細(xì)菌生物被膜與游離菌對消毒劑抗性比較研究

張麗蓉 宋金武 黎英文 鄧金花 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司 （廣東 廣州 510663）

內(nèi)容提要： 目的：比較形成生物被膜的細(xì)菌和游離菌對消毒劑的抗性。方法：采用超聲波平板法和載體浸泡定量殺菌試驗(yàn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室觀察。結(jié)果：用含800mg/L的過氧乙酸消毒劑作用1min，對鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌游離菌的平均殺滅率分別為90.53%、87.64%和83.16%，對其細(xì)菌生物被膜的平均殺滅率僅為82.56%、84.81%和82.85%；用含150mg/L的二氧化氯消毒劑作用1min，對鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌游離菌的平均殺滅率分別為96.95%、96.18%和96.05%，對其細(xì)菌生物被膜的平均殺滅率僅為86.37%、89.54%和91.20%。結(jié)論：形成生物被膜的細(xì)菌對消毒劑抗性都比游離菌強(qiáng)，鮑曼不動桿菌差異尤為明顯。

生物被膜是指細(xì)菌黏附于接觸表面，分泌多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂質(zhì)蛋白等，將其自身包繞其中而形成的大量細(xì)菌聚集膜樣物，具有普遍存在，難發(fā)現(xiàn)和難去除等特點(diǎn)。雖然生物被膜是細(xì)菌等微生物存在的主要形式，具有重要的研究意義，但多年來經(jīng)典細(xì)菌學(xué)主要研究的是浮游生長的細(xì)菌，而忽視了對細(xì)菌生物被膜的研究[2]。目前國內(nèi)對生物被膜的研究主要集中在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，對其他相關(guān)領(lǐng)域中的生物被膜研究報(bào)道較少，研究理論基礎(chǔ)相對薄弱[1]。為比較研究醫(yī)學(xué)領(lǐng)域、食品工業(yè)中常見的細(xì)菌生物被膜和游離菌對消毒劑抗性的大小，選擇環(huán)凱牌二氧化氯消毒液和HKM過氧乙酸消毒液作為實(shí)驗(yàn)消毒劑，通過超聲波平板法和載體浸泡定量殺菌試驗(yàn)比較其殺菌效果?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1.材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用消毒劑：環(huán)凱牌二氧化氯消毒液、HKM過氧乙酸消毒液由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司研制。實(shí)驗(yàn)時，用無菌標(biāo)準(zhǔn)硬水配制成不同濃度溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

試驗(yàn)菌為鮑曼不動桿菌（ATCC 19606）、金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853），由廣東省微生物菌種保藏中心提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌生物被膜的培養(yǎng)

用丙酮浸泡不銹鋼片除去表面的油脂，然后把不銹鋼片置于5mol/L鹽酸溶液中浸泡15min，用洗滌劑清洗，再用蒸餾水沖洗干凈，將處理后的不銹鋼片放入含有5mL TSB培養(yǎng)液的試管中，121?C滅菌15min，待用。分別將鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌接種在TSB培養(yǎng)液中37?C培養(yǎng)過夜，18h后使其活菌數(shù)達(dá)108CFU/mL。在含TSB溶液和不銹鋼片的無菌試管中，加入0.1mL上述菌懸液，每隔24h更換1次TSB培養(yǎng)液，于37?C連續(xù)培養(yǎng)7d，即可形成穩(wěn)定生物被膜。

1.2.2游離菌菌懸液

分別將鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌分離培養(yǎng)，取典型菌落接種營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面，培養(yǎng)24h，將新鮮斜面培養(yǎng)物用胰蛋白胨生理鹽水洗下并稀釋成含菌量為1.0×108～5.0×108CFU/mL試驗(yàn)菌懸液。

1.2.3 中和劑鑒定試驗(yàn)

試驗(yàn)菌為鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌，試驗(yàn)設(shè)6組，按照2002版《消毒技術(shù)規(guī)范》中規(guī)定的中和劑鑒定試驗(yàn)程序進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果，以第1組無菌生長或菌數(shù)遠(yuǎn)少于第2組；第2組菌數(shù)超過5CFU/mL；第3、4、5組菌數(shù)為1.0×108～5.0×108CFU/mL，且組間菌落數(shù)誤差小于15%；第6組不長菌，表明所選中和劑及其濃度適宜。試驗(yàn)重復(fù)2次[3]。

1.2.4 載體浸泡定量殺菌實(shí)驗(yàn)

按照2002版《消毒技術(shù)規(guī)范》中規(guī)定的載體浸泡定量殺菌試驗(yàn)程序進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.5 超聲波平板法殺菌試驗(yàn)

將培養(yǎng)7d的不銹鋼片從TSB培養(yǎng)液中取出，經(jīng)無菌PBS清洗后分別放入已稀釋至相應(yīng)濃度的消毒液試管中，待菌藥相互作用至各預(yù)定時間，用無菌鑷子將菌片分別移入裝有5.0mL中和劑的試管中，將上述試管置于超聲波清洗器中，設(shè)定超聲處理溫度為25?C，超聲波功率為95W進(jìn)行超聲震蕩10min。將超聲波處理后的樣液在無菌條件下，取樣（或作適當(dāng)稀釋后，取相應(yīng)稀釋度的稀釋液）1mL，置于滅菌平皿內(nèi)，每管接種兩個平皿，傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，混勻，37?C培養(yǎng)24～48h后進(jìn)行活菌菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算平均殺滅率。試驗(yàn)重復(fù)3次。

