，嚴(yán)重影響關(guān)節(jié)功能。目前常用的口服藥物副作用多。分米波已用于臨床能有效地促進(jìn)皮膚軟組織、神經(jīng)再生和肌腱愈合，減少了肌腱粘連，改善術(shù)后功能。但其抗炎作用研究較少，本文采用大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型，局部應(yīng)用分米波治療，通過大體觀察和免疫組織化學(xué)檢測方法分析，探討分米波對大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的抗炎作用及其機(jī)制。

1.資料與方法

1.1 一般資料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組：選健康的雄性SD大鼠48只，體重100～130g，隨機(jī)分成2個(gè)組：觀察組和對照組，每組24只。

1.2 方法

選用SD大鼠踝關(guān)節(jié)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型。大鼠均用10%水合氯醛0.3mL/kg腹腔注射麻醉，消毒術(shù)區(qū)，仰臥位固定，穿刺點(diǎn)位于大鼠踝關(guān)節(jié)右外側(cè)、從后方穿刺，當(dāng)有明顯落空感，向其關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入0.2mL尿酸鈉混懸液，誘導(dǎo)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型。觀察組于術(shù)后ld至術(shù)后90d俯臥位雙腿后伸位足爪跖側(cè)用分米波輻射治療，頻率915MHz，功率8W，輻射距離10cm，2次/d，10min/次。對照組于觀察組治療同時(shí)以相同體位同定于相同型號實(shí)驗(yàn)臺，但不行分米波輻射治療。兩組SD大鼠每10d重復(fù)注射注入0.1mL尿酸鈉混懸液維持劑量。

大體形態(tài)觀察：術(shù)前、術(shù)后1、5、15和30d，對大鼠關(guān)節(jié)癥狀進(jìn)行評估。觀察大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度、關(guān)節(jié)功能障礙程度并計(jì)算關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)。關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)的測定：參照文獻(xiàn)[3]進(jìn)行測定。關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)=（測定時(shí)間點(diǎn)關(guān)節(jié)周徑一初始周徑）/初始周徑。測量方法：用細(xì)繩和不銹鋼帶表卡尺測量各組大鼠右后足踝關(guān)節(jié)下0.5mm處的周長值。

組織學(xué)觀察：造模后1、5、15和30d分別切取兩組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜，行HE染色。

ELISA法檢測IL-1β含量：大鼠造模型第30d照射后2h處死，取腹主動(dòng)脈血2mL，3000r/min，離心10min，分離血清，保存、備用。同時(shí)于右后踝關(guān)節(jié)上方0.5cm處剪下大鼠足，暴露足踝關(guān)節(jié)，縱切其連接處，置于5mL生理鹽水中，4?C浸泡過夜，離心留取上清液，按ELISA法檢測試劑盒操作說明書，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定血清和關(guān)節(jié)液IL-1β含量。

踝關(guān)節(jié)滑膜組織TNF-α免疫組織化檢測：大鼠造模型第30d照射后2h處死，取右踝關(guān)節(jié)組織，4%甲醛液固定，脫鈣、脫水，常規(guī)石蠟包埋切片，采用免疫組織化學(xué)二步法染色，檢測關(guān)節(jié)滑膜組織TNF-α蛋白表達(dá)情況。按1:200滴加兔抗大鼠TNF-α抗體，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，光鏡下觀察TNF-α陽性棕黃色顆粒表達(dá)情況；取10個(gè)視野/片，全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)測量每張切片的陽性細(xì)胞（10×40倍）吸光度（A），以積分吸光度（M）代表TNF-α陽性表達(dá)的水平。

1.3 觀察指標(biāo)

分別于術(shù)前、術(shù)后1、5、15、30d大體形態(tài)觀察和術(shù)后5、15、30d組織學(xué)觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)以±s表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用方差分析，同一時(shí)間點(diǎn)組間的比較選用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)的測定

兩組大鼠造模后1d即出現(xiàn)關(guān)節(jié)紅腫，5d時(shí)模型關(guān)節(jié)明顯腫脹，顏色明顯，關(guān)節(jié)炎癥狀顯著。兩組之間關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)無明顯差異（P＞0.05）。見圖1、2。與對照組相比，分米波處理組造模后10d關(guān)節(jié)腫脹有減輕緩解的趨勢，15d關(guān)節(jié)腫脹減輕，關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)有差異（P＜0.05）。見圖3、4，造模后30d關(guān)節(jié)腫脹顯著減輕（均P＜0.01）。見圖5、6，見表1。

圖1. 術(shù)后1d右踝病變表現(xiàn)

圖2. 術(shù)后1d左踝正常表現(xiàn)

圖3. 術(shù)后15d對照組病變表現(xiàn)

圖4. 術(shù)后15d處理組病變表現(xiàn)

圖5. 術(shù)后30d對照組病變表現(xiàn)

圖6. 術(shù)后30d處理組病變表現(xiàn)

2.2 分米波對滑膜組織病理變化的影響

兩組術(shù)后第5d可見大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織疏松，其間有炎細(xì)胞浸潤。兩組無明顯差異。術(shù)后的15d對照組滑膜炎癥明顯，伴大量炎細(xì)胞浸潤，而處理組滑膜炎癥減輕，炎細(xì)胞浸潤明顯減少。兩者之間有明顯差異（P＜0.05）。術(shù)后30d對照組可見大量白細(xì)胞浸潤，同時(shí)可見少量的滑膜細(xì)胞血管內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞增生修復(fù)。與非分米波觀察組相比，滑膜細(xì)胞增生及炎細(xì)胞浸潤明顯減輕，新生小血管及成纖維細(xì)胞增生較少，兩者之間有明顯差異（P＜0.05）。見圖7～12。

