STZ誘導(dǎo)糖尿病裸鼠模型的劑量探討

王涵 薛彬 史建峰 韓倩倩 王春仁 中國(guó)食品藥品檢定研究院 （北京 102629）

內(nèi)容提要： 目的：探討單次鏈脲佐菌素（STZ）腹腔注射制備糖尿病裸鼠模型的適宜濃度。方法：選取雄性裸鼠60只，隨機(jī)分成5個(gè)試驗(yàn)組和對(duì)照組。腹腔注射不同劑量的STZ誘導(dǎo)糖尿病裸鼠模型。注射后3d，7d，14d，21d對(duì)裸鼠體重、血糖進(jìn)行測(cè)量，21d處死動(dòng)物對(duì)胰腺進(jìn)行組織病理學(xué)觀(guān)察及免疫組化染色。結(jié)果：注射劑量為150mg/kg及180mg/kg STZ組裸鼠成模；對(duì)照組、70mg/kg組、100mg/kg組及200mg/kg組未成模。結(jié)論：通過(guò)腹腔一次性注射STZ 150mg/kg及180mg/kg STZ均可有效建立糖尿病裸鼠模型，為該模型的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

胰島素依賴(lài)型糖尿病又名1型糖尿病，是由于胰島β細(xì)胞破壞、功能喪失而導(dǎo)致胰島素絕對(duì)缺乏引起的。糖尿病裸鼠模型在皮膚替代物有效性評(píng)價(jià)、干細(xì)胞研究、胰島功能研究等方面具有非常高的研究?jī)r(jià)值，已在上述領(lǐng)域應(yīng)用[1-4]。STZ注射是最常見(jiàn)的糖尿病裸鼠造模方法，在較高劑量注射時(shí)可誘發(fā)1型糖尿病[5-7]。但目前文獻(xiàn)對(duì)造模的具體細(xì)節(jié)及成模的具體指標(biāo)描述不全面。本研究以裸鼠做為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，探討單次STZ腹腔注射制備糖尿病裸鼠模型的適宜濃度，為該模型的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)[8]。

1.材料與方法

1.1 一般材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)雄性裸鼠，品系BALB/C-nu，體重22～26g，來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2014-0013；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（京）2017-0013。

試劑與儀器：檸檬酸（北京化工廠(chǎng))，檸檬酸三鈉（國(guó)藥集團(tuán))，血糖儀（美國(guó)強(qiáng)生)，血糖試紙（美國(guó)強(qiáng)生），毛細(xì)玻璃管，胰島素抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），兔二步法檢測(cè)試劑盒（北京中山金橋生物技術(shù)有限公司），病理顯微鏡（徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易有限公司）。

1.2 方法

STZ的配制。檸檬酸緩沖液配制：將2.1g檸檬酸加入雙蒸水100mL配成檸檬酸母液（A液）；將2.94g檸檬酸三鈉加入雙蒸水100mL配成檸檬酸母液（B液）；將A、B液按1:1.32比例混合，調(diào)定pH=4.0。將STZ溶于0.1mol/L檸檬酸緩沖液中，新鮮配制10mg/mL濃度的STZ溶液，過(guò)濾除菌。避光保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。

模型制備。將60只雄性裸鼠隨機(jī)分為6組，禁食16h，不禁水。分別以單純檸檬酸緩沖液（對(duì)照組）及STZ 50mg/kg，100mg/kg，150mg/kg，180mg/kg，200mg/kg的劑量進(jìn)行腹腔注射。

1.3 觀(guān)察指標(biāo)

分別于給藥后3d、7d、14d、21d對(duì)動(dòng)物的一般狀況、攝食量、飲水量及動(dòng)物體重進(jìn)行考察；內(nèi)眥取血，進(jìn)行血糖的測(cè)定。給藥后第28d取胰腺進(jìn)行標(biāo)本固定、包埋、常規(guī)HE染色；免疫組化方法進(jìn)行胰島β細(xì)胞胰島素受體特異性染色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以±s表示，行t檢驗(yàn)；P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.結(jié)果

2.1 一般狀況

STZ注射后，對(duì)照組、70mg/kg及100mg/kg組裸鼠狀態(tài)良好；150mg/kg及180mg/kg組動(dòng)物攝食量及飲水量顯著增多，墊料潮濕，身形消瘦；STZ注射后7d，200mg/kg組裸鼠出現(xiàn)不同程度的體溫低、眼分泌物增多，精神萎靡癥狀，注射后14d該組裸鼠均死亡。