陽性對照組：將培養(yǎng)7d的不銹鋼片從TSB培養(yǎng)液中取出，經(jīng)無菌PBS清洗放入裝有5mL PBS的試管中作用至相應(yīng)時間，將上述試管置于超聲波清洗器中，設(shè)定超聲處理溫度為25?C，超聲波功率為95W進(jìn)行超聲震蕩10min。將超聲波處理后的樣液在無菌條件下，取樣（或作適當(dāng)稀釋后，取相應(yīng)稀釋度的稀釋液）1mL，置于滅菌平皿內(nèi)，每管接種兩個平皿，傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，混勻，37?C培養(yǎng)24～48h后進(jìn)行活菌菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算平均殺滅率。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.結(jié)果

2.1 中和劑鑒定試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，用含5g/L硫代硫酸鈉+3g/L卵磷脂+10g/L吐溫80組成的磷酸鹽緩沖液（PBS）作為中和劑，可有效中和環(huán)凱牌二氧化氯消毒液和HKM過氧乙酸消毒液最高試驗(yàn)濃度溶液對鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的殘余作用，且中和劑和中和產(chǎn)物對試驗(yàn)菌及培養(yǎng)基均無影響。見表1。

2.2 殺菌試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 過氧乙酸消毒劑殺菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

用含800mg/L的過氧乙酸消毒劑作用1min，對鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌游離菌的平均殺滅率分別為90.53%、87.64%和83.16%，對其細(xì)菌生物被膜的平均殺滅率分別為82.56%、84.81%和82.85%；含1500mg/L的過氧乙酸消毒劑作用1min，對鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌游離菌的平均殺滅率分別為94.55%、92.36%和90.34%，對其細(xì)菌生物被膜的平均殺滅率分別為88.11%、89.17%和89.17%；含2000mg/L的過氧乙酸消毒劑作用1min，對鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌游離菌的平均殺滅率分別為98.10%、97.05%和96.18%，對其細(xì)菌生物被膜的平均殺滅率分別為93.55%、94.73%和93.18%。見表2。

2.2.2 二氧化氯消毒劑殺菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

含150mg/L的二氧化氯消毒劑作用1min，對鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌游離菌的平均殺滅率分別為96.95%、96.18%和96.05%，對其細(xì)菌生物被膜的平均殺滅率分別為86.37%、89.54%和91.20%；含250mg/L的二氧化氯消毒劑作用1min，對鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌游離菌的平均殺滅率分別為98.03%、97.35%和99.10%，對其細(xì)菌生物被膜的平均殺滅率分別為90.58%、92.17%和95.22%；含400mg/L的二氧化氯消毒劑作用1min，對鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌游離菌的平均殺滅率均為100%，而對其細(xì)菌生物被膜的平均殺滅率僅為96.31%、98.56%和99.45%。見表3。

表1. 中和劑鑒定試驗(yàn)結(jié)果

表2. 過氧乙酸消毒劑殺菌效果

表3. 二氧化氯消毒劑殺菌效果

3.討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，形成生物被膜的細(xì)菌對過氧乙酸和二氧化氯兩種消毒劑抗性都比游離菌強(qiáng)，其中鮑曼不動桿菌差異尤為明顯，這與國內(nèi)相關(guān)研究結(jié)果吻合，國內(nèi)多項(xiàng)研究均表示鮑曼不動桿菌的多重耐藥性與生物被膜的形成有密切關(guān)系[4]。

從理論上講，生物被膜是細(xì)菌在接觸表面生活時采取的生長方式，這是細(xì)菌的一種本能，任何細(xì)菌均有可能形成生物被膜。形成生物被膜的細(xì)菌對消毒劑有很強(qiáng)的抵抗力，也就是醫(yī)學(xué)上常說的“耐藥性”。生物被膜是細(xì)菌在接觸表面形成的高度組織化的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)，其中的EPS（胞外聚合物）起屏障作用，限制抗生素分子向細(xì)菌細(xì)胞運(yùn)輸，多糖蛋白復(fù)合物還可與一些藥物反應(yīng)，具有中和藥物的活性[5]。近年來有研究表明生物被膜中存在許多毛細(xì)管狀的水通道，是一種多孔滲水結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)有利于水和營養(yǎng)物質(zhì)的分散，能將營養(yǎng)物質(zhì)從生物被膜的表面輸送給底部的微生物，同時微生物的代謝產(chǎn)物也能從底部傳送到表面，排出體外。所以生物被膜中微生物其形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理、生化特性及消毒劑的敏感性都與浮游生長的微生物顯著不同，形成生物被膜的細(xì)菌不僅可以抵制消毒劑的作用，也可以對抗外在壓力，如缺水、營養(yǎng)成分缺乏等情況[6]。近年來，細(xì)菌感染日趨嚴(yán)重，而生物被膜作為細(xì)菌耐藥的主要因素，如何防止生物被膜的形成、及時清除已形成的生物被膜，深入研究生物被膜耐藥機(jī)制及相關(guān)調(diào)控基因表達(dá)，也許將成為未來研究細(xì)菌耐藥機(jī)制的熱點(diǎn)。