2.3 大鼠踝關(guān)節(jié)液和血清IL-1β水平的影響

與非分米波觀察組相比，觀察組大鼠關(guān)節(jié)液IL-1β降低（P＜0.05）。而血清IL-1β水平兩組無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表2。

表1. 造模后兩組大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)的測定結(jié)果(n=24,±s)

表1. 造模后兩組大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)的測定結(jié)果(n=24,±s)

與對照組比較，aP＜0.05；bP＜0.05

造模后時(shí)間1d 5d 10d 15d 30d觀察組 0.120±0.014 0.204±0.014 0.260±0.014 0.300±0.014a 0.341±0.014b對照組 0.118±0.018 0.228±0.018 0.165±0.018 0.080±0.018 0.028±0.024組別

表2. 分米波對大鼠踝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)液和血清中IL-1β水平的影響(n=24,±s,mg/L )

表2. 分米波對大鼠踝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)液和血清中IL-1β水平的影響(n=24,±s,mg/L )

與對照組比較，aP＜0.01

IL-1β血清 關(guān)節(jié)液觀察組 0.120±0.014 0.204±0.014a對照組 0.118±0.018 0.228±0.018組別

圖7. 術(shù)后1d對照組滑膜病變情況（HE染色，×100）

圖8. 術(shù)后1d處理組滑膜病變情況（HE染色，×100）

圖9. 術(shù)后15d對照組滑膜病變情況（HE染色，×100）

圖10. 術(shù)后15d處理組滑膜病變情況（HE染色，×100）

圖11. 術(shù)后30d對照組滑膜病變情況（HE染色，×100）

圖12. 術(shù)后30d處理組滑膜病變情況（HE染色，×100）

2.4 對AGA大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-a蛋白表達(dá)的影響

術(shù)后30d時(shí)，鏡下觀察，處理組軟骨組織中TNF-α蛋白表達(dá)水平明顯低于對照組（P＜0.01）；見圖13，14。其IA值明顯低于對照組（P＜0.01），見表3。

3.討論

反復(fù)炎性損傷是痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎加重和進(jìn)展的主要原因[1-3]?；颊叱７磸?fù)發(fā)作，發(fā)作時(shí)受累關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅、腫、熱、痛?？寡字委熜Ч苯佑绊戧P(guān)節(jié)炎性癥狀的表現(xiàn)。如不積極治療極易致殘、致畸形，嚴(yán)重影響關(guān)節(jié)功能。本實(shí)驗(yàn)以大體和組織學(xué)觀察關(guān)節(jié)炎癥狀，并行關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)的測定作為評價(jià)關(guān)節(jié)炎的指標(biāo)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，分米波處理組造模后5d內(nèi)與對照組無明顯差異，10d關(guān)節(jié)腫脹有減輕緩解的趨勢，15d關(guān)節(jié)腫脹減輕，鏡下滑膜炎癥減輕，炎細(xì)胞浸潤明顯減少。造模后30d關(guān)節(jié)腫脹顯著減輕，接近正常關(guān)節(jié)，鏡下滑膜細(xì)胞增生及炎細(xì)胞浸潤明顯減輕，新生小血管及成纖維細(xì)胞增生較少。分米波處理組術(shù)后15d，30d的均關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)優(yōu)于對照組，說明分米波輻射治療對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)可明顯改善其炎性癥狀，并控制炎性癥狀進(jìn)一步發(fā)展。本試驗(yàn)顯示兩組大鼠于術(shù)后15d出現(xiàn)明顯的大體和組織學(xué)觀測差異，與常規(guī)藥物控制起效時(shí)間要晚，可能與物理治療方式與口服藥物途徑不同有關(guān)。

表3. 分米波對大鼠踝關(guān)節(jié)軟組織TNF-α蛋白表達(dá)影響(n=24,±s)

表3. 分米波對大鼠踝關(guān)節(jié)軟組織TNF-α蛋白表達(dá)影響(n=24,±s)

兩組比較，P＜0.01

組別 IA觀察組 0.23± 00.06對照組 0.40± 00.09

圖13. 術(shù)后30d對照組TNF-a蛋白表達(dá)免疫組化鏡下表達(dá)

圖14. 術(shù)后30d處理組TNF-a蛋白表達(dá)免疫組化鏡下表達(dá)

本試驗(yàn)ELISA檢測結(jié)果顯示，非分米波觀察組大鼠血清中IL-1β水平變化卻不明顯，但足踝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)液IL-1β水平明顯升高。分米波治療后，急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠足踝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)液IL-1β水平顯著降低，表明分米波治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎治療作用的機(jī)制可能是降低關(guān)節(jié)軟組織局部的炎癥因子IL-1β水平。另外本試驗(yàn)結(jié)果顯示，分米波治療后顯著降低急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟組織TNF-α表達(dá)水平，治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的一個(gè)重要機(jī)制可能是分米波降低關(guān)節(jié)軟組織TNF-α水平發(fā)揮抗炎作用[4-7]。

綜上所訴，降低急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)組織局部IL-1β和TNF-α水平，是急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎有效治療的作用方式。