2.2 體重變化情況

STZ注射后3、7、14、21d，對(duì)照組動(dòng)物體重穩(wěn)步增長(zhǎng)；70mg/kg及100mg/kg組動(dòng)物體重與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異；150mg/kg、180mg/kg及200mg/kg組動(dòng)物體重與對(duì)照組比較有顯著性差異，體重不升反降，且180mg/kg組體重下降較多，給藥后14d平均體重已下降至20g以下。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1，變化趨勢(shì)見(jiàn)圖1。

2.3 血糖變化情況

STZ注射后3、7、14、21d，對(duì)照組、70mg/kg及100mg/kg組血糖低于16.7mol/L，未達(dá)到裸鼠成模血糖標(biāo)準(zhǔn)。150mg/kg、180mg/kg及200mg/kg組動(dòng)物血糖均高于16.7mol/L，達(dá)到成模標(biāo)準(zhǔn)。見(jiàn)圖2。

圖1. 各組動(dòng)物平均體重變化圖

圖2. 造模后各劑量組血糖變化

圖3. 各組胰腺組織學(xué)觀(guān)察結(jié)果（400×）（注：A.對(duì)照組，B.70mg/kg組，C.100mg/kg組，D.150mg/kg組，E.180mg/kg組）

2.4 HE染色結(jié)果

對(duì)照組及STZ 70mg/kg，100mg/kg組胰島大小不等，胰島細(xì)胞呈團(tuán)簇狀分布，細(xì)胞排列緊密，散在分布于胰腺腺泡內(nèi)。STZ 150mg/kg，180mg/kg組胰島細(xì)胞密度降低，胰島細(xì)胞胞質(zhì)較疏松，胰島和腺泡內(nèi)可見(jiàn)空泡樣改變。見(jiàn)圖3。

表1. 注射STZ后體重變化情況(n=10,±s,g)

表1. 注射STZ后體重變化情況(n=10,±s,g)

注：注射后，對(duì)照組與STZ注射組比較，*P＜0.05，#P＜0.01

組別 造模當(dāng)天 造模后3d 造模后7d 造模后14d 造模后21d對(duì)照組 24.37±0.81 26.05±1.09 26.40±1.63 27.47±1.04 27.50±1.34 70mg/kg組 23.70±1.50 24.30±1.47 23.87±2.83 26.42±2.21 26.93±2.25 100mg/kg組 22.77±1.54 23.33±1.43 23.42±1.89 26.15±1.99 25.77±1.07 150mg/kg組 24.53±1.25 23.72±0.32* 23.60±0.38* 23.16±1.15# 23.80±0.65#180mg/kg組 25.38±1.57 22.03±1.79* 21.03±1.03# 19.32±2.06# 17.38±2.43#200mg/kg組 25.22±0.99 20.63±1.65# 18.03±2.95# 死亡 死亡

圖4. 各組胰島β細(xì)胞破壞免疫組化染色結(jié)果（400×）（注：A.對(duì)照組，B.70mg/kg組，C.100mg/kg組，D.150mg/kg組，E.180mg/kg組）

2.5 免疫組化染色結(jié)果

染色結(jié)果顯示對(duì)照組及STZ 70mg/kg，100mg/kg組免疫組化染色呈陽(yáng)性，B細(xì)胞胞質(zhì)呈深棕色染色；STZ 150mg/kg，180mg/kg組免疫組化著色變淺，部分胞質(zhì)無(wú)著色。見(jiàn)圖4。

3.討論

本研究通過(guò)對(duì)裸鼠腹腔一次性注射STZ，進(jìn)行了一般狀況觀(guān)察、體重及血糖測(cè)定、胰腺組織切片及胰島素受體的免疫組化染色，證實(shí)STZ濃度為150mg/kg及180mg/kg時(shí)能破壞胰島β細(xì)胞，誘導(dǎo)裸鼠的1型糖尿病，但是180mg/kg組裸鼠體重下降較快。STZ腹腔注射影響糖尿病裸鼠成模的因素較多，動(dòng)物品系、性別、禁食時(shí)間、飼養(yǎng)條件不同，STZ配制方法、儲(chǔ)存條件的不同均可導(dǎo)致效果的差異，建議該品系裸鼠STZ腹腔誘導(dǎo)糖尿病裸鼠模型初始劑量定于150～180mg/kg，參照預(yù)試驗(yàn)結(jié)果選擇最終給藥量。誘導(dǎo)成模的動(dòng)物一定要保證有充足的飲水，飼養(yǎng)密度不能太高，及時(shí)更換墊料保證籠內(nèi)清潔[9]。